Amtliche Methodensammlung. Echinokokkose. 1. Charakterisierung der Infektion 2. Untersuchungsmaterial 3. Untersuchungsgang

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1 Amtliche Methodensammlung Echinokokkose 1. Charakterisierung der Infektion 2. Untersuchungsmaterial 3. Untersuchungsgang Amtliche Methodensammlung des FLI Stand

2 1. Charakterisierung der Infektion 1.1 Erreger Die Echinokokkose wird durch Zestoden der Gattung Echinococcus hervorgerufen die zystische Echinokokkose durch den Kleinen Hundebandwurm (E. granulosus s. l.) und die alveoläre Echinokokkose durch den Kleinen Fuchsbandwurm (E. multilocularis). E. oligarthrus und E. vogeli kommen in Zentral- und Südamerika vor, Infektionen beim Menschen sind sehr selten. Die Taxonomie des E. granulosus s. l. ist derzeit im Umbruch begriffen. Eine Abgrenzung des früher als Rinderstamm bezeichneten E. ortleppi (Genotyp G5) und des so genannten Pferdestammes E. equinus (Genotyp G4) hat sich inzwischen weitgehend durchgesetzt. Die Gattung Echinococcus ist durch einen obligaten Wirtswechsel charakterisiert, bei dem die geschlechtsreifen, sehr kleinen Bandwürmer im Dünndarm von Endwirten (Fleischfresser, in Europa vor allem Hundeartige, selten Katzen) parasitieren, während sich das Larvenstadium in Organen von Zwischenwirten (meist Nagetiere und Schafe sowie Tiere, die den Endwirten als Nahrung dienen) entwickelt. Der Mensch kann als Fehlwirt von dem Larvenstadium befallen werden. E. granulosus s. l. ist ein 4 bis 7 mm langer Bandwurm (Cestoda) mit häkchenbesetztem Skolex, er besteht typischerweise aus 3 (2 bis 6) Gliedern (Proglottiden). Diese enthalten einen mit seitlichen Aussackungen versehenen Uterus, der in reifem Zustand bis zu Eier beherbergt. Die eigefüllten reifen Endglieder lösen sich vom Wurm ab und werden mit dem Kot ausgeschieden. Nach oraler Aufnahme der Eier durch den Zwischenwirt bilden sich Larven, die in der Regel hämatogen in die Leber, aber auch in die Lunge und sehr selten in andere Organe gelangen und dort verbleiben. Es bildet sich eine Zyste (Hydatide), die einen Durchmesser von einigen Dezimetern erreichen kann. Im Gegensatz zur alveolären Echinokokkose induziert die zystische Echinokokkose die Bildung einer wirtsseitigen Bindegewebskapsel. Die Zystenwand besteht aus mehreren Schichten einer äußeren Bindegewebsschicht, die vom Wirt gebildet wird, einer laminierten Membran (Cuticula) und einer Keimschicht. Aus der Keimschicht entwickeln sich Knospen (Brutkapseln), in denen sich die Protoscolices (Kopfanlagen) entwickeln. E. granulosus ist weltweit verbreitet. In Europa kommt der Parasit vor allem in Mittelmeerländern und auf dem Balkan vor, wo die Schafhaltung von großer Bedeutung ist. Hauptendwirt von E. granulosus ist der Hund, selten die Katze. Nach Fressen von rohen larvenhaltigen Innereien entwickeln sich beim Hund die adulten Bandwürmer. Wiederkäuer (vor allem Schafe) dienen als Zwischenwirt. Sie nehmen die Eier beim Grasen auf kontaminierten Weiden auf. E. multilocularis ist ein 2 bis 4 mm langer Bandwurm (Cestoda), der typischerweise 5 (2 bis 6) Glieder (Proglottiden) aufweist und einen sackförmigen Uterus, der ca. 200 Eier enthält, besitzt. Zwischen- und Fehlwirte infizieren sich durch orale Aufnahme der Eier. Fast stets ist ausschließlich die Leber von der Larve befallen. Im Gegensatz zu E. granulosus bildet sich jedoch keine geschlossene Zyste, sondern es kommt zu einem infiltrativen Wachstum der Larve, vergleichbar mit dem Wachstum eines malignen Tu- 2 Amtliche Methodensammlung des FLI Stand

