Tierphysiologisches Praktikum für Anfänger

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1 Tierphysiologisches Praktikum für Anfänger Universität Ulm, WS 2010/2011 Aufgaben für den Teil Neurobiologie I n h a l t s ü b e r s i c h t Ablaufplan: Laufzettel: Aufgabe 1: Aufgabe 2: Aufgabe 3: Aufgabe 4: Aufgabe 5: Aufgabe 6: Zuordnung der Praktikantengruppen zu den Aufgaben und den Terminen Auf jeden Fall ausdrucken (DIN A4) und zu jedem Kurstermin mitführen Messung menschlicher Emotionen mit Gesichtsmuskel-EMG Elektroortung bei Fischen Simulation neuronaler Aktivität Frequenzabhängigkeit der Schallrezeptoren, Binaurales Richtungshören Fortgeleitete Aktionspotentiale einzelner Nervenfasern Einfachste neuronale Koordination: Reflexe und Regelung

2 Zuordnung von 18 Praktikantengruppen zu den 6 Aufgaben und 9 Terminen ( ) Aufgabe Raum Hiwi, Oberbetreuer Emotion N 24/353 1, 2 13, 14 7, 8 3, 4 15, 16 9, 10 5, 6 17, 18 11, 12 Stein, Städele El. Fisch N 24/353 3, 4 15, 16 9, 10 5, 6 17, 18 11, 12 7, 8 1, 2 13, 14 Wittlinger, Popp Simulation N 24/353 5, 6 17, 18 11, 12 7, 8 1, 2 13, 14 9, 10 3, 4 15, 16 Mader Ohr N 24/376 N 24/377 7, 8 1, 2 13, 14 9, 10 3, 4 15, 16 11, 12 5, 6 17, 18 Ehret, Berger Reflex N 24/353 9, 10 3, 4 15, 16 11, 12 5, 6 17, 18 13, 14 7, 8 1, 2 Wolf, Dotzauer Bauchmark N 24/353 11, 12 5, 6 17, 18 13, 14 7, 8 1, 2 15, 16 9, 10 3, 4 Hochleiter kein Versuch , ,

3 Tierphysiologisches Praktikum für Anfänger, Teil Neurobiologie Wintersemester 2010/2011 Name, Vorname... Studienfach... Matrikelnummer... Gruppennummer... Versuch Datum Vorbereitung Protokoll Abgabe Protokoll fertig Emotion El. Fisch Simulation Ohr Bauchmark Reflex 3

4 AUFGABE 1 Messung menschlicher Emotionen mit Gesichtsmuskel-Elektromyogrammen Im Rahmen dieses Versuchs soll gezeigt werden, dass sich der emotionale Zustand einer Person anhand der Aktivität der Gesichtsmuskulatur messen lässt. Es soll außerdem verdeutlicht werden, dass bei sorgfältiger Versuchsdurchführung auch mit einfachen Mitteln qualitativ und quantitativ bessere Ergebnisse erzielt werden können als mit einer einfachen Beobachtung des Gesichtsausdrucks. Beide Methoden (EMG und Gesichtsbeobachtung) sollen miteinander verglichen werden, um die Relevanz der verschiedenen Methoden festzustellen. Stichpunkte zur Vorbereitung: Gesichtsmuskulatur, Gesichtsschädel, Emotion, Gesichtsausdruck, Processus condylaris mandibulae (Gelenkfortsatz des aufsteigenden Kieferastes; Condylion), Aktionspotentialentstehung, neuromuskuläre Synapse, Physiologie der Muskulatur (hier im speziellen Feinbau und Funktionsprinzip von quergestreifter Muskulatur), Funktionsprinzip Elektromyogramm (EMG), extrazelluläre Ableitung, "Facial Action Coding System" (FACS), Fragen in diesem Skript. Versuchsdurchführung Es nehmen insgesamt 6 Personen am Versuch teil. Zwei der sechs Versuchsteilnehmer werden ein Autorennspiel an einer Playstation 2 spielen. Gleichzeitig werden bei diesen Versuchspersonen Klebe-Elektroden an den in Abb. 3 aufgeführten Muskeln angebracht zur Messung der Emotionen mittels Elektromyogramm-Ableitungen (EMG; Was genau wird bei einem EMG gemessen?). Die Emotionen und Reaktionen jeder Versuchsperson werden außerdem von jeweils 2 Beobachtern aufgezeichnet. Damit die auftretenden Emotionen dem Fahrverhalten zugeordnet werden können, wird der Spielverlauf von den übrigen 2 Versuchsteilnehmern am Computer (mittels eines Handschalters) mitprotokolliert. Es werden EMGs folgender Gesichtsmuskeln angefertigt: 1. Musculus zygomaticus major (zieht Mundwinkel nach oben beim Lächeln). 2. Musculus corrugator supercilii (Augenbrauenrunzler, zieht Augenbrauen nach unten) Die Abbildung rechts zeigt die Platzierung der EMG-Elektroden für den Zygomaticus major und den Corrugator supercilii. Zygomaticus: Auf einer gedachten Linie zwischen Mundwinkel und Condylion, 2,5cm bzw. 3,5cm vom Mundwinkel entfernt. 4 Corrugator: Erste Elektrode knapp über der medianen Ansatzstelle der Augenbrauen und die 2. Elektrode 1cm lateral davon, auf einer gedachten Linie mit 60 Winkel zur Stirnmitte. Während des Versuches sind alle Handys auszuschalten (können Sie sich vorstellen, wieso?). Zunächst wird das Gesicht von Versuchsperson 1 mit Alkohol gereinigt, um einen möglichst guten Kontakt der EMG-Elektroden zur Haut zu ermöglichen. Fügen Sie einen kleinen Tropfen Elektroden-Kontaktgel auf die Erdungselektrode und kleben Sie diese mit einem Klebestreifen mittig auf die Stirn der Versuchsperson 1. Sinn dieser Elektrode ist es, ein mögliches elektrisches Rauschen ("Brumm" - können Sie sich vorstellen, woher?) zu unterdrücken. Befestigen Sie danach entsprechend die 2 Elektroden für den Zygomaticus- Muskel und die 2 Elektroden für den Corrugator-Muskel. Vergessen Sie nicht, Elektroden- Kontaktgel zu verwenden! Testen Sie nun die Qualität der Ableitungen, indem Sie auf dem PC die EMG-Potentiale beobachten. Versuchsperson 1 soll dabei die Augenbrauen runzeln, bzw. lachen. Filtereinstellungen der Verstärker (WPI Iso-Dam): Hochpaßfilter: 0.5kHz; Tiefpaßfilter: 100Hz bzw. 300Hz. Verstärkung: (Definieren Sie, was sich hinter Hoch- und Tiefpaßfilter versteckt). Die Abbildung rechts zeigt eine erfolgreiche Ableitung des Corrugators. Sind die EMG-Signale in Ordnung, befestigen Sie analog zu Versuchsperson 1 auch die EMG-Elektroden bei Versuchsperson 2. Die Signale (pro Versuchsperson jeweils 2 EMG-Ableitungen und ein weiterer Kanal, s.u.) werden digital auf einem Computer aufgezeichnet und später gefiltert bzw. zur Datenauswertung aufbereitet. Nun ist es an der Zeit, die Emotionen der Versuchspersonen aufzuputschen. Dazu spielen beide Versuchspersonen gegeneinander eine Autorennen-Simulation auf einer Playstation 2. Dazu erhalten beide Spieler die Möglichkeit, sich 10 Minuten mit dem Spiel vertraut zu machen, bevor Daten aufgezeichnet werden. Jeweils zwei Personen beobachten einen Spieler bzw. dessen Fahrt. Dabei notiert Beobachter 1 den Gesichtsausdruck der Versuchsperson und klassifiziert diesen grob anhand der Versuchsaufzeichnung (s.u.). Es wird sowohl Gemütszustand (erfreut / neutral / verärgert) als auch die Spielzeit notiert. Beobachter 2 folgt dem Spiel und betätigt einen Handschalter (der 3. Kanal, der pro Spieler auf dem Computer aufgezeichnet wird), mit dem er unkontrollierte Fahrmanöver (z.b. ungewolltes Verlassen der Straße) kennzeichnet. Der Betreuer startet das Spiel und auch die Datenaufzeichnung. Er notiert zusätzlich den Spielstand und gegebenenfalls Auffälligkeiten während des Spiels (Unfälle, o.ä.).

