Hepatitis E Virus (HEV) RNA Nachweis mittels Real Time PCR
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- Friedrich David Boer
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1 LANDESKRANKENHAUS INNSBRUCK - UNIVERSITÄTSKLINIKEN Zentralinstitut für Med.& Chem. Labordiagnostik (ZIMCL) Vorstand: Univ. Prof. Dr. Andrea Griesmacher Molekulare Analytik & Spezielle Serologie Leiter: Ao. Univ. Prof. Dr. Günter Weigel A-6020 Innsbruck, Anichstraße 35 Tel: guenter.weigel@uki.at Internet: Hepatitis E Virus (HEV) RNA Nachweis mittels Real Time PCR Ab sofort bietet das ZIMCL den qualitativen Nachweis von Hepatitis E Virus RNA (Genotypen I - IV) mittels Real Time PCR an. Die Analyse wird im Rahmen der Hepatitis-Stufendiagnostik durchgeführt, wobei auch die gezielte Anforderung insbesondere bei immunkompromittierten Patienten indiziert sein kann, da bei diesem Kollektiv eine Serokonversion häufig ausbleibt. K URZINFO Bedeutung von Hepatitis E Hepatitis E ist eine unterdiagnostizierte virale Infektionskrankheit, der erst in den letzten Jahren eine größere Bedeutung zugesprochen wird. Die steigende Beachtung liegt zum Einen an der Kenntnis neuer, zoonotischer Übertragungswege (Verzehr von infiziertem Schweinefleisch, Wild), welche in Industrienationen eine große Rolle spielen, zum Anderen an den fortschreitenden Entwicklungen in der Diagnostik. Viele Fälle von Hepatitis E verlaufen inapparent und subklinisch. Bei Schwangeren und Patienten mit einer Vorerkrankung der Leber nimmt die Infektion jedoch relativ häufig einen fatalen Verlauf. So liegt bei Schwangeren die Mortalität zwischen 15-25% (besonders im dritten Trimenon). Immunsupprimierte entwickeln in Folge einer Chronifizierung häufig eine Leberzirrhose. Indikation des HEV RNA Nachweises Auf Grund der relativ großen Unsicherheit von serologischen Methoden und wegen des früheren Auftretens im zeitlichen Verlauf stellt der Nachweis von Hepatitis E RNA mehr als nur eine Ergänzung der serologischen Verfahren dar. Dieser Zeitvorteil ist insbesondere bei Patienten mit erhöhtem Risiko für eine fulminante Verlaufsform bedeutend und ist dadurch bedingt, dass die Serokonversion begleitend zur Symptomatik auftritt, während der direkte Erregernachweis schon bis zu zwei Wochen vorher mittels HEV PCR möglich ist. Bei in der Folge von Organtransplantationen immunsupprimierten Patienten besteht bei bis zu 60% die Gefahr eines chronischen Verlaufs der Erkrankung, welcher eine Leberzirrhose zur Folge haben kann. Insbesondere bei immunkompromittierten Patienten (angeborene und erworbene Immunschwächen, therapeutische Immunmodulation) wird der HEV-RNA Nachweis zur Diagnosestellung empfohlen, da dieses Patientenkollektiv häufig keine nachweisbaren Antikörper gegen das Virus bilden kann. Anforderung - 4,5 ml Serumröhrchen (keine Sekundärgefäße, bei Transportzeiten >30min Probenanlieferung bei 4-8 C erforderlich, nicht frieren!) - Online-Ordering: HEV PCR - Anforderung mittels Beleg: im Feld Zusatzanalytik HEV PCR eintragen - Abarbeitung: zweimal wöchentlich bzw. nach Rücksprache - Seite 1 -
2 D ETAILLIERTE I NFORMATION Wissenschaftlicher Hintergrund: Das Hepatitis E Virus ist ein kleines unbehülltes Einzelstrang RNA-Virus und gehört zur Familie der Hepeviridiae. Es existieren vier verschiedene Genotypen, von denen die Typen I und II nur den Menschen infizieren können, während die Typen III und IV neben dem Menschen auch Schweine und andere Säugetiere befallen [1]. Transmission Der hauptsächliche Übertragungsweg der Erkrankung in Entwicklungsländern ist fäko-oral durch kontaminiertes Wasser [1]. Da bei Berufsgruppen, die vermehrt mit Schweinen oder anderen möglichen Wirten des Hepatitis E Virus arbeiten, die Prävalenz für diese Erkrankung im Vergleich zur Normalbevölkerung gesteigert ist, wird davon ausgegangen, dass die Erkrankung auch über diesen Weg zoonotisch erworben werden kann [2, 3]. Daneben gibt es in rezenten Fallstudien auch