Userś Manual. Histamine ELISA. Enzyme Immunoassay for the quantitative determination of Histamine in plasma and urine HZ-4005

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1 Userś Manual ELISA Enzyme Immunoassay for the quantitative determination of in plasma and urine HZ

2 Version 6.0 Effective, December 2010 (02-Jul-2010) Please use only the valid version of the package insert provided with the kit. Verwenden Sie nur die jeweils gültige, im Testkit enthaltene, Arbeitsanleitung. Si prega di usare la versione valida dell'inserto del pacco a disposizione con il kit. Por favor, se usa solo la version valida de la metodico técnico incluido aqui en el kit. Table of Contents / Inhaltsverzeichnis / Tabella die Contenuti / Tabla de Contenidos 1 INTENDED USE AND PRINCIPLE OF THE TEST ADVICE ON HANDLING THE TEST STORAGE AND STABILITY CONTENTS OF THE KIT SAMPLE COLLECTION AND STORAGE TEST PROCEDURE CALCULATION OF RESULTS ASSAY CHARACTERISTICS VERWENDUNGSZWECK UND TESTPRINZIP HINWEISE ZUM TEST LAGERUNG UND HALTBARKEIT REAGENZIEN IM KIT PROBENMATERIAL UND LAGERUNG TESTDURCHFÜHRUNG BERECHNUNG DER ERGEBNISSE TESTCHARAKTERISTIKA SYMBOLS USED WITH HÖLZEL ASSAYS Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 1

3 1 INTENDED USE AND PRINCIPLE OF THE TEST Enzyme Immunoassay for the quantitative determination of in plasma and urine. In combination with the supplementary kit ( REF BA E-1100), the assay is performed for the histamine release in heparinized whole blood. First, is quantitatively acylated. The subsequent competitive ELISA kit uses the microtiter plate format. The antigen is bound to the solid phase of the microtiter plate. The acylated standards, controls and samples and the solid phase bound analyte compete for a fixed number of antiserum binding sites. After the system is in equilibrium, free antigen and free antigen-antiserum complexes are removed by washing. The antibody bound to the solid phase is detected by an anti-rabbit IgG-peroxidase conjugate using TMB as a substrate. The reaction is monitored at 450 nm. Quantification of unknown samples is achieved by comparing their absorbance with a reference curve prepared with known standard concentrations. 2 ADVICE ON HANDLING THE TEST 2.1 Reliability of the test results In order to assure a reliable evaluation of the test results it must be conducted according to the instructions included and in accordance with current rules and guidelines (GLP, RILIBÄK, etc.). Special attention must be paid to control checks for precision and correctness during the test; the results of these control checks have to be within the norm range. In case of significant discrepancies between the pre-set assay characteristics of this test and the actual results please contact the manufacturer of the test kit for further instructions. It is recommended that each laboratory establishes its own reference intervals. The values reported in this test instruction are only indicative. The results obtained with this test kit should not be taken as the sole reason for any therapeutic consequence but have to be correlated to other diagnostic tests and clinical observations. 2.2 Complaints In case of complaints please submit to the manufacturer a written report containing all data as to how the test was conducted, the results received and a copy of the original test printout. Please contact the manufacturer to obtain a reclamation form and return it completely filled in to the manufacturer. 2.3 Warranty This test kit was produced according to the latest developments in technology and subjected to stringent internal and external quality control checks. Any alteration of the test kit or the test procedure as well as the usage of reagents from different charges may have a negative influence on the test results and are therefore not covered by warranty. The manufacturer is not liable for damages incurred in transit. 2.4 Disposal Residual substances and/or all remaining chemicals, reagents and ready for use solutions, are special refuse. The disposal is subject to the laws and regulations of the federation and the countries. About the removal of special refuse the responsible authorities or refuse disposal enterprises inform. The disposal of the kit must be made according to the national official regulations. Legal basis for the disposal of special refuse is the cycle economic- and waste law. The appropriate safety data sheets of the individual products are available upon request. The safety data sheets correspond to the standard: ISO Interference Do not mix reagents and solutions from different lots. Consider different transport and storage conditions. Inappropriate handling of test samples or deviations from the test regulation can the results affect. Use no kit components beyond the expiration date. Avoid microbiological contamination of the reagents and the washing water. Consider incubation periods and wash references. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 2