3 mors. Das Keimepithel bildet Sprossen, die das Lebergewebe durchsetzen. Im natürlichen Zwischenwirt bilden sich zahlreiche Protoscolices (Kopfanlagen) aus, beim Menschen (Fehlwirt) kommt dies nur in Ausnahmefällen vor. E. multilocularis ist nur auf der nördlichen Hemisphäre verbreitet. In Europa gilt insbesondere das Gebiet als hochendemisch, das Süddeutschland (Baden-Württemberg, Bayern), die Nordschweiz, Westösterreich und Ostfrankreich umfasst. Der Großteil der in Deutschland bekannt gewordenen Fälle menschlicher Infektionen stammt aus ländlichen Regionen der südlichen Bundesländer, einzelne Erkrankungen wurden aber auch aus anderen Bundesländern gemeldet. Als Folge der zunehmenden Besiedlung von Städten und bewohnten Gebieten durch Füchse, aber auch durch Infektionen bei Hunden oder Katzen können Eier des Kleinen Fuchsbandwurms auch in das städtische Umfeld des Menschen gelangen. Hauptendwirt für E. multilocularis ist der Fuchs. Die epidemiologische Rolle der vor allem in Ostdeutschland neu etablierten, für den Erreger empfänglichen Marderhundpopulation ist noch offen. Infektionen bei Hunden sind möglich, Katzen scheinen als Wirt eine untergeordnete Bedeutung zu haben, da der Parasit sich in ihrem Darm nur langsam entwickelt und nur wenige Eier produziert. Das Larvenstadium (Metazestode) befällt Nagetiere als Zwischenwirt (z. B. Feld-, Wühlmäuse, Bisamratten) oder auch den Menschen als Fehlwirt. Die Infektion der Endwirte erfolgt durch den Verzehr infizierter Nagetiere. 1.2 Klinische Symptomatik Die Infektionen verlaufen beim Endwirt in der Regel klinisch inapparent. 1.3 Differentialdiagnostik Adulte Echinokokken im Darm können kaum mit anderen Parasiten verwechselt werden. Proglottiden sind von denen anderer Zestoden zu unterscheiden (Bauer, C., 1998). 1.4 Diagnostische Indikation Monitoring, Überwachung 1.5 Zuständige Untersuchungseinrichtung Untersuchungsämter der Länder NRL für Echinokokkose am FLI, Institut für Epidemiologie, Südufer 10, Greifswald-Insel Riems, Tel /7-1892, oder /71522, Amtliche Methodensammlung des FLI Stand

4 1.6 Rechtsgrundlagen Bei der Echinokokkose handelt es sich um eine meldepflichtige Tierkrankheit (Verordnung über meldepflichtige Tierkrankheiten in der Fassung der Bekanntmachung vom ). Gemäß Artikel 4 Absatz 1 bis 3 der Richtlinie 2003/99/EG gehört die Echinokokkose zu den überwachungspflichtigen Zoonosen. 2. Untersuchungsmaterial Für die Untersuchung von Endwirten wird deren Dünndarm benötigt. Aus Gründen der Arbeitssicherheit (Vermeiden von Infektionen mit Echinococcus spp.) werden die zu untersuchenden Tierkörper sowie die Därme von sezierten Tierkörpern für mindestens eine Woche bei -80 C eingefroren. 3. Untersuchungsgang 3.1 Erregernachweis Nachweis adulter Stadien im Darm von Endwirten Intestinal Scraping Technique (IST) Aus Gründen der Arbeitssicherheit (Vermeidung von Infektionen mit Echinococcus spp.) werden die zu untersuchenden Tierkörper sowie die Därme von sezierten Tierkörpern für mindestens eine Woche bei -80 C eingefroren. Das Protokoll der Intestinal Scraping Technique (IST) beruht auf einer von Eckert et al. (1984) beschriebenen Methode. Dabei werden Abstriche der Darmschleimhaut mit Hilfe von Objektträgern gefertigt und mikroskopisch ausgewertet. Mehrere Varianten dieses Protokolls werden genutzt. Eine Evaluierung der hier beschriebenen Variante zur Untersuchung von Füchsen wurde veröffentlicht (Tackmann et al., 2006). Durchführung Entnahme des Darmkonvoluts Auslegen des Dünndarms in drei Teilen gleicher Länge (vorderer, mittlerer und kaudaler Dünndarmabschnitt) Longitudinales Eröffnen des Darmlumens mit Hilfe einer Darmschere und visuelle Untersuchung auf E. multilocularis und andere Helminthen Vorsichtiges Entfernen der groben Anteile des Darminhalts, ohne die Darmschleimhaut zu beeinträchtigen 4 Amtliche Methodensammlung des FLI Stand

