NOVA Lite TM IgG F-Actin Nur für Export. Nicht zum Verkauf in den USA. Für die in-vitro-diagnostik CLIA-Komplexität: hoch
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- Carsten Scholz
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1 NOVA Lite TM IgG F-Actin Nur für Export. Nicht zum Verkauf in den USA. Für die in-vitro-diagnostik CLIA-Komplexität: hoch Verwendungszweck Der NOVA Lite TM IgG F-Actin ist ein indirekter Immunfluoreszenz-Assay (IFA) auf einem Darmepithelsubstrat aus der Ratte für das Screening und die semiquantitative Bestimmung von Anti-F-Actin-IgG-Antikörpern in menschlichem Serum. Der Nachweis von Anti-F-Actin-IgG- Antikörpern kann in Verbindung mit klinischen Befunden und anderen Labortests bei der Diagnose von autoimmunen Lebererkrankungen wie etwa Autoimmunhepatitis (AIH) und primär-biliärer Leberzirrhose (PBC) behilflich sein. Zusammenfassung und Erklärung des Tests Anti-F-Actin-IgG-Autoantikörper sind der Hauptbestandteil der sogenannten Antikörper gegen glatte Muskulatur (ASMA). 1-6 Diese Antikörper sind bei bis zu 80% der Patienten mit Autoimmunhepatitis (AIH) sowie bei bis zu 30% der Patienten mit primär-biliärer Zirrhose 2,6 zu finden, ebenso wie bei Personen ohne AIH (in der Regel niedrige Titer). ASMA sind heterogen und umfassen Antikörper gegen filamentöse (F) und globuläre (G) Formen von Actin sowie andere Komponenten wie Tubulin und intermediäre Filamente. 3,4,7 Eine Reihe von Autoantikörpern werden mit AIH assoziiert. IgG-Antikörper gegen F-Actin sind die Autoantikörper mit der höchsten Spezifität für AIH. 2,5 F-Actin-IgG-ELISA, wie etwa der QUANTA Lite Actin IgG ELISA, ermöglichen den quantifizierbaren Nachweis von Anti-F-Actin-IgG-Antikörpern bei einer Person, einige Labors bevorzugen jedoch IFA-Verfahren zum Screening auf F-Actin-IgG-Antikörper oder deren Bestätigung im Falle eines Nachweises anhand eines herkömmlichen Nieren-/Magen- /Lebergewebeschnitts aus Nagern. Eine Differenzierung zwischen Anti-F-Actin-Antikörpern und anderen Antikörpern gegen Bestandteile der glatten Muskulatur gestaltet sich oft als schwierig anhand herkömmlicher IFA-Substrate wie Nieren-/Magen-/Lebergewebeschnitte. 2,5 Die Identifizierung von Anti-F-Actin-Antikörpern ist bei der Diagnose von AIH äußerst hilfreich. Derzeit gibt es kein Goldstandard -Verfahren zur Unterscheidung zwischen Anti-F-Actin und 1,2 anderen Reaktivitäten. Objektträger mit Epithelzellen aus Rattendarm, die anhand patentrechtlich geschützter Wachstums- und Fixierverfahren hergestellt wurden, bieten eine neue Substratoption für den Nachweis von Anti-F-Actin-IgG-Antikörpern mittels IFA. Mit diesem Substrat werden einige der Einschränkungen anderer IFA-Verfahren überwunden, da das Anti- F-Actin-IgG-Muster unterschiedlich ist und andere Antikörper, die auf Nieren/-Magen-/Leber- Objektträgern Musterinterferenzen verursachen, auf dem Substrat mit Rattenepithelzellen nicht interferieren. Verfahrensprinzipien Bei der indirekten Immunfluoreszenz werden Proben mit dem Antigensubstrat inkubiert und ungebundene Antikörper durch Waschen entfernt. Das Substrat wird mit einem spezifischen Fluorescein-markierten Konjugat inkubiert und ungebundene Reagenz durch Waschen entfernt. Bei Betrachtung durch ein Fluoreszenzmikroskop weisen die Proben eine apfelgrüne Fluoreszenz auf, die jenen Bereichen entspricht, wo der Autoantikörper gebunden ist. Eine Probe gilt als positiv, wenn sich eine spezifische Färbung der F-Actin-Fasern um den Großteil der Zellen herum in