4 2.6 Precautions Observe the incubation periods and washing instructions. Never pipette by mouth and avoid contact of reagents and specimens with skin. No smoking, eating or drinking in areas where samples or kit test tubes are handled. When working with kit components or samples, always wear protective gloves and wash your hand thoroughly as soon as you have finished the work. Avoid spraying of any kind. Avoid any skin contact with reagents. Use protective clothing and disposable gloves. All steps have to be performed according to the protocol. Optimal test results are only obtained when using calibrated pipettes. Sodium azide could react with lead and copper tubes and may form highly explosive metal azide. When clearing up, rinse thoroughly with large volumes of water to prevent such formation. All reagents of this testkit which contain human or animal serum or plasma have been tested and confirmed negative for HIV I/II, HbsAg and HCV by FDA approved procedures. All reagents, however, should be treated as potential biohazards in use and for disposal. 3 STORAGE AND STABILITY Store the reagents at 2-8 C until expiration date. Do not use components beyond the expiry date indicated on the kit labels. 4 CONTENTS OF THE KIT Reaction Plate 1 x 96 Wells ready for use Adhesive Foil 1 x 4 ready for use Wash Buffer Concentrate 1 x 20 ml concentrate, dilute content with dist. water to a final volume of 1000 ml Substrate 1 x 12 ml ready for use, containing a solution of TMB Stop Solution 1 x 12 ml ready for use, containing 0.25 M H 2 SO 4 Standard A 1 x 4 ml ready for use Standard B 1 x 4 ml ready for use Standard C 1 x 4 ml ready for use Standard D 1 x 4 ml ready for use Standard E 1 x 4 ml ready for use Standard F 1 x 4 ml ready for use Antiserum 1 x 12 ml from goat, ready for use Acylation Buffer 1 x 4 ml ready for use Acylation Reagent Microtiter Strips Enzyme Conjugate 4 x 1.25 ml 1 x 96 wells 1 x 12 ml lyophilised Control 1 1 x 4 ml ready for use Control 2 1 x 4 ml ready for use Acylation Diluent 2 x 4 ml ready for use 12 strips, 8 wells each, break apart, pre-coated ready for use, anti-goat IgG conjugated with peroxidase Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 3

5 4.1 Additional materials and equipment required but not provided in the kit Calibrated variable precision micropipettes (e.g µl / µl) Microtiter plate washing device ELISA reader capable of reading absorbance at 450 nm and 620 or 650 nm Shaker (shaking amplitude 3mm; approx. 600 rpm) Absorbent material (paper towel) Distilled water Vortex mixer 5 SAMPLE COLLECTION AND STORAGE Plasma Plasma (EDTA, Heparin) should be used. Haemolytic and especially lipemic samples should not be used with this assay. Storage: up to 6 hours at 2-8 C; for longer periods (up to 6 months) at - 20 C. Repeated freezing and thawing should be avoided. Urine Spontaneous or 24-hour urine, collected in a bottle containing ml of 6 M HCl, may be used. Storage: up to 6 hours at 2-8 C; for longer periods (up to 6 months) at -20 C. Repeated freezing and thawing should be avoided. Avoid exposure to direct sunlight. Whole Blood The histamine release is performed with heparinized whole blood. For further information please refer to the instructions for use of the Release ELISA ( REF BA E-1100). 6 TEST PROCEDURE Allow all reagents and samples to reach room temperature prior to use. The measurement in duplicates is recommended. 6.1 Preparation of reagents Wash Buffer Dilute the 20 ml Wash Buffer Concentrate with distilled water to a final volume of 1000 ml. Store the diluted Wash Buffer Concentrate (Wash Buffer) at 2 8 C. Shelf life: please refer to the expiry date indicated on the kit. Acylation Diluent The Acylation Diluent has a freezing point of 18.5 C. To ensure that the Acylation Diluent is liquid when being used, it must be ensured that the Acylation Diluent has reached room temperature and forms a homogeneous, crystal-free solution before being used. Alternative the Acylation Diluent can be stored at room temperature (20 25 C) separate from the other kit components. Acylation Reagent Reconstitute each vial with 1.25 ml Acylation Diluent. The Acylation Reagent has to be prepared freshly prior to the assay (not longer than 1 hour in advance). If more than 1.25 ml is needed pool the contents of 2 or 3 vials and mix thoroughly. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 4