eindeutige Hinweise dafür, dass Hepatitis E durch den Verzehr von infiziertem Fleisch oder durch Transfusionen übertragen werden kann [4, 5, 6]. Für die Übertragung in Industrienationen sind die letztgenannten Ansteckungsmöglichkeiten wichtig, während die fäko-orale Transmission eine untergeordnete Rolle einnimmt. Bei Dialysepatienten ist das Vorhandensein von Antikörpern gegen das Hepatitis E Virus gegenüber der Normalbevölkerung 1,5 2,5 mal erhöht [7]. Die Übertragung von Hepatitis E durch die Transplantation eines Organs hat eine geringe Bedeutung. Es wurden bisher nur wenige Einzelfälle beschrieben [8]. Abbildung 1 Transmissionswege des Hepatitis E Virus [9]. Krankheitsverlauf und Symptomatik Eine Infektion mit dem Hepatitis E Virus (HEV) verläuft in der Mehrheit der Fälle subklinisch und asymptomatisch, wobei davon auszugehen ist, dass die Erkrankung oft unentdeckt bleibt, da die Haupt-Endemiegebiete in Entwicklungsländern liegen. Der normale zeitliche Verlauf einer unproblematischen Hepatitis E ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Inkubationszeit beträgt zwei bis zu zehn Wochen. Die Virämie und in Folge die Nachweisbarkeit von HE Viren im Blut und anschließend im Stuhl liegen relativ zeitnah (1-2 Wochen) vor der ersten Symptomatik, die sich klinisch durch einen sichtbaren Ikterus (jedoch auch anikterische Verläufe), Übelkeit, Erbrechen, Appetitlosigkeit, Mattigkeit, Abgeschlagenheit, Fieber oder Oberbauchbeschwerden bemerkbar machen kann. Im Blut lassen sich die Viren über ein bis zwei Wochen nachweisen. Die Serokonversion erfolgt meist kurz vor einem Anstieg der Alanin- Aminotransferase (ALT/GPT) und nach Beginn der Symptomatik [1]. - Seite 2 -
3 Abbildung 2 Verlauf einer unkomplizierten Hepatitis E Virus Infektion [1]. Abbildung 3 Verlaufsformen (silent, akut, chronisch) der Hepatitis E Virus Infektion [11]. Abbildung 4 Akute-selbstlimitierende Verlaufsform vs. Chronische Hepatitis E Virus Infektion [11]. Hepatitis E geht mit einer Mortalität von 0,5-4,0% einher. Bei Schwangeren liegt die Mortalität zwischen 15 und 25%, wobei sie mit fortschreitender Schwangerschaft (besonders im dritten Trimenon) zunimmt [10]. Fulminante Verlaufsformen sind auch bei Patienten mit einer schon bestehenden Lebererkrankung zu beobachten [1]. Bei in der Folge von Organtransplantationen immunsupprimierten Patienten besteht bei bis zu 60% die Gefahr eines chronischen Verlaufs der Erkrankung, welcher eine Leberzirrhose zur Folge haben kann [12, 13]. Insbesondere bei diesen Patienten wird in der Literatur der HEV-RNA Nachweis zur Diagnosestellung empfohlen, da dieses Patientenkollektiv häufig keine nachweisbaren Antikörper gegen das Virus bilden kann [14, 15]. Das Gleiche gilt für HIV-positive Patienten [16]. - Seite 3 -
4 Bei Patienten mit einer chronischen Verlaufsform der HEV-Infektion kommt es neben langfristig erhöhten Werten der Transaminasen [11] (bei Patienten mit einer akuten Infektion sinkt die ALT/GPT nach wenigen Wochen wieder ab) zu einer deutlich verzögerten anti-hev Serokonversion, was vermutlich auf eine behandlungsbedingte Abschwächung der humoralen Immunantwort, z.b. durch Mycophenolat Mofetil, mtor Inhibitoren, zurückzuführen ist. Bryan et al. haben gezeigt, dass Antikörper, die gegen das HEV Capsid gerichtet sind, protektiv wirksam gegen eine Infektion mit dem Hepatitis E Virus sind. Somit ist es naheliegend, dass Substanzen, welche die Antikörpersynthese, den Zellzyklus aber auch die Differenzierung von humanen B Lymphozyten hemmen, Infektionen mit dem HE Virus begünstigen bzw. für die verzögerte Serokonversion verantwortlich sind. Bei organtransplantierten Patienten sollte daher auch bei Hepatitiden ohne extrahepatische Manifestationen (Ikterus, neurologische Symptomatik, etc.) an Hepatitis E gedacht werden und gegebenenfalls mittels HEV PCR gezielt getestet werden, da eine Serokonversion bei bis zu 60% dieser Patienten ausbleibt. In einer anderen