einem hexagonalen Muster und zuweilen der Fasern über Zellen beobachten lässt. Reagenzien 1. F-Actin-Objektträger; 12 Vertiefungen/Objektträger, mit Trockenmittel 2. Anti-Human-IgG-Konjugat (Ziege), Fluorescein-markiert in Puffer mit Evans Blau und 0,09% Natriumazid 3. IgG F-Actin Positivkontrolle, 1 Fläschchen Puffer mit 0,09% Natriumazid und humanen Serumantikörpern gegen F-Actin, vorverdünnt 4. IFA-System Negativkontrolle, 1 Fläschchen Puffer mit 0,09% Natriumazid und nichthumanen Serumantikörpern gegen F-Actin, vorverdünnt 5. PBS-Konzentrat (40-fach) 6. Eindeckmedium, 0,09%Natriumazid 7. Deckgläser 1
2 Warnhinweise 1. Sämtliches Material menschlichen Ursprungs, das für die Zubereitung der Kontrollen für dieses Produkt verwendet wurde, wurde anhand eines von der US-amerikanischen Arzneimittelbehörde FDA zugelassenen Verfahrens auf das Vorhandensein von HIV-, HBsAg- und HCV-Antikörpern getestet und als negativ befunden. Das Vorhandensein von HIV, HBV, HCV bzw. anderen Infektionsträgern kann mit keiner Testmethode vollständig ausgeschlossen werden. Daher sind die IgG F-Actin Positivkontrolle und IFA- System Negativkontrolle als potenziell infektiös zu behandeln Natriumazid wird als Konservierungsmittel verwendet. Natriumazid ist ein Giftstoff und kann bei Verschlucken oder Aufnahme über die Haut bzw. Augen toxische Reaktionen auslösen. Natriumazid kann mit Blei- oder Kupferrohrleitungen reagieren und explosive Metallazide bilden. Spülen Sie nach einer Entsorgung von Reagenzien über den Ausguss mit reichlich Wasser nach, um mögliche Azidablagerungen zu verhindern. 3. Tragen Sie beim Hantieren mit den Reagenzien eine geeignete persönliche Schutzausrüstung. 4. Verschüttete Reagenzien sofort aufwischen. Beachten Sie bei der Abfallentsorgung alle bundes- und/oder landesweiten sowie örtlichen Vorschriften. Vorsichtsmaßnahmen 1. Dieses Produkt ist für die in-vitro-diagnostik vorgesehen. 2. Eine Verwendung anderer Bestandteile als der mit diesem Kit mitgelieferten kann zu widersprüchlichen Ergebnissen führen. 3. Unvollständiges oder nachlässiges Waschen der IFA-Vertiefungen kann zu starkem Hintergrund führen. 4. Wird dieser Test ganz oder teilweise an automatische Proben- oder andere Flüssigkeitsverarbeitungsgeräte adaptiert, so kann dies gegenüber dem manuellen Verfahren zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Es liegt in der Verantwortung eines jeden Labors, die automatische Verarbeitung so zu validieren, dass Testergebnisse innerhalb akzeptabler Bereiche erzielt werden. 5. Das Testergebnis wird von verschiedenen Faktoren beeinflusst. Dazu zählen u.a. die Ausgangstemperatur der Reagenzien, Lichtstärke der Mikroskoplampe, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des Pipettierverfahrens, Gründlichkeit beim Waschen und Dauer der Inkubationszeiten während des Tests. Achten Sie daher unbedingt auf konsistente Bedingungen, um präzise und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. 6. Es empfiehlt sich eine strenge Einhaltung des Protokolls. Lagerung 1. Lagern Sie alle Reagenzien des Kits bei 2-8 C. Nicht einfrieren. Bei vorschriftsmäßiger Lagerung und Handhabung sind die Reagenzien bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. 