6 6.2 Sample preparation and acylation 1. Pipette 25 µl of standards, 25 µl of controls, 25 µl of plasma samples, 10 µl of urine samples, or 50 µl of supernatant from the release test* into the respective wells of the Reaction Plate. 2. Add 25 µl of Acylation Buffer to all wells. 3. Add 25 µl of Acylation Reagent to all wells. 4. Incubate for 45 min at RT (20-25 C) on a shaker (approx. 600 rpm). 5. Add 200 µl of distilled water to all wells. 6. Incubate for 15 min. at RT (20-25 C) on a shaker (approx. 600 rpm). Take 25 µl of the prepared standards, controls and samples for the ELISA * For the release test the Release supplementary kit ( REF BA E-1100).has to be used. 6.3 ELISA 1. Pipette 25 µl of the acylated standards, controls and samples into the appropriate wells of the Microtiter Strips. 2. Pipette 100 µl of the Antiserum into all wells and cover plate with Adhesive Foil. 3. Incubate for 3 hours at RT (20-25 C) on a shaker (approx. 600 rpm). Alternatively: shake the Microtiter Strips briefly by hand and incubate for hours at 2 8 C. 4. Remove the foil. Discard or aspirate the contents of the wells and wash each well 4 times thoroughly with 300 µl Wash Buffer. Blot dry by tapping the inverted plate on absorbent material. 5. Pipette 100 µl of the Enzyme Conjugate into all wells. 6. Cover plate with Adhesive Foil and incubate for 30 min at RT (20-25 C) on a shaker (approx. 600 rpm). 7. Remove the foil. Discard or aspirate the contents of the wells and wash each well 4 times thoroughly with 300 µl Wash Buffer. Blot dry by tapping the inverted plate on absorbent material. 8. Pipette 100 µl of the Substrate into all wells and incubate for min at RT (20-25 C) on a shaker (approx. 600 rpm). Avoid exposure to direct sun light! 9. Add 100 µl of the Stop Solution to each well and shake the microtiter plate to ensure a homogeneous distribution of the solution. 10. Read the absorbance of the solution in the wells within 10 minutes, using a microplate reader set to 450 nm with a reference wavelength between 620 nm and 650 nm. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 5

7 OD ELISA HZ CALCULATION OF RESULTS Concentration of the standards Standard A B C D E F (ng/ ml = µg/l) (nmol/l) Conversion: (ng/ ml) x 9 = (nmol/l) The calibration curve is obtained by plotting the absorbance readings (calculate the mean absorbance) of the standards (linear, y-axis) against the corresponding standard concentrations (logarithmic, x-axis). Use a non-linear regression for curve fitting (e.g. spline, 4- parameter, akima). Plasma samples and controls: The concentrations of the plasma samples and the controls can be read directly from the standard curve. Urine samples: The read concentrations of histamine in urine have to be multiplied by 2.5 Calculate the 24 h excretion for each urine sample: µg/24h = µg/l x L/24h 7.1 Quality control It is recommended to use control samples according to state and federal regulations. Use controls at both normal and pathological levels. The kit, or other commercially available, controls should fall within established confidence limits. The confidence limits of the kit controls are printed on the QC-Report. 7.2 Calibration The binding of the antisera and the enzyme conjugates and the activity of the enzyme used are temperature dependent, and the extinction values may vary if a thermostat is not used. The higher the temperature, the higher the extinction values will be. The extinction values also depend on the incubation times. The optimal temperature during the Enzyme Immunoassay is between C. In case of overflow, read the absorbance of the solution in the wells within 10 minutes, using a microplate reader set to 405 nm 7.3 Typical calibration curve 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0, n g / m L Example. Do not use for calculation! Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 6

