Stabilität von Proteinen

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1 Stabilität von Proteinen Physiologische Stressbedingungen - extreme Temperaturen ( C) - hydrostatischer Druck (> 1200 bar) - hohe Salzkonzentrationen (> 4 M NaCl) - extreme ph Werte (-1 < ph < 12) Anpassung des Organismus - Ausschließen des Faktors (z.b. Kompartimentierung) - Neutralisierung des Faktors (z.b. Synthese osmotischer Substanzen) - Toleranz (Adaptation) Anpassung auf molekularer Ebene - Thermophilie, Psychrophilie - Barophilie - Halophilie - Acidophilie

2 Denaturierter Zustand von Proteinen Tanford (1968): alle Strukturen, die vom nativen Protein durch die höchste Energiebarriere getrennt sind heute: random coil Größenverteilung eines random coil ÜS Energie U ΔG N Reaktionskoordinate Methoden der Denaturierung - Harnstoff, Guanidin - ph oder Temperatur - Detergenzien Nachweis: Spektroskopie, Aktivität, Viskosität - org. Lösungsmittel

3 Messung eines Denaturierungsüberganges Bestimmung der Harnstoff- bzw Guanidinkonzentration ΔN = Brechungsindex (Guanidin) - Brechungsindex (Puffer)

4 Messung eines Denaturierungsüberganges Fluorescence / CD fraction unfolded fraction unfolded urea (M) urea (M) temperature Voraussetzung für thermodynamische Analyse: - reversibel (gleicher Übergang für N & U aus Ausgangsmaterial) - gleicher Übergang mit unterschiedlichen Methoden

5 Auswertung eines Guanidinüberganges nach 2-Zustandsmodell ΔG = ΔG D + RT lnk (K = F U /F F ) im Gleichgewicht: ΔG = 0 ΔG D = -RT lnk

6 Bestimmung von ΔG unter Standardbedingungen (O M Denaturans, 25 C) Methoden der Extrapolation - Bindungsmodell - Gleichgewichtsmodell nach Tanford - linear 1) Bindungsmodell ΔG D = ΔG(H 2 0) - Δn RT ln(1 + Ka) mit: n = unterschiedliche Anzahl der Bindungsstellen für Denaturans an Protein in N und D K = Bindungskonstante für Denaturans (Gdm = 0.6 M, Harnstoff = 0.1 M) a = chem. Aktivität des Denaturans

7 Extrapolation 2) Gleichgewichtsmodell nach Tanford

8 Transferenergien für Aminosäuren (Lösungsmittel: Wasser / Denaturans)

9 Extrapolation 3) Lineare Extrapolation ΔG D = ΔG(H 2 0) - m [Denaturans] mit: m = Steigung der Geraden häufigste (einfachste) verwendete Methode kein theoretischer Hintergrund Voraussetzung für thermodynamische Analyse: - reversibel (gleicher Übergang für N & U aus Ausgangsmaterial) - 2-Zustandsmodell: N <-> U

10 Denaturierung nach 3-Zustandsmodell α-laktalbumin U I N (o) Tertiärstruktur (Nah UV CD) (Δ) Sekundärstruktur (Fern UV CD) mit Calcium: - 2-Zustandsmodell ohne Calcium: - Tertiär- und Sekundärstruktur verhalten sich unterschiedlich => mindest. 3 Zustände

11 Qualitativer Nachweis des Überganges mit Harnstoff-Gradientengelen

12 Thermische Denaturierung von Proteinen ΔG = ΔG T + RT lnk (K = F U /F F ) im Gleichgewicht: ΔG = 0 ΔG T = -RT lnk T Problem: nichtlineare Abhängigkeit von dg T und Temperatur ==> keine einfache Extrapolation auf 20 (25) C (Standardbedingung)

13 Thermische Denaturierung von Proteinen ΔG = ΔH - TΔS kcal/mol C C C kcal/mol ΔG = G native - G unf C

14 Thermische Denaturierung - Auswertung Berechnung von ΔG T wie bei Gdm-Übergang, aber keine einfache Extrapolation auf 25 C, da Enthalpie und Entropie nicht linear von T abhängen Berechnung von ΔG bei T nach: ΔG(T) = ΔH m (1-T/T m ) - ΔC p [(T m - T) + T ln(t/t m )] erforderliche experimentelle Größen: T m ΔH m ΔC p 1) T m aus Auftragung von ΔG gegen T bekannt ( ΔG(T m ) = 0 ) 2) Berechnung von ΔH m : ΔG(T m ) = 0 = ΔH m - TΔS m Auftragung ΔG gegen T Steigung in T m entspricht ΔS m und ΔH m = T m ΔS m 3) Berechnung von ΔC p : d(δh) / d(t) = ΔC p Messung des Wertepaares ΔH m und T m bei verschiedenen Bedingungen (z.b. ph) (Näherung: ΔC p = 12 cal/mol/deg/residue (Protein 100 aa -> 1200 cal/mol/deg )

15 Thermische Denaturierung - Auswertung - Detaillierte Protokolle zu finden in: Pace and Scholz Measuring the conformational stability of a protein in: Protein Structure, a practical approach 2nd edition, ed.: T.E. Creighton; IRL Press, Oxford pp

16 Thermische Denaturierung Differential Scanning Calorimetry (DSC) Messgrößen: Peakfläche entspr. Enthalpie keine direkte Messung von ΔG, aber ΔG(T) = ΔH m (1 - T/T m ) -ΔC p [(T m - T) + T ln(t/t m )] Peakspitze entspr. T m Differenz der Vor- und Nach- Übergangsbaseline entspr. ΔCp