2. Verdünnter PBS-Puffer ist 4 Woche bei 2-8 C haltbar. Probenentnahme Dieses Testverfahren muss mit einer Serumprobe durchgeführt werden. Eine Zugabe von Azid oder anderen Konservierungsmitteln zu den Testproben kann die Ergebnisse nachteilig beeinflussen. Wärmebehandelte Proben bzw. Proben mit mikrobieller Kontamination, stark hämolysierte oder lipämische Proben mit sichtbaren Partikeln dürfen nicht verwendet werden. Nach der Entnahme Serum vom Gerinnsel trennen. Das Dokument H18-A3 des National Committee on Clinical Laboratory Standards (NCCLS) empfiehlt folgende Lagerungsbedingungen für Proben: 1) Lagern Sie die Proben bei Raumtemperatur bis maximal 8 Stunden. 2) Wird der Test nicht innerhalb von 8 Stunden durchgeführt, ist die Probe bei 2-8 C kühl zu lagern. 3) Wird der Test nicht innerhalb von 48 Stunden durchgeführt bzw. für Transportzwecke ist die Probe bei mindestens -20 C einzufrieren. Eingefrorene Proben müssen nach dem Auftauen und vor dem Testen gut durchgemischt werden. Verfahren Packungsinhalt 5 F-Actin-Objektträger, 12 Vertiefungen 1 Anti-Human-IgG-Konjugat (FITC), 7 ml 1 IgG F-Actin Positivkontrolle, 0,8 ml 1 IFA-System Negativkontrolle, 0,5 ml 2 PBS-Konzentrat (40-fach), 25 ml 2
3 1 Eindeckmedium, 7 ml 1 Packung mit 10 Deckgläsern Zusätzlich benötigtes Material (nicht enthalten) Mikropipetten zum Pipettieren von μl Destilliertes oder deionisiertes Wasser Spritzflaschen oder Pasteurpipetten Feuchtkammer 1L-Behälter (zur Verdünnung der PBS) Coplin-Gefäß Fluoreszenzmikroskop mit 495 nm Erregerfilter und 515 nm Sperrfilter Verfahren Testvorbereitung 1. Lassen Sie alle Reagenzien und Proben Raumtemperatur (20-26 o C) annehmen. 2. Verdünnen Sie das PBS-Konzentrat: BITTE BEACHTEN: Verdünnen Sie das PBS- Konzentrat im Verhältnis 1:40, indem Sie dem gesamten Inhalt der Flasche mit dem PBS-Konzentrat 975 ml destilliertes bzw. deionisiertes Wasser hinzufügen und gut mischen. Der PBS-Puffer wird zur Verdünnung der Patientenproben und als Waschpuffer verwendet. Der verdünnte Puffer kann bis zu 4 Wochen bei 2-8 C gelagert werden. 3. Verdünnen der Patientenproben: a. Erstes Screening: Verdünnen Sie die Patientenproben im Verhältnis 1:40 mit verdünntem PBS-Puffer (d.h. fügen Sie zu 1,95 ml PBS-Puffer 50 μl Serum hinzu). b. Titrierung: Stellen Sie serielle Zweifachverdünnungen aus der Verdünnung des Eingangsscreenings für alle positiven Proben mit verdünntem PBS-Puffer her (d.h. 1:80, 1:160, 1: bis zum Endpunkt). Testablauf 1. Vorbereitung der Substrat-Objektträger: Lassen Sie den Objektträger Raumtemperatur annehmen, bevor Sie ihn aus dem Beutel nehmen. Beschriften Sie den Objektträger mit einem Bleistift und legen Sie ihn in eine geeignete Feuchtkammer. Geben Sie 1 Tropfen (20-25 μl) der unverdünnten positiven und negativen Kontrolle in die Vertiefungen 1 bzw. 2.Geben Sie 1 Tropfen (20-25 μl) der verdünnten Patientenprobe in die restlichen Vertiefungen. 2. Inkubation der Objektträger: Inkubieren Sie den Objektträger 30 ± 5 Minuten lang in einer Feuchtkammer (ein feuchtes Papiertuch flach auf den Boden eines verschlossenen Kunststoff- oder Glasbehälters gelegt sorgt für die richtigen Feuchtigkeitsbedingungen). Lassen Sie das Substrat während des Testablaufs nicht austrocknen! 3. Objektträger waschen: Waschen Sie das Serum nach der Inkubation mithilfe einer Spritzflasche oder Pipette vorsichtig mit verdünntem PBS-Puffer ab. Richten Sie den Objektträger und den PBS-Strahl so aus, dass keine Probe in andere Vertiefungen gelangt. Richten Sie den Strahl niemals direkt auf die Vertiefungen, um eine Beschädigung des Substrats zu vermeiden. Falls gewünscht, können Sie die Objektträger bis zu 5 Minuten in ein Coplin-Gefäß mit verdünntem PBS-Puffer legen. 