8 8 ASSAY CHARACTERISTICS Expected Reference Values Plasma Urine 24 h spontaneous < 1 ng/ ml < 45 µg/d < 45 µg/g creatinine Analytical Sensitivity (Limit of Detection) Sensitivity Plasma Sensitivity Urine 0.12 ng/ ml 0.30 ng/ ml Analytical Specificity (Cross Reactivity) Substance Cross Reactivity (%) Methyl- 0.1 Tyramine 0.01 L-Phenylalanine < L-Histidine < L-Tyrosine < Tryptamine < Hydroxy-Indole-Acetic Acid < Serotonin < Precision Intra-Assay Sample Range (ng/ ml) CV (%) Inter-Assay Sample Range (ng/ ml) CV (%) ± ± Urine ± Control samples ± Plasma ± ± Linearity Range Serial dilution up to Range (%) Urine ng/ ml 1: Plasma ng/ ml 1: Recovery Mean (%) Range (%) % Recovery after spiking Urine Plasma Method comparison versus ELISA* * Immunotech ELISA Urine ELISA = 0.9 HÖLZEL 3.1 r = 0.98; n = 29 Plasma ELISA = HÖLZEL 0.4 r = 0.99; n = 47 For actual literature, information about clinical significance or any other information please contact your local supplier. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 7

9 1 VERWENDUNGSZWECK UND TESTPRINZIP Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Histamin in Plasma und Urin In Kombination mit dem Zusatzkit Release ELISA ( BA E-1100), kann der Test zu Bestimmung der Freisetzung von Histamin in heparinisierten Vollblut verwendet werden. Im Verlauf der Probenvorbereitung wird Histamin zu N-Azyl-Histamin umgewandelt. Der sich anschließende kompetetive ELISA basiert auf dem Mikrotiterplattenformat. Das Antigen ist an eine feste Phase gebunden. Die Analytkonzentrationen der Standards, Kontrollen und Proben und die an der festen Phase gebundenen Analytkonzentrationen, konkurrieren um die vorhandenen Bindungsstellen der Antikörper. Wenn das System im Gleichgewicht ist, werden die freien Antigene und die freien Antigen-Antiseren-Komplexe durch Waschen entfernt. Der an der festen Phase gebundene Antigen-Antikörper-Komplex wird mit einem enzymmarkierten Antikörper bestimmt und mit einem Substrat durch eine Farbreaktion nachgewiesen. Die Reaktion wird bei 450 nm gemessen. Die Konzentrationen in den Proben werden mit Hilfe einer Standardkurve ermittelt. 2 HINWEISE ZUM TEST 2.1 Zuverlässigkeit der erhaltenen Messergebnisse Für eine zuverlässige Auswertung der Messergebnisse, muss die beschriebene Testdurchführung eingehalten und nach den geltenden Regeln und Richtlinien (GLP, RILIBÄK, usw.) gearbeitet werden. Insbesondere ist auf eine Mitführung von Präzisions- und Richtigkeitskontrollen zu achten, außerdem müssen die Ergebnisse der Kontrollen im gültigen Bereich liegen. Bei auffälligen Diskrepanzen zwischen den für diesen Test vorgegebenen Assaycharakteristika und den gemessenen Werten ist der Hersteller des Testkits zu Rate zu ziehen. Jedes Labor ist angehalten, seine eigene Normbereiche zu erstellen. Die in dieser Anleitung angegebenen Normbereiche dienen lediglich als Anhaltspunkt. Die mit diesem Testbesteck erzielten Werte dürfen nicht als alleinige Grundlage für therapeutische Maßnahmen genommen werden, sondern müssen mit anderen klinischen Befunden korreliert werden. 2.2 Reklamationen Bei eventuellen Reklamationen, bitte diese schriftlich und zusammen mit allen Angaben zur Testdurchführung, den Ergebnissen und Original-Testausdrucken (in Kopie) beim Hersteller einreichen. Das entsprechende Reklamationsformular kann beim Hersteller angefordert werden. Bitte vollständig ausfüllen! 2.3 Gewährleistung Dieses Testkit wurde gemäß dem aktuellen Stand der Technik produziert und strengen internen und externen Qualitätskontrollen unterworfen. Jede Veränderung des Testkits oder des Testablaufs sowie die Verwendung von Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen kann die Testergebnisse negativ beeinflussen. In diesen Fällen besteht kein Anspruch auf Ersatz. Transportschäden sind von der Haftung durch den Hersteller ausgenommen. 2.4 Entsorgung Reststoffe und/ oder alle nicht verwendeten Chemikalien, Reagenzien und angefertigten Gebrauchslösungen, sind Sonderabfälle. Die Entsorgung unterliegt den Gesetzen und Verordnungen des Bundes und der Länder. Über die Beseitigung von Sonderabfällen informieren die zuständigen Behörden oder Abfallentsorgungsunternehmen. Die Testverpackungen sind nach den gesetzlichen Bestimmungen zu entsorgen. Gesetzliche Grundlage für die Entsorgung von Sonderabfällen ist das Kreislaufwirtschafts- und Abfallgesetz. Die entsprechenden Sicherheitsdatenblätter der einzelnen Produkte stellen wir gerne zur Verfügung. Die Sicherheitsdatenblätter entsprechen der Norm: ISO Interferenzen Reagenzien und Lösungen aus verschiedenen Chargen nicht mischen. Bitte unterschiedliche Transport und Lagerbedingungen beachten Unsachgemäße Handhabung von Testproben oder Abweichungen von der Testvorschrift können die Ergebnisse beeinflussen. Keine Kitkomponenten über das Verfallsdatum hinaus verwenden. Mikrobielle Kontaminationen der Reagenzien und des Waschwassers vermeiden. Inkubationszeiten und Waschhinweise beachten. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 8