5 Was Sie für das Protokoll auswerten und diskutieren sollen: 1. Analysieren Sie die EMG-Signale in Excel. Der Betreuer wird Ihnen zeigen, wie sie die Daten analysieren. Können Sie anhand der EMG-Aufzeichnung eindeutige Gemütszustände erkennen? Vergleichen Sie dazu die Aufzeichnung der unkontrollierten Fahrmanöver mit den EMG-Aufzeichnungen und suchen Sie nach Korrelation. Können Sie bestimmte Situationen der EMG-Aktivität zuordnen? Messen Sie dazu die Latenz zwischen Anfang eines unkontrollierten Fahrmanövers und dem entsprechenden EMG-Signal. Bedenken Sie dabei, ein EMG-Signal könnte auch VOR dem Beginn des unkontrollierten Fahrmanövers auftreten, z.b. wenn die Versuchsperson ein Problem mit der Fahrt antizipiert. Erstellen Sie ein Diagramm (Rasterplot), in dem Sie übereinander (Y-Achse) für jedes unkontrollierte Fahrmanöver die Latenz eintragen (X-Achse). Fügen Sie Mittelwert und Standardabweichnung hinzu. Um welchen Betrag schwankt die Latenz? Was bedeuten diese Werte? Dies diskutieren Sie in der Diskussion. Corrugator supercilii 2. Tragen Sie nun in Excel den Gemütszustand (erfreut=1, neutral = 0, verärgert=-1) gegen die Spielzeit auf. Dies zeigt Ihnen den Verlauf des Gemütszustandes während des Spiels. Vergleichen Sie nun die Gemütszustände mit den aufgezeichneten EMGs. Können alle aufgezeichneten EMG-Signale mit den Gemütszuständen, die sich im Gesicht abzeichnen, korreliert werden? Messen Sie dazu, ob bei jedem EMG-Signal der "korrekte" Gesichtsausdruck auftrat und notieren Sie das prozentuale Auftreten der korrekten Zuordnungen. Führen Sie diesen Test auch umgekehrt aus (ist jedem Gesichtsausdruck auch ein EMG Signal zugeordnet?). 3. Subtrahieren Sie als nächstes die Corrugator-Aufzeichnung von der Zygomatikus- Aufzeichnung. Vergleichen Sie nun den Verlauf des Gemütszustands den Sie während des Versuches mitprotokolliert haben mit der Subtraktion beider EMGs. Fügen Sie eine Abbildung in Ihr Protokoll ein, auf dem Sie Ähnlichkeiten und Unterschiede hervorheben (Was unterschiedet diese Auswertung von der im Teil 2 vorgenommenen Auswertung?). Wie interpretieren Sie diese Ergebnisse? Diskutieren Sie Ihrer Ergebnisse in Ihrem Protokoll und erörtern Sie ob sich Ähnlichkeiten zwischen den verschiedenen Methoden zur Messung von Emotionen zeigen. Können Sie abschätzen, welche Methode am besten geeignet ist (im Hinblick auf Quantität und Qualität), um Emotionen zu erkennen und wieso denken Sie das? Welche Anwendungsmöglichkeiten sehen Sie für die verschiedenen Methoden? Zygomaticus major Literatur Faller: Der Körper des Menschen (Thieme Verlag) Eckert: Tierphysiologie (Thieme Verlag) Penzlin: Lehrbuch der Tierphysiologie (Verlag Gustav Fischer) Schmidt, Thews: Physiologie des Menschen (Springer Verlag) Weblinks

6 AUFGABE 2 Elektroortung bei Fischen (Tapirfisch/Messerfisch) Die Versuche sollen mit folgenden Themengebieten vertraut machen: - Erzeugung und Perzeption elektrischer Felder bei Fischen - Eigenschaften des "elektrischen Sinns" - Verhaltensbeobachtung Manche Fischarten erzeugen mit speziellen elektrischen Organen kurze elektrische Entladungen. Man unterscheidet hier zwischen stark und schwach elektrischen Fischen. Bei ersteren stehen die starken Entladungen im Zusammenhang mit Feindabwehr und Beutefang. Die Signale der schwach elektrischen Fische (und auch die der Nebenorgane bei den stark elektrischen Fischen) dienen dagegen zur Orientierung und zur Kommunikation. Aus praktischen Gründen sollen die Untersuchungen ausschließlich an schwach elektrischen Fischen durchgeführt werden. 2 verschiedene Arten stehen zur Verfügung die unterschiedliche Typen repräsentieren. Gymnotus carapo (Gebänderter Messerfisch) als typischer Vertreter der sogenannten "Knatterer" sowie Apteronotus albifrons (Weißstirn Messerfisch), als Vertreter der "Summer". Registrieren Sie die elektrischen Signale mit 2 Elektroden in Form einer differenziellen Ableitung. Dabei wird die Spannung der einen (b) von der anderen (a) abgezogen. Erklären Sie das Zustandekommen der biphasischen Form des Signals von Gymnotus unter der Annahme, dass sich eine Elektrode am Kopf, die andere am Schwanz des Tieres befindet. welche der beiden (a oder b) muss sich am Kopfende befinden, damit das Ergebnis den Literaturangaben entspricht. Führen Sie die im folgenden beschriebenen Messungen durch und beantworten Sie die Fragen im Protokoll anhand Ihrer Ergebnisse. A. "Knatterer" Setzen Sie einen Fisch (Gymnotus carapo) in einer Netz-Röhre in ein großes Becken, platzieren Sie die Elektroden neben der Röhre (überlegen Sie sich sinnvolle Anordnungen) und versuchen Sie ein möglichst gutes Signal/Rauschverhältnis zu bekommen. Jetzt können die Signale exakt vermessen werden (jeweils Mittelwert aus mehreren Messungen): - mit welcher Frequenz werden die Signale erzeugt? - ermitteln Sie Dauer und Amplitude - kann das Tier die Form der Signale variieren? - was geschieht, wenn der Fisch sich umdreht? - hängen die Messgrößen vom Verhaltenskontext ab? - wie ändert sich die Amplitude mit wachsendem Abstand der Elektroden vom Fisch (5 oder 10 cm Raster)? - bis zu welcher Entfernung vom Fisch sind die Signale nachweisbar? - ist dieser Abstand abhängig von der Orientierung zum Tier? 6 wiederholen Sie die Messungen mit einem anderen Fisch. - gibt es individuelle Unterschiede? - was geschieht, wenn man beide Fische gleichzeitig im Becken hat (Tiere noch in den Röhren)? - wie verhalten sich die frei schwimmenden Tiere (bilden Sie verschiedene Verhaltens-Kategorien)? begründen Sie Ihre Verhaltensbeobachtung anhand Ihrer Messergebnisse. B. "Summer" Wiederholen Sie in vernünftig angepasster Weise die Messungen von A mit Messerfischen (Apteronotus albifrons). Stellen Sie die Messergebnisse in geeigneter Art dar. Vergleichen Sie "Summer" und "Knatterer". Gehen Sie v.a. auf die Unterschiede ein und heben Sie jeweils die Vor- und Nachteile hervor. Stichworte zur Vorbereitung elektrisches Feld, Feldlinien (3-Finger-Regel), Isopotentiallinien, Ohmsches Gesetz, Frequenz, Ruhe-/Aktionspotential, synaptische Erregung, elektrische Organe von stark und schwach elektrischen Fischen, Seitenlinienorgan, Territorialverhalten Literatur Biologie in unserer Zeit, 6. Jahrg., 1976, Nr. 1 (Link zu PDF-File) ( Eckert: Tierphysiologie Wehner, Gehring: Zoologie Gerthsen, Gneser, Vogel: Physik