4. Zugabe des Fluoreszenzkonjugats: Überschüssigen PBS-Puffer ablaufen lassen. Geben Sie den Objektträger zurück in die Feuchtkammer und decken Sie jede Vertiefung sofort mit einem Tropfen Fluoreszenzkonjugat ab. Inkubieren Sie die Objektträger für weitere 30± 5 Minuten. 5. Objektträger waschen: Wiederholen Sie Schritt Deckglas: Jedes Labor hat zwar seine eigene Methode zum Eindecken von Objektträgern, folgendes Verfahren wird jedoch empfohlen: a. Legen Sie das Deckglas auf ein Papiertuch. b. Tragen Sie das Eindeckmedium durchgehend auf den unteren Rand des Deckglases auf. c. Überschüssigen PBS-Puffer ablaufen lassen. Legen Sie den Objektträger mit der unteren Kante zuerst auf das Deckglas auf und senken Sie ihn langsam auf das Deckglas ab, sodass das Eindeckmedium zur oberen Kante des Objektträgers fließt, ohne dass sich Luftblasen bilden bzw. eingeschlossen werden. 3
4 Qualitätskontrolle Die IgG F-Actin Positivkontrolle und IFA-System Negativkontrolle sollten auf jedem Objektträger mitgeführt werden, um sicherzustellen, dass alle Reagenzien und Arbeitsschritte richtig ausgeführt wurden. Geeignete zusätzliche Kontrollseren können mittels Aliquotierung gepoolter Humanserumproben gewonnen und bei < -70 o C gelagert werden. Die Testergebnisse gelten als gültig, wenn alle nachstehend aufgelisteten Kriterien erfüllt wurden. Wurde eines dieser Kriterien nicht erfüllt, so müssen das Testergebnis als ungültig angesehen und der Test wiederholt werden. 1. Die unverdünnte F-Actin-IgG-Antikörper Positivkontrolle muss > 3+ sein. 2. Die IFA-System Negativkontrolle muss negativ sein. Interpretation der Ergebnisse Negative Reaktion: Eine Probe gilt als negativ, wenn die spezifische Färbung (siehe Beschreibung unter Positive Reaktion gleich wie oder weniger als die IFA-System Negativkontrolle ist. Proben können verschiedene Stufen einer spezifischen Färbung bzw. Hintergrundfärbung anderer Zellkomponenten aufweisen, jedoch negativ für Anti-F-Actin-IgG- Antikörper sein. Positive Reaktion: Eine Probe gilt als positiv, wenn sich eine spezifische Färbung mit größerer Intensität als die IFA-System Negativkontrolle auf den F-Actin-Fasern um den Großteil der Zellen herum in einem hexagonalen Muster und zuweilen auf den Fasern über Zellen beobachten lässt. Bestimmen Sie den Grad bzw. die Intensität der Fluoreszenz anhand folgender Kriterien: 4+ Grelle apfelgrüne Fluoreszenz 3+ Helle apfelgrüne Fluoreszenz 2+ Deutlich erkennbare positive Fluoreszenz 1+ Niedrigste spezifische Fluoreszenz, die eine deutliche Differenzierung der F-Actin- Färbung von der Hintergrundfluoreszenz ermöglicht. Auswertung des Musters: Je nach Art und relativer Anzahl der in der Probe vorhandenen Antikörper lassen sich verschiedene Muster nukleärer und/oder zytoplasmatischer Färbung feststellen. Es sollte nur das oben unter Positive Reaktion beschriebene Muster als positiv für Anti-F-Actin-IgG-Antikörper gewertet werden. Alle anderen Muster sind als negativ zu werten. Grenzen des Verfahrens 1. Ein Anti-F-Actin-IgG-Muster mit hohem Titer weist auf AIH hin, sollte jedoch nicht als diagnostisch gewertet werden. Das Anti-F-Actin-IgG-Ergebnis ist gemeinsam mit anderen Laborbefunden sowie der Anamnese des Patienten zu betrachten. 2. Die Testsensitivität wird von einer Reihe externer Faktoren beeinflusst, u.a. die Art des verwendeten Fluoreszenzmikroskops, Stärke und Alter der Lichtquelle, verwendete Vergrößerung, Filtersystem und Erfahrung des Anwenders. 3. Wird anstelle des 515nm-Sperrfilters ein Bandpassfilter verwendet, kommt es möglicherweise zu verstärkter Artefaktbildung. 