10 2.6 Warnhinweise Beachten Sie die Inkubationszeiten und Waschhinweise. Verwenden Sie beim Arbeiten mit den Kitreagenzien oder Proben geeignete Handschuhe und waschen Sie anschließend sorgfältig die Hände. Vermeiden Sie jegliches Spritzen! In den Bereichen, in denen mit Proben oder Kitreagenzien umgegangen wird, ist Essen und Trinken sowie Rauchen untersagt. Nicht mit dem Mund pipettieren! Verwenden Sie keine Kitkomponenten über das Verfallsdatum hinaus. Reagenzien verschiedener Chargen nicht mischen! Vermeiden Sie mikrobielle Kontamination der Reagenzien und des Waschwassers. Vermeiden Sie jegliches Spritzen! Natriumazid kann mit Blei- und Kupferrohrleitungen reagieren und hochexplosive Metallazide bilden. Um dies zu verhindern, muss bei der Entsorgung mit großen Mengen Wasser sorgfältig nachgespült werden. Alle Reagenzien dieses Testbestecks, die humanes Serum oder Plasma enthalten, ergaben bei der Prüfung auf HCV, HBsAG bzw. Antikörper gegen HIV I/II-Virus ein negatives Ergebnis. Trotzdem kann das Vorhandensein solcher infektiöser Erreger nicht mit absoluter Sicherheit ausgeschlossen werden. Die Reagenzien sollten deshalb wie potentiell infektiöses Material behandelt werden. 3 LAGERUNG UND HALTBARKEIT Die Testpackung ist bei 2-8 C bis zum Verfallsdatum aufzubewahren. Das Verfallsdatum sowie die Chargenbezeichnung sind auf jedem Kit angegeben. 4 REAGENZIEN IM KIT Reaction Plate 1 x 96 Wells gebrauchsfertig Adhesive Foil 1 x 4 gebrauchsfertig Wash Buffer Concentrate 1 x 20 ml Konzentriert. Inhalt mit destilliertem Wasser auf 1000 ml Endvolumen verdünnen Substrate 1 x 12 ml gebrauchsfertig, enthält TMB Stop Solution 1 x 12 ml gebrauchsfertig, enthält 0.25 M H 2 SO 4 Standard A 1 x 4 ml gebrauchsfertig Standard B 1 x 4 ml gebrauchsfertig Standard C 1 x 4 ml gebrauchsfertig Standard D 1 x 4 ml gebrauchsfertig Standard E 1 x 4 ml gebrauchsfertig Standard F 1 x 4 ml gebrauchsfertig Antiserum 1 x 12 ml Acylation Buffer 1 x 4 ml gebrauchsfertig Acylation Reagent Microtiter Strips Enzyme Conjugate 4 x 1.25 ml 1 x 96 wells 1 x 12 ml gebrauchsfertig, blau gefärbt, Ziege-anti- N-Azylhistamin lyophillisiert Control 1 1 x 4 ml gebrauchsfertig Control 2 1 x 4 ml gebrauchsfertig Acylation Diluent 2 x 4 ml gebrauchsfertig 12 Streifen, jeweils 8 Kavitäten, einzeln abbrechbar, vorbeschichtet gebrauchsfertig, Anti-Ziege-IgG konjugiert mit Peroxidase Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 9