7 AUFGABE 3 Simulation neuronaler Aktivität Einführung Die hohe Rechengeschwindigkeit moderner Computer ermöglicht es die Potential- Verhältnisse über der Zellmembran von Nervenzellen statisch (für einen bestimmten Moment), v. a. aber dynamisch (über einen gewissen Zeitraum) zu berechnen. Als Grundlage dazu dienen die in vielen Experimenten (in Labors auf der ganzen Welt) gemessenen physiologischen Parameter der Neurone. In dem von uns benutzten Programm (madsim) beruhen die Berechnungen im wesentlichen auf folgenden Einflußgrößen: - Eigenschaften der wichtigsten Ionen-Kanäle (z.b.: Tor-Parameter, Leitfähigkeit, Öffnungswahrscheinlichkeiten) - Gleichgewichtspotential der verschiedenen Ionen (Na +, K +, Cl -, Ca 2+ ) - Membrankapazität (Zellgröße) - synaptische Übertragungseigenschaften (z.b.: Schwellenpotential zur Transmitter-Freisetzung, Leitfähigkeit, Synapsentypen) Zur Berechnung wird im Prinzip das von Hodgkin und Huxley entwickelte Aktionspotential- Modell verwendet. Dieses Modell erklärt den zeitlichen Ablauf des Öffnungsverhaltens von Na + - und K + -Kanälen während eines AktionsPotentials anhand der Kanal-Tore. Wir verwenden hier allerdings eine etwas erweiterte Form (außer Na + - und K + - sind hier auch andere Kanäle berücksichtigt, z.b.: Ca 2+ oder der Ca-abhängige Kaliumkanal). Das Zustandekommen des Ruhepotentials und das Verhalten der spannungsgesteuerten Kanäle während eines APs müssen Sie unbedingt verstanden haben, sonst macht eine Durchführung dieses Versuches keinen Sinn! Die eigentliche Berechnung wird über ein numerisches Näherungsverfahren zur Berechnung eines Systems von Differenzialgleichungen 1. Ordnung durchgeführt. Dabei werden nicht nur die aktiven Membraneigenschaften (= Öffnungszustand von spannungs- und ligandenabhängigen Kanälen), sondern auch die passiven wie Membrankapazität, Widerstand und (Ruhe-)Leitfähigkeit berücksichtigt. Besonders interessant ist die Möglichkeit, mehrere Neurone über Synapsen zu einem Nervennetz zu verbinden. Es stehen exzitatorische (Na + ), inhibitorische (K +, Cl - ), elektrische und frei definierbare Synapsen zur Verfügung. Ihre Eigenschaften wie Übertragungsstärke, Verzögerung und Gleichgewichtspotential sind individuell einstellbar. Damit können Teile eines Nervensystems naturgetreu nachgebildet werden (z.b. ein Reflexbogen). Neben dem didaktischen Wert in der Ausbildung bietet die Simulation von Nervennetzen einen riesigen Vorteil in der Forschung. Hier können Manipulationen vorgenommen werden, die im natürlichen Experiment gar nicht oder nur unter immensem Aufwand möglich sind. Bei der intrazellulären Ableitung von einzelnen Neuronen hat man normalerweise viele "störende" Einflüsse von anderen, direkt praesynaptisch zum beobachteten Neuron gelegenen Zellen und von Modulatoren bzw. Hormonen, die über den Extrazellularraum einwirken. Um die Reaktionen einer einzelnen Zelle zu messen und sicher zu sein, dass es sich tatsächlich um die Eigenschaft der Zelle und nicht des Gesamtsystems handelt, muss deshalb sehr viel Zeit und nicht zuletzt Geld investiert werden, um diese Neurone zu isolieren und in Zellkultur zu nehmen, oder über Pharmaka bzw. chirurgische Eingriffe die interzellulären Einflüsse auszuschalten. Bei allen Methoden besteht jedoch immer die Gefahr von nicht vorhersehbaren Nebenwirkungen, die die Ergebnisse verfälschen können. In der Simulation sind alle diese Störungen kontrollierbar bzw. nicht existent. Außerdem bietet sich die Möglichkeit, die Eigenschaften eines Systems nicht durch Analyse, sondern durch Synthese herauszufinden, d. h. indem man es nachbaut. Die Chemiker verwenden diese Methode sehr erfolgreich, indem sie die unbekannte Struktur eines komplexen Moleküls aus den bekannten Bestandteilen bestimmen. Hierzu wird die zu analysierende Substanz synthetisiert und die verschiedenen Varianten (mit jetzt bekannter Struktur) mit dem Original verglichen. Wir benutzen die Simulation um Fragestellungen zu bearbeiten, die normalerweise nur durch intrazelluläre Ableitung von isolierten Neuronen oder Neuronengruppen zu beantworten wären. Praktische Durchführung Folgende Aufgaben sind zu bearbeiten: 1. Erstellen eines Neurons 1.1. Definition der graphischen Eigenschaften 1.2. Definition der physiologischen Eigenschaften (passiv und aktiv) 2. Messungen an einem einzelnen, isolierten Neuron 2.1. Abhängigkeit des Membranpotenzials von der K + -Außenkonzentration 2.2. Reaktion eines Neurons auf elektrische Reizung 2.3. Messung der Refraktärzeit 3. Synaptische Wechselwirkung zwischen wenigen Neuronen 3.1. Wirkung verschiedener Synapsen 3.2. synaptische Summation 7