Studie wurde gezeigt, dass das Risiko für die Chronifizierung einer Hepatitis E Virus Infektion bei der Therapie mit Tacrolimus im Vergleich zu anderen Medikamenten erhöht ist [12]. Diese Beobachtung ist in Übereinstimmung mit einer bereits im Jahr 2008 publizierten, mit Transplantatempfängern durchgeführten Studie von welchen ca. 2/3 eine chronische Verlaufsform von Hepatitis E entwickelten. Diese Patienten zeigten signifikant niedrigere Werte für Gesamtlymphozytenzahlen als auch für die CD2+, CD3+ und CD4+ Subpopulationen, so dass der Verdacht nahe liegt, dass neben der B-Zell-Reaktion auch die T-Zell-Antwort eine bedeutsame Rolle bei der Clearance von HEV spielt [13]. Tabelle 1 Hepatitis E Verlauf von Immunkompetenten im Vergleich zu Immunsupprimierten [11]. Prävention und Therapie Als wichtigste Prävention kann die Einhaltung von hygienischen Vorsichtsmaßnahmen und die Versorgung mit sauberem Trinkwasser angesehen werden. Zukünftig wird ein monoklonaler Antikörper für die Behandlung und eine Schutzimpfung zur Prophylaxe zur Verfügung stehen. Da die Erkrankung in den meisten Fällen einen selbstlimitierenden Verlauf nimmt, ist bei der Mehrheit der Patienten primär keine Therapie notwendig. Bei einer Chronifizierung kann eine Therapie mit pegyliertem Interferon α2a/α2b oder Ribavirin mit einer moderaten Erfolgsaussicht begonnen werden [16]. Zur Überprüfung des Therapieerfolges bei chronifizierten Verläufen steht nur die Detektion von Hepatitis E RNA mittels PCR zur Verfügung. - Seite 4 -
5 Tabelle 1 Behandlungsmöglichkeiten und Outcome bei chronifizierter Hepatitis E [11]. Vorkommen der verschiedenen HEV Genotypen In Entwicklungsländern in tropischen und subtropischen Gebieten ist Hepatitis E die primäre Ursache der durch Wasser übertragenen Hepatitiden. Während in diesen Gebieten Epidemien aufgetreten sind [17-20], wird die Erkrankung in Industrienationen nur sporadisch beobachtet. Derzeit sind 4 Subtypen des Hepatitis E Virus bekannt: Typ 3 des Hepatitis Virus ist in Europa, Russland, Nordamerika, Australien, Neuseeland, Argentinien, Japan und China beheimatet, während Typ 1 in verschiedenen Gebieten Afrikas, Südostasiens, Russlands, Chinas und der Karibik vorkommt. Der Typ 2 existiert in Mexiko und Zentralafrika. Ein Infektionsrisiko für Hepatitis E Typ 4 besteht in Japan, Indonesien und China [1, 16]. Mit der vom ZIMCL angebotenen Analyse werden laut Herstellerangaben alle derzeit bekannten HEV Typen erfasst. Abbildung 5 Endemiegebiete der verschieden HEV Typen [1]. - Seite 5 -
6 Literatur: 1. Aggarwal et al. Hepatitis E. Hepatology 2011; 54: Meng. Prevalence of antibodies to hepatitis E virus in veterinarians working with swine and in normal blood donors in the United States and other countries. J Clin Microbiol 2002; 40(1): Dobreniuc. Hepatitis E virus antibody prevalence among persons who work with swine. J Infect Dis 2001; 184: Tei et al. Zoonotic transmission of hepatitis E virus from deer to human beings. Lancet 2003; 362: Wilhelm et al. A systematic review/meta-analysis of primary research investigating swine, pork or pork products as a source of zoonotic hepatitis E virus. Epidemiol Infect 2011; 139, Boxall et al. Transfusion-transmitted hepatitis E in a nonhyperendemic country. Transfus Med 2006; 16: Mitsui et al. Distinct changing profiles of hepatitis A and E virus infection among patients with acute hepatitis, patients on maintenance hemodialysis and healthy individuals in Japan. J Med Virol 78: Kamar et al. Hepatitis E Virus: What Transplant Physicans should know. Am J Transplant 2012; 12(9) Kamar et al. Hepatitis E. Lancet 2012; 379: Kumar et al. Hepatitis E in pregnancy. Int J Gynecol Obstet 2004; 85: Wedemeyer et al. Pathogenesis and Treatment of hepatitis E infection. Gastroenterology 2012; 142: Kamar et al. Influence of Immunosuppressive therapy on the natural history of genotype 3 hepatitis-e virus infection after organ transplantation. Transplantation 