11 4.1 Nicht im Kit enthaltene erforderliche Geräte und Reagenzien Kalibrierte variable Präzisionspipetten (z.b µl / µl) Waschvorrichtung für Mikrotiterplatten Photometer zur Auswertung von Mikrotiterplatten mit 450 nm-filter Zentrifuge min x g Plattenschüttler (Schüttelhub von 3 mm, ca. 600 rpm) Vortex-Mischer Destilliertes Wasser 5 PROBENMATERIAL UND LAGERUNG Wiederholtes Auftauen und Einfrieren der Proben sollte generell vermieden werden! Plasma EDTA-oder Heparin-Plasma sollte verwendet werden. Hämolytische und insbesondere lipämische Plasmen sollten nicht eingesetzt werden. Lagerung: bis zu 6 Stunden bei 2-8 C, für längere Zeit (bis zu 6 Monate) bei -20 C Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden. Urin Spontan- oder 24 Stunden- Sammelurin (im Sammelbehälter werden zur Stabilisierung des Sammelurins ml 6 M HCl vorgelegt). Direktes Sonnenlicht vermeiden. Lagerung: für längere Zeit (bis zu 6 Monate) bei -20 C Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden. Gesamtblut Zur Bestimmung der Histaminfreisetzung aus heparinisierten Gesamblut wird der Zusatzkit Release ELISA ( BA E-1100) benötigt. 6 TESTDURCHFÜHRUNG Vor dem Gebrauch müssen alle Reagenzien auf Raumtemperatur gebracht werden. Die Durchführung von Doppelbestimmungen wird empfohlen. 6.1 Vorbereitung der Reagenzien Waschpuffer 20 ml Wash Buffer Concentrate mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1000 ml verdünnen. Der gebrauchsfertige Waschpuffer kann bis zu 6 Monate bei 2 8 C gelagert werden. Acylation Diluent Das Acylation Diluent hat einen Gefrierpunkt von 18,5 C. Um sicherzustellen, dass es bei Gebrauch flüssig ist, sollte es getrennt von den übrigen Kitkomponenten bei Raumtemperatur (20-25 C) gelagert werden. Bei Lagerung im Kühlschrank (2-8 C) muss sichergestellt sein, dass es vor der Verwendung Raumtemperatur angenommen hat und eine homogene, kristallfreie Lösung bildet. Acylation Reagent Der Inhalt eines Fläschchens wird mit 1,25 ml Acylation Diluent rekonstituiert. Das Acylation Reagent ist vor jedem Assay frisch vorzubereiten (maximal 1 Stunde vor Testbeginn). Wird mehr als 1.25 ml benötigt müssen die Inhalte von 2 oder 3 Flaschen vereint und gründlich gemischt werden. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 10

