Mikroskopie II. Szilvia Barkó 2016

Transkript

1 Mikroskopie II. Szilvia Barkó 2016

2 Zusammenfassung der Vorlesung Fluoreszenzmikroskopie Fluorophoren Aufbau eines Epifluoreszenzmikroskops Konfokalmikroskopie Evaneszentfeldmikroskopie Multiphotonenmikroskopie Höchstauflösungsmikroskopie STED SIM

3 Jablonski-Schema

4 Fluoreszenzmikroskopie

5 Fluorophoren n/educational_resources/gfp_activity.html

6 Aufbau eines Epifluoreszenzmikroskops

7 Klassische mikroskopische Methoden I. Konfokale Mikroskopie (LSCM)

8 3D Bild eines Pollenkorns

9 Klassische mikroskopische Methoden II. Total Internal Reflection Fluorescence (TIRFM)=Evaneszenzfeldmikroskopie Pubs.rsc.org

10 Totalreflexion

11 1 α 2 β sin α sin β = n 2 n

12 Die Intensität des evaneszenten elektrischen Kraftfeldes nimmt senkrecht zur Grenzfläche zwischen den beiden Brechmedien exponentiell ab: z: der Abstand von der Grenzfläche d: die Eindringtiefe bei Wellen, die unter einem größeren als dem kritischen Winkel einfallen

13 Multiphotonenmikroskopie Normale Fluoreszenz Multiphoton Fluoreszenz 1 kurzwelliges Anregungsphoton 2 langwellige Anregungsphotonen 1 langwelliges Emissionsphoton 1 kurzwelliges Emissionsphoton

14 Jablonskidiagramm für 1 und 2-Photonen-Anregung von Molekülen vom Grundzustand S 0 in höhere Singulett Niveaus (S 1,S 2 ). hv A ist die Energie eines Photons bei Ein- bzw Zwei-Photonen-Anregung, hv F die Energie des induzierten Fluoreszenzphotons und hvp die Energie eines Phosphoreszenzphotons nach Intersystem-Crossing.

15 Höchstauflösungsmikroskopie

16 Stimulated Emission Depletion (STED) Nobelpreis für den Vater der Höchstauflösungsmikroskopie Stefan Hell 2014

17 Stimulierte Emission: Ein Lichtquant trifft auf ein Atom, das sich bereits im angeregten Zustand befindet. Unter Aussendung von zwei Lichtquanten kann das Atom in den Grundzustand zurückzukehren. Die beiden Photonen (Lichtquanten) sind exakte Kopien des eingefallenen Photons: Dadurch entsteht eine Vervielfältigung einer quantenphysikalisch genau bestimmten Sorte von Photonen.

18 Übersättigung Übersättigen der Abregung bedeutet, dass eine höhere Intensität verwendet wird als die zu einer weitgehenden Abregung des Markers gebraucht wird. Die Population des angeregten Zustands und somit nimmt die Fluoreszenz exponentiell mit der Intensität des stimulierenden Lichtstrahls ab. Wenn eine bestimmte Schwellenintensität überschritten ist, ist das Abregen quasi komplett.

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21 Structured Illumination Mikroskopie (SIM) Eine strukturierte Beleuchtung wird benutzt (Interferenzeffekt, Moire-Effekt). Die fluoreszierende Probe wird mit einem Streifenmuster angestrahlt. Überlagerung des bekannten Gittermusters und der unbekannten Struktur.

22 Aktin-Zellskelett (rot) und mit Clathrin überzogene Vesikel (CCV, grün) in einer HeLa- Zelle, abgebildet mit klassischer Weitfeldmikroskopie (a) und Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (b). Farbstoffe: Lifeact-tdTomato zur Visualisierung von F- Aktin, Clathrin-mEmerald zur Visualisierung der CCV. Maßstabsleiste: 5 Mikrometer.