8 1. Erstellen eines Neurons Starten Sie madsim, brechen Sie den Datei-Öffnen-Dialog ab ohne eine Datei zu laden und erstellen Sie durch einen Rechtsklick in das leere Arbeitsfenster ein Neuron. Um Änderungen an dem Neuron vorzunehmen können Sie darauf Doppel- oder Rechtsklicken. Taufen Sie Ihr Neuron, indem Sie im Submenu Neuron Name ändern... auswählen. Hier finden Sie auch die anderen, für den Kurs wichtigen Funktionen (z.b. Physiologische Parameter... oder Ausgabefenster darstellen ) In madsim werden Neurone als rundes Soma mit einem nach oben ausgerichteten Dendriten (mit 3 verschiedenen Segmenten) dargestellt. Das Soma hat in madsim global die Eigenschaften des Axonhügels. In Somata realer (Wirbeltier-)Neurone ist der Axonhügel auf den Ursprungsbereich des Axons beschränkt. Ein Axon wird nur gezeichnet, falls das Neuron (ausgangs-)synapsen auf andere Neurone besitzt (s. Abb. 1) 1.1 Die graphischen Eigenschaften ( Neuron -> Graphik... ) wie Farbe oder Größe der verschiedenen Elemente bzw. des gesamten Neurons sind keineswegs bloße Spielerei. Dadurch lassen sich bestimmte Eigenschaften kodieren und Netzwerke übersichtlich aufbauen. Hemmende und erregende Neurone können etwa durch verschiedene Farben dargestellt werden, Sinneszellen oder Motoneurone durch verschiedene Größen. (Markierte Neurone werden blau dargestellt) 1.2 Jedes neue Neuron wird automatisch mit physiologischen Standardwerten initialisiert. Über verschiedene Dialogboxen können diese Parameter individuell für jedes Neuron verändert werden (z.b. physiologische Parameter... im Submenu Neuron ). An dieser Stelle eine kurze Bemerkung. Das Nervensystem gehört zu den komplexesten Objekten die im (bekannten) Universum existieren. Dies spiegelt sich dann auch in Zahl und Abhängigkeit der Parameter wieder. Lassen Sie sich dadurch nicht verwirren! Normalerweise wird man jeweils nur den Wert EINES Parameters ändern (von dem man auch wissen sollte, was das physiologisch bedeutet), z.b. die Membrankapazität oder ein Ionen-Gleichgewichtspotenzial. Überlegen Sie sich also VOR dem Öffnen einer Box, welchen Parameter Sie ändern möchten und lassen Sie sich durch die vielen anderen nicht aus der Ruhe bringen. Ungewohnt ist vielleicht auch die exponentielle Schreibweise bei sehr kleinen Werten. Der Grund hierfür liegt in der besseren Übersichtlichkeit und geringeren (Tipp-)Fehleranfälligkeit bei dieser Art der Notierung (statt 0, schreibt man z.b. bei der Kapazität 3e-11). Typisch für madsim-dialoge ist auch der Knopf OK F1, damit wird die Änderung übernommen und dann sofort eine Simulation gestartet. Die Taste F12 öffnet den zuletzt benutzten Dialog, ist auch sehr praktisch. Das Ergebnis der Simulationsrechnung wird standardmäßig in einem Spannungs-Zeit- Diagramm für jedes Neuron dargestellt (s. Abb. 2). In diesem Beispiel wird durch einen elektrischen Reiz in Neuron N1 (dargestellt durch die schwarze Kurve am unteren Rand des Diagramms von N1) eine Folge von Aktionspotentialen erzeugt ( soma potential - Kurve). Über die Synapse von N1 auf den proximalen Dendritenabschnitt von N2 (Abb. 1) werden EPSPs ausgelöst, die sich schließlich soweit aufsummieren, daß Spikes entstehen. Die Potenziale im Diagramm des Neurons N2 erscheinen später, da für die Fortleitung über das Axon und die Vorgänge an einer chemischen Synapse Zeit benötigt wird. Abb. 1: Hauptfenster mit 2 Neuronen und dem Dialog physiologische Parameter für N2 (weil das Neuron N2 markiert ist) Abb. 2: Ausgabefenster für die Neurone N1 und N2 8

9 2. Messungen an einem einzelnen, isolierten Neuron 2.1 Kalium-Ionen sind wesentlich an der Bildung der Membranpotentiale beteiligt. Ändert sich das KonzentrationsVerhältnis (zwischen inner- und außerhalb der Zelle), so kann das zu massiven Störungen führen. Die Veränderung der K + -KVs ist nicht etwa nur von akademischem Interesse. V. a. Pflanzenfresser nehmen mit der Nahrung z. T. extrem große Mengen an Kalium auf, das oft (wg. Wassermangel) nicht einfach ausgeschieden werden kann. Insbesondere bei Invertebraten stellen hohe und variable extrazelluläre K + -Konz. ein Problem dar, das im Verlauf der Evolution zu vielfältigen Anpassungen führte. Zur Untersuchung dieses Problems generieren Sie eine einzelne Nervenzelle (s. u.) mit den Standard-Parametern für die physiologischen Eigenschaften und verändern das Membranpotential entsprechend der K + -KVs. Gehen Sie von der Annahme aus, dass die K + Konzentration außerhalb der Zelle [a] normalerweise 35-fach geringer ist als innerhalb [i]. Berechnen Sie das daraus resultierende GleichgewichtsPotenzial nach Nernst und zwar für die K + KVs 35:1, 10:1, 10:5 und bringen Sie die Werte zum Versuch mit: - R* T [i] E D = * ln für 20 C F * z [a] E D = - 0,058* log (Eine bessere Beschreibung der natürlichen Verhältnisse liefert die Goldmann-Gleichung, in der auch die anderen Ionen berücksichtigt werden. Die Vereinfachung der Berechnung nach Nernst reicht für unsere Zwecke jedoch vollkommen aus) Zur Durchführung: Definieren Sie die Grundeinstellungen für die Simulation unter Einstellungen -> Simulationseinstellungen... - Simulationsdauer: 1s - Einzelschrittlänge: 1e-5s (wie würde man diese Zeit umgangssprachlich nennen?) (die übrigen Parameter sind nicht von Belang), beenden Sie die Eingabe mit OK. Erstellen Sie nun ein Neuron und dazu ein Ausgabefenster. Dieses Fenster stellt ein Diagramm mit X als Zeit- und Y als Membranspannungs-Achse dar (s. Abb. 3) Öffnen Sie durch Doppelklick auf eine der Achsen oder im Diagramm-Menu unter Einstellungen -> Diagramm... die Box zum Anpassen des Diagramms und treffen Sie folgende Einstellungen: - X-Achse (s) von: 0 bis 1 - Teilstrichintervall: 0,1 - Y-Achse (mv) von: -100 bis 50 - Teilstrichintervall: 20 Starten Sie nun die Simulationsrechnung mit der Taste F1. Das Diagrammfenster sollte nun (in etwa) so aussehen wie Abbildung 3. Das Ergebnis ist ziemlich unspektakulär und zeigt nur eine gerade Linie bei -70mV. Sie sollten sich aber klar machen, dass das Programm mal das Membranpotential, den Zustand aller Kanäle und die über die Membran fließenden Ströme aufgrund passiver Eigenschaften (wie etwa Membrankapazität oder Natrium-Leckleitfähigkeit) berechnen musste. [i] [a] 9 Abb. 3 Um die Auswirkungen unterschiedlicher K + -Konzentrationen zu untersuchen, benötigen wir die von Ihnen berechneten K + GPs, da das Programm mit Potenzialen arbeitet und nicht mit Ionenkonzentrationen. D.h. anstelle der Konzentrationen geben Sie jeweils das berechnete GP für K + an. Öffnen Sie dazu den Dialog physiologische Parameter... im Submenu Neuron (s. auch Abb. 1). Hier die berechneten K + GPs eintragen. Nicht vergessen, das RuhePotenzial muss ebenfalls angepasst werden (und zwar für Soma und Dendrit). Der Einfachheit halber nehmen wir an, dass das RP immer 20mV positiver als das K + GP ist (hauptsächlich wg. des Na-Leckstromes). Führen Sie für jedes der K + GPs eine Simulation durch und beschreiben bzw. erklären Sie die Ergebnisse. Dokumentation durch Screenshot und Speicherung in Word o. ä. Programm. 2.2 Neuronale Informationsverarbeitung beruht letztlich auf einer gezielten Störung (d.h. Veränderung) des Ruhepotenzials. Dies läßt sich am einfachsten durch die Injektion von Strömen in die Zelle untersuchen, die das Ruhepotential de- oder hyperpolarisieren. (bei Experimenten mit natürlichen Neuronen würde man dazu eine Mikroelektrode in die Zelle einstechen.) Stellen Sie K + GP und RP des Neurons wieder auf Standardwerte und erzeugen Sie einen elektrischen Reiz (Rechteck mit 500ms Dauer) im Soma der Zelle (Dialog: Stromreiz definieren... (Taste: F7)) mit folgenden Einstellungen: - Reiz einschalten checken - Rechteck, Rampe linker Radiobutton - Beginn: 0,1s - Anstieg: 0s - Dach: 0,5s - Abfall: 0s - Amplitude: 1e-11A (= 1 * Ampere) - Anzahl: 1 Die restlichen Parameter können Sie ignorieren. (Tipp: falls Sie das verwirrend finden, checken Sie die Box Einfache Darstellung wodurch die meisten Elemente verschwinden) Verlassen Sie den Dialog mit OK-F1. Messen Sie das resultierende Potential mit Hilfe der