12 6.2 Probenvorbereitung und Azylierung 1. Jeweils 25 µl der Standards, 25 µl der Controls (Kontrollen), 25 µl der Plasmaproben, 10 µl der Urinproben oder 50 µl der Überstände aus dem Release Test* in die entsprechenden Kavitäten der Reaction Plate pipettieren µl Acylation Buffer in alle Vertiefungen pipettieren µl Acylation Reagent (siehe 6.1) in alle Vertiefungen pipettieren Minuten bei RT (20-25 C) auf einem Schüttler (ca. 600 rpm) inkubieren µl destilliertes Wasser in alle Vertiefungen pipettieren Minuten bei RT (20-25 C) auf einem Schüttler (ca. 600 rpm) inkubieren. Jeweils 25 µl der vorbereiteten Standards, Kontrollen und Proben werden für den Histamin ELISA benötigt. Zur Bestimmung der Histaminfreisetzung aus heparinisierten Gesamblut wird der Zusatzkit Release ELISA ( BA E-1100) benötigt. 6.3 Histamin ELISA µl der azylierten Standards, Kontrollen und Proben in die entsprechenden Kavitäten der Microtiter Strips pipettieren µl Histamin-Antiserum in alle Kavitäten hinzugeben und Platte mit Adhesive Foil abdecken. 3. Platte und 3 Stunden bei RT (20-25 C) auf einem Plattenschüttler (ca. 600 rpm) inkubieren. Alternativ ohne Schüttler: Platte kurz per Hand schütteln und für Stunden bei 2 8 C inkubieren. 4. Den Inhalt der Kavitäten ausleeren oder absaugen und die Kavitäten 4-mal gründlich mit 300 µl Waschpuffer waschen. Flüssigkeitsreste durch kräftiges Klopfen auf saugfähigem Material aus den Kavitäten entfernen µl Enzyme Conjugate in alle Kavitäten pipettieren. 6. Für 30 Minuten bei RT (20-25 C) auf einem Plattenschüttler (ca. 600 rpm) inkubieren. 7. Den Inhalt der Kavitäten ausleeren oder absaugen und die Kavitäten 4-mal gründlich mit 300 µl Waschpuffer waschen. Flüssigkeitsreste durch kräftiges Klopfen auf saugfähigem Material aus den Kavitäten entfernen µl Substrate in alle Kavitäten pipettieren und für Minuten bei RT (20-25 C) auf einem Plattenschüttler (ca. 600 rpm) inkubieren. Direktes Sonnenlicht vermeiden! µl der Stop Solution in alle Kavitäten pipettieren und die Miktrotiterplatte kurz schütteln. 10. Absorption mit einem Mikrotiterplatten-Reader bei 450 nm (falls vorhanden, gegen eine Referenzwellenlänge von nm) innerhalb von 10 Minuten messen. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 11

13 OD ELISA HZ BERECHNUNG DER ERGEBNISSE Standardkonzentrationen Standard A B C D E F Histamin (ng/ml = µg/l) Histamin (nmol/l) Umrechnung: Histamin (ng/ml) x 9 = Histamin (nmol/l) Eine Standardkurve, mit deren Hilfe die Konzentration der unbekannten Proben ermittelt werden kann, wird durch Auftragen der gemessenen Standard-Extinktionen (linearer Maßstab auf der y-achse) gegen die entsprechenden Standardkonzentrationen (logarithmischer Maßstab auf der x-achse) erstellt. Für die Auswertung wird eine nicht-lineare Regression (z.b.: spline, 4- parameter, akima) empfohlen. Eine Standardkurve, mit deren Hilfe die Konzentration der unbekannten Proben ermittelt werden kann, Plasmaproben und Kontrollen: Die Konzentrationen der Plasmaproben und den Kontrollen können direkt von der Standardkurve abgelesen werden. Urinproben: Die aus der Standardkurve abgelesenen Konzentrationen der Urinproben müssen mit dem Faktor 2,5 multipliziert werden. Die Tagesmenge Histamin, die innerhalb von 24 Stunden im Urin ausgeschieden wird, errechnet sich nach: µg/24 Stunden = µg/l x L/24 Stunden. 7.1 Qualitätskontrolle Es wird empfohlen, mit jeder Testserie entweder die Kitkontrolle oder andere kommerzielle Kontrollproben mitzubestimmen, um die Leistungsfähigkeit des Tests zu überprüfen. Diese Kontrollen müssen dabei wie die unbekannten Proben behandelt werden. Die Kontrollproben müssen dabei innerhalb der angegebenen Bereiche liegen. Die Vertrauensbereiche der Kitkontrollen sind im QC Report aufgeführt. 7.2 Kalibrierung Die Reaktion des Antiserums, Enzymkonjugats und die Aktivität des Enzyms sind temperaturabhängig. Die optimale Temperatur während des Enzymimmunoassay ist zwischen C. Liegt die gemessene Extinktion außerhalb des Messbereichs, so muss innerhalb von 10 Minuten die Absorption mit einem Mikrotiterplatten-Reader bei 405 nm gemessen werden. 7.3 Typische Standardkurve Histamin 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0, n g / m L Beispiel, bitte nicht für die Auswertung verwenden! Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 12