4. Zur Beschriftung der Objektträger sollte ausschließlich ein Bleistift verwendet werden. Bei Verwendung anderer Schreibutensilien können Artefakte entstehen. 5. Alle zum Waschen der Objektträger verwendeten Coplin-Gefäße müssen frei von jeglichen Farbstoffrückständen sein. Bei Verwendung von Coplin-Gefäßen mit Farbstoffrückständen können Artefakte entstehen. 6. Die Leistungsdaten des Tests wurden ausschließlich für Serum bestimmt und nicht für Plasma oder andere Probenarten. Erwartungswerte Die Eignung des NOVA Lite TM IgG F-Actin für den Nachweis von F-Actin-IgG-Antikörpern wurde anhand des Vergleichs mit dem im Handel erhältlichen QUANTA Lite TM F-Actin IgG ELISA (INOVA Diagnostics, Inc) beurteilt. Die ELISA-Ergebnisse wurden als positiv bestätigt, wenn die Patientenprobe > Einheiten betrug und als negativ, wenn sie < als 20 Einheiten betrug. Normalbereich 493 Proben von normalen Blutspendern wurden mit dem NOVA Lite TM IgG F-Actin getestet. Mit Ausnahme von 4 Proben lieferten alle der 493 normalen Proben (Spezifität 99,2%) ein negatives Ergebnis beim NOVA Lite TM IgG F-Actin. 4
5 Vergleich zwischen dem NOVA Lite TM IgG F-Actin IFA und QUANTA Lite TM F-Actin IgG ELISA Zur Bestimmung der prozentualen positiven und negativen Übereinstimmung der Tests wurden 992 Proben mit Antikörpern gegen verschiedenste Antigene mit dem NOVA Lite TM IgG F-Actin IFA und dem QUANTA Lite TM Actin IgG ELISA getestet. Diese Proben umfassten 493 normale Blutspender, 60 Patienten mit klinisch definierten Erkrankungen (rheumatoide Arthritis, SLE und Sklerodermie), 40 Proben mit definierten Antikörpern (Infektionserkrankungen und Autoantikörper) sowie 399 Proben von Patienten mit Verdacht auf Lebererkrankung. Az=992 QUANTA Lite TM Actin IgG ELISA Positiv QUANTA Lite TM Actin IgG ELISA Negativ Gesamt NOVA Lite IgG F-Actin Positiv ** 290 NOVA Lite IgG F-Actin Negativ 69* Gesamt Positive Übereinstimmung in % 269/338 (80%) Negative Übereinstimmung in % 633/654 (97%) Gesamtübereinstimmung in % 902/992 (91%) *39 der 69 sind schwach-positive ELISA ** 14 der 21 waren 1+ IFA (niedrige Reaktivität) Referenzen 1. Chretien-Leprince P, Ballot E, Andre C, et al. Diagnostic value of anti-f-actin antibodies in a French multicenter study. Ann NY Acad Sci 1050: , Villalta D, Bizzaro N, Da Re M, et al. Diagnostic accuracy of four different immunological methods for the detection of anti-f-actin autoantibodies in type 1 autoimmune hepatitis and other liver related disorders. Autoimmunity 41: , Czaja A, Norman G: Autoantibodies in the diagnosis and management of liver disease. J Clin Gastroenterol 37: , Toh BH. Smooth muscle autoantibodies and autoantigens. Clin exp Immunol 38: , Fusconi M, Cassani F, Zauli D, et al. Anti-actin antibodies: a new test for an old problem. Journal of Immunological Methods 130: 1-8, Granito A, Muratori L, Muratori P, et al. Antibodies to filamentous actin (F-actin) in type 1 autoimmune hepatitis. J Clin Path 59: , Dighiero G, Lymberi P, Monot C. Sera with high levels of anti-smooth muscle and antimitochondrial antibodies frequently bind to cytoskeleton proteins. Clin exp Immunolol 82: 52-56, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. 5
6 Hersteller: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (Domestic) : Technical Service (International) : info@inovadx.com Autorisierter Repräsentant: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: DEU February 2010 Revision 0 6
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