10 horizontalen Cursor (rechte Maustaste ins Diagrammfenster). Dazu kann es notwendig sein, die Skalierung des Diagramms zu verändern. Besonders bei kleinen Reiz-Amplituden läßt sich das Ergebnis sonst nicht genau bestimmen. Die Einstellungen ändert man im Dialog Diagramm-Layout den man über das Menu Einstellungen -> Diagramm des Ausgabefensters oder durch Doppelklick auf eine der Achsen im Diagramm öffnet. Erhöhen Sie die Reizstärke sukzessive in folgenden Schritten von 1e-11 auf 1e-10, 2e-10,..., 8e-10A. Neben der Amplitude des ausgelösten Potentials sind auch die Latenzzeit (= Zeit vom Beginn des Reizes bis zur Überschreitung der Spikeschwelle bei ca. -40mV) und die Frequenz von APs zu bestimmen, sobald diese auftreten. Die Ergebnisse sind wieder zu erklären. Zeiten messen Sie unter Verwendung vertikaler Cursor. Dieses Experiment zeigt auch sehr schön die Änderung der Informationscodierung. Während die Information auf dem Dendrit amplitudenmoduliert ist (je stärker der Reiz, desto größer die Depolarisation), ist sie auf dem Axonhügel des Somas und dem Axon frequenzmoduliert (je stärker der Reiz, desto höher die AP-Frequenz). Klären Sie auf jeden Fall bei der Versuchsvorbereitung, was das bedeutet und v. a. weshalb eine Änderung von Amplituden- zu Frequenzmodulation bei der Fortleitung von Potenzialen über das Axon notwendig ist (gibt es Neurone, die keine APs machen? Beispiel?). Wiederholen Sie die Reizserie mit hyperpolarisierenden Strömen (-1e-11, -1e-10, -4e-10A). Welche Unterschiede beobachten Sie gegenüber depolarisierenden Reizen? Jetzt wollen wir die Ströme betrachten, die während eines AP über die Membran fließen. Ändern Sie dazu die Reizdauer (Dach) auf 0.002s, Amplitude auf 2e-9A. Im Diagramm setzen Sie - X-Achse (s) von: 0,09 bis 0,13 - Teilstrichintervall: 0,01 - Y-Achse (mv) von: -80 bis 50 Nach der Simulation sollte ein AP im linken Drittel des Diagramms zu sehen sein. Um die Ströme für Na +, K + und Ca 2+ darzustellen, doppelklicken Sie links oben in der Legende auf soma potential um den Kurven -Dialog zu öffnen. Wählen Sie die benötigten Kurven aus der Liste durch Anklicken der Checkbox links oben, neben der Bezeichnung, (legen Sie ggfls. eine Farbe für diese Kurve fest) und klicken Sie dann unbedingt vor der Auswahl der nächsten Kurve auf übernehmen. Dann mit fertig rausgehen und mit F1 die Simulation neu berechnen. Diskutieren Sie die Stromkurven im Hinblick darauf, ob diese dem entsprechen, was Sie während des Ablaufs eines AP erwarten. Zur besseren Übersicht können die jeweils betrachteten Kurven mit einer Liniendicke von 2 dargestellt werden. Wie würden die Leitfähigkeits-Kurven (die in den Lehrbüchern häufiger als die Stromkurven dargestellt werden) für die einzelnen Ionen aussehen. Untersuchen Sie nun die aktiven Membraneigenschaften genauer, indem Sie einzelne Ströme ausschalten. Im realen Experiment würde man das durch die Applikation eines entsprechenden Giftstoffes erreichen. So passt z.b. TTX (Tetrodotoxin), das Gift des Kugelfisches, genau in die Öffnung der spannungsgesteuerten Na + -Kanäle und blockiert diese, so dass keine Natrium-Ionen mehr hindurch diffundieren können. Wir simulieren eine Vergiftung mit TTX, indem wir die Leitfähigkeit der Na + -Kanäle auf 0 setzen (Dialog: F5). Testen Sie die Wirkung mit einer Reizstärke von zunächst 2e-9A, dann 3e-9A. Blockieren Sie in gleicher Weise (mit 1.5e-9A) die K + - und anschließend auch die Ca 2+ -Kanäle (die anderen Kanäle jeweils wieder auf Standard-Leitfähigkeit setzen) und interpretieren Sie die Ergebnisse. V.a. bei der Beobachtung der Wirkung der Ca 2+ -Kanäle ist es praktisch, den Normalzustand (kein Kanal blockiert) zu speichern, dazu unter Einstellungen im Diagramm-Menu eine Referenzkurve speichern um einen direkten Vergleich zu haben. Beantworten Sie anhand ihrer Ergebnisse auch die Frage, was die funktionelle Wirkung der Ca 2+ -Kanäle ist. Mit welchem einfachen Experiment könnte man ihre Aussage testen? 2.3 Messen Sie die Refraktärzeit des Standardneurons durch 2 gerade überschwellige elektrische Reize auf 0,1ms genau. Stellen Sie sicher, dass alle Kanäle wieder ihre Standardleitfähigkeit haben. Löschen Sie die Stromkurven, setzen Sie die X-Achse auf 0-0,2s mit einem vernünftigen Teilstrichintervall und Bestimmen Sie dann zunächst die Reizschwelle zum Auslösen eines AP auf eine Dezimalstelle genau mit Einzelreizen. (Warum darf man bei diesem Experiment nicht beliebig überschwellig reizen?). Mit dieser Reizstärke geben Sie nun 2 Reize in immer kürzeren Abständen beginnend mit 50ms, dann 40, 30, 20 und 10ms Abstand. Von da an jeweils um 1ms verkürzen. Beobachten Sie dabei auch die Amplitude des 2. AP und erklären Sie ggfls. Unterschiede zum 1. AP. Nach Erreichen der relativen Refraktärzeit (woran ist das zu erkennen?) verringern Sie den Abstand der beiden Reize in Schritten von 0,5ms und erhöhen Sie die Reizstärke bis max. 5e-9A zur Bestimmung der absoluten Refraktärzeit. Der Verlauf ist in geeigneter Weise in einem Diagramm darzustellen. 3 Synaptische Übertragung 3.1 Zur Untersuchung der synaptischen Informationsübertragung erzeugen Sie 2 Neurone (denen Sie die Namen N1 und N2) geben und verschalten N1 mit einer Na + -Synapse auf das Soma von N2 (Leitfähigkeit 1e-9S). Erzeugen Sie sowohl für N1 als auch für N2 ein Ausgabefenster. N1 erhält einen Stromreiz mit Beginn 0,1s, Dach 2ms und Amplitude 2e- 9A. Stellen Sie die Anzeigedauer im Diagramm auf 0,05-0,15s ein und messen Sie die Reaktion von N2 bei steigender Leitfähigkeit (1e-9, 5e-9,... 5e-7) mit der eine zunehmende Zahl von ligandengesteuerten Kanälen simuliert wird (Y-Achse entsprechend anpassen, Latenzzeit von APs bei -40mV messen). Was passiert in N2 bei einer unterschwelligen (1e- 9A) bzw. bei einer hyperpolarisierenden (-1e-8A) Reizung in N1? Versetzen Sie die Synapse auf den 1. (somanahen) Dendritenabschnitt und wiederholen Sie die Messung bei einer Leitfähigkeit von 5e-7S. Was beobachten Sie, wenn die Synapse auf die anderen (somaferneren) Dendritenabschnitte gesetzt wird? 3.2 Den Effekt der synaptischen Summation beobachten wir durch das Auslösen von mehreren APs in N1. Plazieren sie eine exzitatorische Synapse (Leitfähigkeit: 5,8e-8S) auf Dendritenabschnitt 1 von N2 und reizen Sie zunächst mit einer Dauer von 2ms. X-Achse von 0 bis 0,3s. Verlängern Sie dann den elektrischen Reiz in N1 auf 10, 30, 50 und 100ms. Beschreiben Sie Ihre Beobachtungen. Wie könnte man die Summation verstärken? 10