14 8 TESTCHARAKTERISTIKA Erwartete Referenzbereiche Histamin Plasma Urin 24 h spontan < 1 ng/ ml < 45 µg/d < 45 µg/g Kreatinin Analytische Sensitivität (Limit of Detection) Sensitivität Plasma Sensitivität Urine 0.12 ng/ml 0.30 ng/ml Analytische Spezifität (Kreuzreaktion) Substanz Kreuzreaktion (%) Histamin Histamin Methyl-Histamin 0.1 Tyramin 0.01 L-Phenylalanin < L-Histidin < L-Tyrosin < Tryptamin < Hydroxy-Indole-Acetic Acid < Serotonin < Reproduzierbarkeit Intra-Assay Histamin Urin Histamin Plasma Inter-Assay Probe Bereich (ng/ml) CV (%) Probe Bereich (ng/mll) CV (%) ± Histamin ± ± Kontrollproben ± ± ± Linearität Bereich Serielle Verdünnung Bereich (%) Histamin Urin ng/ml 1: Plasma ng/ml 1: Wiederfindung Mittelwert (%) Bereich (%) % Wiederfindung Histamin Urin nach Aufstockung Plasma Methodenvergleich mit ELISA* Histamin Urin ELISA = 0.9 HÖLZEL 3.1 r = 0.98; n = 29 Plasma ELISA = HÖLZEL 0.4 r = 0.99; n = 47 * ELISA Immunotech Aktuelle Literatur und weitere Informationen senden wir auf Anfrage gerne zu. Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 13

15 SYMBOLS USED WITH HÖLZEL ASSAYS RUO Symbol English Deutsch Français Español Italiano Consult instructions for use European Conformity Gebrauchsanweisung beachten CE-Konfirmitätskennzeichnung Consulter les instructions d utilisation Conformité aux normes européennes In vitro diagnostic Usage Diagnostic In-vitro-Diagnostikum device in vitro For research use only Nur für Forschungszwecke Seulement dans le cadre de recherches Consulte las instrucciones de uso Consultare le istruzioni per l uso Conformidad europea Conformità europea Para uso Diagnóstico in vitro Sólo para uso en investigación Per uso Diagnostica in vitro Solo a scopo di ricerca Catalogue number Katalog-Nr. Numéro de catalogue Número de catálogo Numero di Catalogo Lot. No. / Batch code Chargen-Nr. Numéro de lot Número de lote Numero di lotto Contains sufficient for <n> tests/ Ausreichend für n Ansätze Contenu suffisant pour n tests Contenido suficiente para <n> ensayos Contenuto sufficiente per n saggi Storage Temperature Lagerungstemperatur Température de conservation Expiration Date Temperatura de conservación Temperatura di conservazione Mindesthaltbarkeitsdatum Date limite d utilisation Fecha de caducidad Data di scadenza Legal Manufacturer Hersteller Fabricant Fabricante Fabbricante Distributed by Distributor Vertreiber Distributeur Distribuidor Distributore Content Content Inhalt Conditionnement Contenido Contenuto Volume/No. Volume / No. Volumen/Anzahl Volume/Quantité Volumen/Número Volume/Quantità Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 14

16 Ordering Information ELISA HZ-4005 For orders, please contact : Hölzel Diagnostika Handels GmbH Hansaring 10 D Köln Tel.: Fax: info@hoelzel.de For technical advice, please contact: info@hoelzel.de Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, Köln, Germany 15