2010; 89: Kamar et al. Hepatitis E virus and chronic Hepatitis in organ-transplant recipients. N Engl J Med 2008; 358: Halleux et al. Hepatitis E virus: an underdiagnosed cause of chronic hepatitis in renal transplant recipients. Transpl Infect Dis 2012: 14: Crum-Cianflone et al. Hepatitis E virus infection in HIV-infected persons. Emerg Infect Dis 2012; 18(3): Mushahwar et al. Hepatitis E virus: Molecular virology, clinical features, diagnosis, transmission, epidemiology, and prevention. J Med Virol 2008; 80: Khuroo et al. Study of an epidemic of non-a, non-b hepatitis: possibility of another human hepatitis virus distinct from post-transfusion non- A, non-b type. Am J Med 1980; 68: Vishwanathan et al. Infectious hepatitis in Delhi ( ): a critical study: epidemiology. Indian J Med Res 1957; 45(1): Naik et al. A large waterborne viral hepatitis E epidemic in Kanpur, India. Bull World Health Organ 1992;70: Zhuang et al. Enterically transmitted non-a, non-b hepatitis in China. In: Shikata T, Purcell RH, Uchida T, eds. Viral hepatitis C, D and E. Amsterdam, 1991: Bryan et al. Epidemic hepatitis E in Pakistan: patterns of serologic response and evidence that the antibody to hepatitis E virus protects against disease. J Infect Dis 1994;170: Indikation für den Hepatitis E RNA Nachweis: Bei klinischem Verdacht und negativer Hepatitis A, B und C Diagnostik stellt Hepatitis E eine wichtige Differentialdiagnose dar. Bei bekannten chronischen Hepatitiden ist die Abklärung einer zusätzlich erworbenen Hepatitis E Infektion ebenfalls sinnvoll. Auf Grund der häufig auftretenden fulminanten und schweren Verläufe ist bei Schwangeren und Immunsupprimierten eine breite Indikation für die HEV Diagnostik zu stellen. Testprinzip: Zunächst erfolgt eine reverse Transkription der Hepatitis E RNA in cdna unter Verwendung Sequenz-spezifischer Primer. Der spezifische HEV Nachweis erfolgt mittels einer grün fluoreszenzmarkierten Sonde (FAM), welche spezifisch für den Open Reading Frame 3 von Hepatitis E aller vier Genotypen ist. Als interne Kontrolle dient ein zugesetztes RNA-Fragment, dessen korrekte reverse Transkription und Amplifikation mittels einer gelb (HEX) markierten Sonde überprüft wird. Um eine fehlerhafte Extraktion ausschließen zu können und die Extraktionseffizienz zu überwachen, werden im ZIMCL Lyse- und Extraktionsschritt durch Zusatz einer zusätzlichen Kontrolle überwacht, welche mit Hilfe einer grünen Sonde (FAM) in einem separaten Ansatz detektiert wird. Eine weitere Differenzierung zwischen den Hepatitis E Typen ist mit der eingesetzten Methode nicht möglich. Je nach Extraktionseffizienz liegt die vom Hersteller angegebene Nachweisgrenze bei 5-50 genomic copies/reaktion, welche in der ZIMCL-internen Verifizierung des Verfahrens unter Verwendung des WHO HEV RNA Standards bestätigt werden konnte. Der im ZIMCL verifizierte Assay wird vom französischen Referenzzentrum für Hepatitis E eingesetzt und für die Patientendiagnostik empfohlen (National Reference Center for Hepatitis A and E, APHP, Paul Brousse Hospital, Department of Virology, Villejuif, France). - Seite 6 -
7 Abbildung 5 Genomische Organisation des Hepatitis E Virus inklusive der 3 Open reading frames [11]. Probenmaterial: Ein 4,5 ml Serumröhrchen (keine Annahme von Sekundärgefäßen!). Bei längeren Transportzeiten (>30 min) ist die Probenanlieferung bei 4-8 C erforderlich, nicht frieren. Anforderung: Bei Anforderung mittels Beleg im Feld Zusatzanalytik HEV PCR eintragen oder online unter HEV PCR anfordern. Bei Rückfragen: Tel.: (Isabella Staubmann), (Dr. Würtinger), (Prof. Weigel) Dauer der Untersuchung: Die Abarbeitung erfolgt zweimal wöchentlich bzw. nach telefonischer Vereinbarung. Für weitere Fragen stehen wir gerne zur Verfügung Ao. Univ. Prof. Dr. Günter Weigel Dr. Philipp Würtinger Univ. Prof. Dr. Andrea Griesmacher Innsbruck, im Dezember Seite 7 -
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