11 Auswertung Im Protokoll sind alle Fragen aus dem Skript zu beantworten. Stellen Sie ihre Meßergebnisse nicht nur als qualitative Beschreibung, sondern wann immer möglich in Form von Tabellen oder Diagrammen dar. Eine quantitative Beschreibung der Beobachtungen ist deshalb besonders wichtig, da man letztlich nur solche Ergebnisse weiter "verwerten" kann, die in Form von Zahlen vorliegen und somit überprüfbar sind. Weitere Einzelheiten zum Erstellen des Protokolls erhalten Sie vom Platzassistenten bei der Durchführung der Versuche. Stichworte zur Vorbereitung - Ionenkanäle, Kanal-Zustände, Ionenverteilung - Ruhepotential, Aktionspotential, Hodgkin-Huxley-Zyklus - Amplituden- und Frequenzmodulation - Bau von Nervenzellen (Invertebraten/Vertebraten) - Zellmembran, Soma, Dendrit, Axon, Synapsen - synaptische Signalübertragung - exzitatorische und inhibitorische postsynaptische Potentiale - Kondensator, Kapazität, Ladung, Strom, Spannung, Widerstand - wissenschaftliche Schreibweise von Zahlenangaben - physikalische Dimensionen (Volt, Ampere, Siemens, Farad) Literatur Eckert: Tierphysiologie Schmidt, Thews: Physiologie des Menschen Wehner, Gehring: Zoologie Gerthsen, Gneser, Vogel: Physik 11

12 AUFGABE 4 Schallwahrnehmung, Hörphysiologie Vorleistungen Im Eingangskolloquium sind Kenntnisse zum theoretischen Hintergrund der Versuche nachzuweisen, und zwar: a) Grundbegriffe der physikalischen Akustik (z. B. Schallwelle, Schalldruck, Schallintensität, Schallausbreitung in Medien) und das Dezibel-Maß. b) Aufbau und Funktionsweise der drei Abschnitte des Säugetierohres (äußeres Ohr, Mittelohr, Innenohr) c) Erklärung der Form der Hörschwellenkurve des Menschen und des Frequenzumfangs des Gehörs d) Weber-Fechner-Gesetz über die Beziehung zwischen physikalischer Reizstärke und Empfindungsstärke. Was ist die Lautstärke? e) Warum hängt beim Richtungshören die Wahrnehmung von Intensitätsunterschieden zwischen beiden Ohren von der Schallfrequenz ab? f) Benutzen Sie den Laufwegunterschied ( s) zwischen beiden Ohren bei einer von der Seite einfallenden Schallwelle und den Ohrenabstand (d), um den Einfallswinkel (α) der Schallwelle zu berechnen (siehe Skizze). 5.1 Frequenzabhängigkeit und adäquater Reiz der Schallrezeptoren I. Aufgaben a) Messen Sie die Hörschwellenkurve (Abhängigkeit des gerade noch wahrnehmbaren Schalldruckpegels von der Tonfrequenz) beim Menschen binaural. b) Messen Sie die Hörschwellenkurve binaural in Gegenwart von weißem Hintergrundrauschen (maskierte Hörschwelle) II. Versuchsdurchführung Abschwächung versucht, die Hörschwelle des Probanden zu messen. Um Adaptation zu vermeiden, ist im Aufbau ein Pulsformer eingebaut, der den gepulsten Ton nur bei Tastendruck weitergibt. Dadurch kann durch eine kurze Serie von Tonpulsen geprüft werden, ob die Versuchsperson den Ton hört. Ist dies der Fall, so wird die Abschwächung weiter erhöht und erneut geprüft, bis die Versuchsperson den Ton nicht mehr hört. In einer zweiten Meßreihe wird die Hörschwelle bei den Testfrequenzen von unhörbaren (stark abgeschwächten) Tönen durch Verringerung der Abschwächung ermittelt. Jede der beiden Meßreihen (Erhöhung der Abschwächung, Verringerung der Abschwächung) ergibt einen Abschwächungswert, bei dem die Versuchsperson den Ton gerade noch oder gerade erst wahrnimmt. Den Mittelwert aus beiden Werten betrachten wir als gute Annäherung für die tatsächliche Hörschwelle der Versuchsperson. Nach Abschluss der Messung wird ein Diagramm erstellt, auf dessen Abszisse der Logarithmus der Frequenz und auf der Ordinate die Abschwächung in Dezibel (db) aufgetragen wird. Bitte beachten Sie, dass die Abschwächung eine negative Zahl ist! zu Ib) Sie gehen genauso vor wie bei Ia, nur dass jetzt beide Ohren mit weißem Rauschen (was ist das?) belegt werden. Das Rauschen wird zu den Tonpulsen elektronisch addiert. Der Rauschgenerator sollte eine mittlere Lautstärke haben. Das Ergebnis der Messung rauschmaskierter Hörschwellen wird in die gleiche Grafik wie bei Ia) eingetragen. Interpretieren Sie die Unterschiede in der Form der beiden Messkurven Binaurales Richtungshören I. Aufgaben Die Fähigkeit der Wirbeltiere, die Richtung von Schallreizen wahrnehmen zu können, beruht wesentlich auf der Wahrnehmung der Zeitdifferenz zwischen dem Eintreffen der Schallwellenfront auf beiden Ohren und der Intensitätsdifferenz des Schalles an beiden Ohren, wenn der Schall nicht aus der Sagittalebene des Kopfes einfällt. a) Bestimmen Sie die kürzeste, subjektiv wahrnehmbare binaurale Zeitdifferenz. b) Ein Intensitätsunterschied zweier Schallereignisse, die auf je ein Ohr gegeben werden, kann durch Verzögerung des stärkeren Reizes gegenüber dem schwächeren so kompensiert werden, dass beide Reize in der Sagittalebene des Kopfes gleich laut und gleichzeitig erscheinen. Dazu sind Meßreihen aufzunehmen. II. Versuchsdurchführung zu Ia) Die Versuchsperson setzt den Kopfhörer auf. Sie sitzt mit dem Rücken zum Experimentator, so dass sie den Versuchsaufbau nicht einsehen kann. Der Experimentator stellt eine Frequenz am Sinusgenerator ein. Nun wird durch schrittweise Verringerung der Zu IIa) Die Versuchsperson sitzt mit dem Rücken zum Experimentator und führt die Schlauchenden an die Ohren. Der Experimentator verschiebt das Hämmerchen um die Mitte des Schlauches und lässt es dann fallen. Die Versuchsperson gibt an, aus welcher Richtung (links, rechts) sie das Klicken wahrgenommen hat. In einer Tabelle wird der Abstand des Hämmerchens zur Mitte (Skalenablesung) und die Wahrnehmung der Versuchsperson notiert. Wiederholen Sie den Versuch in zufälliger Reihenfolge der Skalenwerte, bis für jeden Skalenwert 6 Messungen vorliegen. Der Abstand von der Mitte, bei dem die Versuchsperson eindeutig links und rechts zuordnen konnte (Verhältnis von richtig : falsch Wahlen von 4:2 oder besser), entspricht der Strecke, um die ein Schallereignis verzögert 12