5 Entnahme von mindestens 9 Darmschleimhaut-Abstrichen in regelmäßigen Abständen von 5 bis 10 cm in Abhängigkeit von der Gesamtlänge des Dünndarms (kürzere Abstände bei kürzerer Länge des Dünndarms, größere Abstände bei größerer Dünndarmlänge). Entnahme der tiefen Schleimhautabstriche mit Hilfe von Objektträgern. Aufdrücken der Objektträger mit den Schleimhautabstrichen auf quadratische Petrischalen aus Polystyren (Falcon, 100 mm x 100 mm) Untersuchung der kompletten Schleimhautabstriche mit Hilfe eines Stereomikroskops bei 8- bis 50- facher Vergrößerung Dokumentation der Anzahle der in jedem Schleimhautabstrich gefundenen Exemplare von E. multilocularis Literatur BAUER, C., 1998: Praktikum der veterinärmedizinischen Parasitologie. Gießen, ISBN ECKERT, J., GEMMELL, M. A., MATYAS, Z., and E. J. L. SOULSBY, 1984: Guidelines for surveillance, prevention and control of echinococcosis/hydatidosis, 2nd ed. Geneva: WHO, VPH/81.28 Tackmann, K., Mattis, R., Conraths, F.J., 2006: Detection of Echinococcus multilocularis in foxes: evaluation of a protocol of the intestinal scraping technique. J. Vet. Med. B 53, Nachweis von Larvalstadien im Zwischenwirt Histologische Untersuchung von Gewebeproben nach PAS-Färbung (Hotchkis) Lösungen: 10 %iges gepuffertes Formaldehyd: 1350 ml Formaldehyd, 82 g Di-Natriumhydrogenphosphat 12H 2 O (Na 2 HPO 4 12H 2 O), 20 g Na-Dihydrogenphosphat H 2 O (NaH 2 PO 4 H 2 O), mit Aqua bidest auf 5000 ml auffüllen. Perjodsäure: Im Handel erhältlich. SCHIFF'S Reagenz: Im Handel erhältlich. Amtliche Methodensammlung des FLI Stand

6 Hämalaun nach MAYER: 1 g Hämatoxylin in 1000ml Aqua dest lösen, 200 mg Natriumjodat (NaJO 3 ), 50 g Kalialaun unter schütteln lösen. Lösung soll blauviolett sein. 50 g Chloralhydrat, 1 g Zitronensäure zugeben. Der Farbton schlägt nach rotviolett um. Oder 1 g Hämatein in 50 ml Ethanol 96 % erwärmen und lösen, 50 g Kalialaun in 1000 ml bidest. Wasser lösen. Beide Lösungen vereinigen und etwas Thymol zugeben. Durchführung: Gewebestücke (gesundes und makroskopisch verdächtiges Gewebe in einem Stück) in 10 %iges gepuffertes Formaldehyd bringen 1 Teil Gewebe 20 Teile 10 %iges gepuffertes Formaldehyd mindestens 1,5 bis 2 Wochen (besser länger) fixieren lassen (dunkel stellen, öfter bewegen) Gewebe in höchstens 0.5 bis 1 cm dicke Stücke schneiden, in beschriftete Kassetten füllen mindestens 2 Stunden unter fließendem Wasser wässern Proben in Kassetten entwässern (Histokinette) 2x 70 %iges Ethanol ca. 2 h = 4 h 2x 96 %iges Ethanol ca. 2 h = 4 h 2x 99 %iges Ethanol ca. 1 h = 2 h 3x Chloroform oder Toluol ca. 2 h = 6 h 2x Paraffin (reinst) ca. 4 h = 8 h insgesamt 24 h Kassetten in das Kassettenbad des Einbettautomaten bringen Gewebe in Paraffin einbetten Paraffinschnitte anfertigen, trocknen 6 Amtliche Methodensammlung des FLI Stand

7 PAS Färbung nach HOTCHKIS: Schnitte in absteigender alkoholischer Reihe bis zu Aqua bidest. bringen. Perjodsäure 10 min Leitungswasser (fließend) 10 min Aqua bidest kurz spülen SCHIFF'S Reagenz min (muss rot anfärben) Aqua bidest spülen Hämalaun nach MAYER 7 min Leitungswasser 3 x kurz spülen In gesonderten Küvetten in aufsteigender alkoholischer Reihe entwässern: 70 % Ethanol 10 Sek. 80 % Ethanol 1-2 min 95 % Ethanol 3-4 min 99 % Ethanol 5 min 99 % Ethanol 5 min Xylol 5-10 min Xylol 10 min Eindecken Ergebnis: Zellkerne blau, Aldehyde rot mikroskopische Untersuchung auf Larvalstadien ( Metazestoden ) von E. multilocularis Amtliche Methodensammlung des FLI Stand

8 Larvalstadien von Echinococcus multilocularis in der Leber einer Maus, PAS-Färbung n. Hotchkis Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer 10, D Greifswald Insel Riems, 8 Amtliche Methodensammlung des FLI Stand