13 werden muss, um binaurales Richtungshören zu ermöglichen. Berechnen Sie daraus die entsprechende Zeitdifferenz, mit der die Schallereignisse an den Ohren einlaufen und den Winkel α, um den eine Schallquelle aus der Sagittalebene ausgelenkt werden muss, damit sie von der Versuchsperson eindeutig links oder rechts zugeordnet werden kann. Wie sind Abweichungen von den Literaturwerten zu erklären? d = 22 cm = Ohrabstand α = Winkel der virtuellen Schallquelle Nach den drei Versuchsreihen werden drei Grafikin erstellt. Dabei wird die Abszisse linear in ms, die Ordinate linear in db eingeteilt. Die Messpunkte werden dann in dieses Blatt eingetragen, wobei auf der Ordinate das Schallintensitätsverhältnis in db, bestimmt aus den gemessenen Impulsamplituden (Spannung, Q = 20logU/U ref), aufgetragen wird. Interpretieren Sie Ihre Messkurven. Zu Ib) Es steht folgender Versuchsaufbau zur Verfügung (siehe Skizze): Zwei Pulsgeneratoren, an denen die Pulsamplitude unabhängig voneinander eingestellt werden kann. Die Pulse können mit einem Verzögerungsglied um ein einstellbares Zeitintervall gegeneinander verschoben werden. Ein Oszilloskop zur Messung der Amplituden (y 1, y 2) und der Zeitverzögerung ( t) zwischen den Pulsen. Kopfhörer. Impuls von Pulsgenerator 1: Amplitude 40 mv, 60 mv, 80 mv; drei Messreihen; verzögerter Impuls von Pulsgenerator 2: Anfangsamplitude: das doppelte des 1. Impulses; schrittweise um 20 mv steigern, bis ca. 10 Messpunkte aufgenommen sind. Die Dauer beider Impulse sollte ca µs betragen. Die Versuchsperson setzt die Kopfhörer auf. Der Experimentator nimmt die Einstellung vor (am Oszilloskop kontrollieren bzw. messen). Die Versuchsperson stellt dann die Verzögerungszeit so ein, dass das Klicken aus der Mitte (Sagittalebene des Kopfes kommt). Eine gute Kontrolle hierfür: Den Kopfhörer umdrehen, das Geräusch muss dann immer noch in der Mitte sein! Die Verzögerungszeit wird dann vom Oszilloskop abgelesen und ebenso wie die Amplituden der Impulse protokolliert. Dezibel (db) = 20 logp x/p 0 = 10 logi x/i 0 p x = gemessener Schalldruck, p 0 = Referenzschalldruck = 20 µpa; I 0 = Referenzschallintensität =10-12 Watt/m 2 ; I x = gemessene Schallintensität. Der Schalldruck entspricht einer Spannung, die Schallintensität einer Leistung in einem technischen Stromkreis. Literatur: Dudel J, Menzel R, Schmidt RF (Hrsg.) Neurowissenschaft, Kapitel 15 und 16, Springer, 2001 Schmidt, RF (Hrsg.) Neuro- und Sinnesphysiologie Sinnesphysiologie, Heidelberger Taschenbücher, Springer, Schmidt, RF, Schaible NG (Hrsg.) Neuro- und Sinnesphysiologie, Springer,

14 AUFGABE 5 Fortgeleitete Aktionspotentiale einzelner Nervenfasern Der Versuch macht mit wichtigen Fakten der aktiven Erregungsfortleitung bekannt. Als Versuchsobjekt dienen drei Nervenfasern mit besonders großem Durchmesser im Bauchmark (BM) des Regenwurms. Sie werden durch elektrische Reizung erregt, und die dadurch ausgelösten Aktionspotentiale (AP) extrazellulär (als biphasisches AP) abgeleitet, am Oszillographen dargestellt und gemessen. Es sollen dabei folgende Begriffe und Zusammenhänge veranschaulicht werden: -Schwelle und Amplitude von Alles-oder-Nichts-Potentialen (Spikes) -Erregungsfortleitung -Leitungsgeschwindigkeit und Faserdurchmesser -absolute und relative Refraktärzeit 1. Material Bei den drei Nervenfasern handelt es sich um die dorsalen Riesenfasern (RF). Man unterscheidet eine größere, mediane und 2 kleinere, laterale RF. Die beiden lateralen RF reagieren aufgrund von metameren, synaptischen Querverbindungen als physiologische Einheit, d.h. sie feuern gleichzeitig und können deshalb in diesem Präparat nicht getrennt beobachtet werden. Die AP der RF lassen sich auch bei der Ableitung von der Oberfläche des gesamten Regenwurms, ohne weiteres identifizieren, denn obwohl die AP (intrazellulär gemessen) in allen Neuronen mehr oder weniger gleich groß sind, hängt die extrazellulär gemessene Amplitude ganz wesentlich vom Faserdurchmessers, vom Abstand der Elektroden und von der Beschaffenheit des dazwischen liegenden Gewebes ab. Dennoch sind hier die AP der RF vielfach größer, als diejenigen der anderen Neurone des BM. 1.1 Methodik Der Regenwurm wird vor Versuchsdurchführung betäubt (ca. 30 Minuten in 0,2% wässrige Chlorobutanol Lösung) und anschließend in Regenwurm-Ringer aufbewahrt (bei Bedarf kann der Wurm zur Vertiefung der Narkose erneut in Chlorobutanol eingelegt werden. Zu starke Betäubung reduziert die neuronale Aktivität und führt letztlich zum Tod des Wurms. Zu geringe Betäubung erzeugt bei der Messung Artefakte durch Muskelaktivität und durch Änderungen der Ableitbedingungen. Zur Messung (extrazelluläre Ableitung) wird der betäubte Wurm in eine feuchte Versuchswanne gelegt. An deren Boden sind parallele Drähte in regelmäßigem Abstand zueinander als Elektroden angeordnet (s. Skizze). Sie können wahlweise mit dem Reizgerät oder dem Verstärker/Oszillographen verbunden werden, so daß an beliebiger Stelle des BM gereizt bzw. abgeleitet werden kann. Es ist zweckmäßig, den Wurm zwischen den Reiz- und den Ableitelektroden zu erden, dies verringert die durch den Reiz-Puls verursachte Störung (das sog. Reizartefakt). Die Überleitbedingungen vom BM zu den einzelnen Elektroden-Drähten sind in dieser Versuchsanordnung 1. unbekannt und 2. natürlich nicht überall gleich. Deswegen können sowohl Amplitude als auch Form der AP an verschiedenen Ableitorten unterschiedlich sein. Machen Sie sich die Funktion der verwendeten Geräte und die Art ihrer Zusammenschaltung klar (s. Abb.: Versuchsaufbau). Beachten Sie die grundsätzlichen Unterschiede zwischen intra- und extrazellulärer Ableitung von APs. Intrazelluläre Ableitung: Messung der Spannungsdifferenz zwischen Innen- und Außenseite der Zellmembran durch Einstechen einer Micro-Elektrode. Diese Methode liefert absolute Werte, ist jedoch extrem aufwendig und schwierig. Extrazelluläre Ableitung: Messung der Spannungsdifferenz zwischen räumlich getrennten Orten der äußeren Membran. Eine solche Meßanordnung ist relativ einfach, funktioniert jedoch nur dann, wenn die entsprechenden Meßstellen einen (im Hinblick auf die Leitungsgeschwindigkeit) ausreichend großen Abstand voneinander haben. Nur dann ist der Erregungszustand beider Membranbereiche unterschiedlich und kann eine Spannungsdifferenz aufweisen. Hilfreich zum Verständnis eines solchen, biphasischen APs ist dabei ein Gedanken-Experiment. Stellen Sie sich dazu die Passage eines APs über die Membranstrecke zwischen den beiden Meßpunkten A und B vor, wobei das jeweilige Potential an der Stelle B von dem in A abgezogen wird. Die Differenz (A - B) ist zunächst Null, da das (Ruhe-) Potential an beiden Membranpunkten gleich ist. Beim Eintreffen des APs in A, wird dort die Außenseite der Membran negativer, die Differenz erreicht schließlich ein negatives Maximum, nimmt mit zunehmendem Einfluß des APs auf B wieder ab und wird Null, wenn das AP genau zwischen A und B steht. Im weiteren Verlauf wird die Differenz wegen des abnehmenden Einflusses auf A positiv. Wiederholen Sie dieses (Gedanken)Experiment (welches Sie wahrscheinlich erst einmal nur im Kopf durchgeführt haben) und fertigen Sie dazu eine Skizze an, in der die folgenden 5 Ableitsituationen darzustellen sind, wobei das AP von links nach rechts fortgeleitet werden soll: 1.) AP befindet sich weit links von A 2.) AP ist genau über A 3.) AP befindet sich genau zwischen A und B (diese müssen ausreichend weit voneinander entfernt sein :-) 4.) AP ist genau über B 5.) AP befindet sich weit rechts von B und bilden Sie jeweils die Differenz A-B Hilfreich ist hierbei folgende Überlegung: welche Polarität hat die Außenseite der Axonmembran während des Ruhe-, bzw. des Aktionspotentials? 14

15 2. Aufgaben Alle Meßwerte der folgenden Aufgaben sollen in geeigneten Tabellen protokolliert werden. a. Ermittelung von Schwelle und Latenzzeit des Aktionspotentials von medialer und lateraler Riesenfaser Schließen Sie die Reizelektroden so an die Versuchsanordnung an, daß die Kathode (neg. Pol) näher zum Ableitort (Messstelle, bestehend aus 2 Ableitelektroden) liegt als die Anode und geben Sie Einzelreize von 0,1 ms Dauer mit zunehmender Reizstärke bis an der medialen RF ein AP auftritt. Messen Sie mehrmals die Schwelle dieses APs (also die geringste Reizstärke in mv, bei der man gerade noch ein AP auslösen kann) sowie die zugehörige Latenzzeit (Reizreaktionszeit). Wie verhalten sich diese Parameter bei langsamer, kontinuierlicher Erhöhung der Reizstärke über die Schwelle hinaus? Machen Sie sich in diesem Zusammenhang die Aussage der Alles-oder-Nichts-Regel nochmals klar. Wiederholen Sie diese Messung 1. mit geänderter Polung der Reizelektroden und 2. am anderen Ende des Bauchmarks um die Frage zu beantworten, welcher Typ von Synapse die einzelnen (segmentalen) Abschnitte der RF über die gesamte Länge das Wurms hinweg verbindet. Durch weitere, vorsichtige Steigerung der Reizstärke läßt sich schließlich zusätzlich ein AP in den lateralen RF auslösen. Auch hier sind Schwelle, Latenz bei gerade überschwelliger sowie bei stark überschwelliger Reizung zu bestimmen. Welche Unterschiede bestehen zu den Daten für die mediale Faser? Beachten Sie, dass die Narkosetiefe einen Einfluss auf einige der von Ihnen gemessenen Werte haben kann. Das gilt natürlich auch für alle weiteren Messungen. b. Messung der Leitungsgeschwindigkeit beider Riesenfasern Reizen Sie das Bauchmark am Vorderende und Leiten Sie von zwei verschiedenen Stellen simultan ab (dazu werden jeweils 2 Ableitelektroden benötigt). Alternativ dazu kann diese Messung auch nur mit 2 Ableitelektroden durchgeführt werden, deren Abstand dann entsprechend groß sein muss (z.b. wenn der von Ihnen verwendete Wurm relativ kurz ist). Die Leitungsgeschwindigkeit wird errechnet aus der Zeitdifferenz, mit der das AP zwei in einem bestimmten Abstand voneinander gelegene Ableitorte passiert. Ändert sich dieser Wert wenn die Messung gerade überschwellig oder stark überschwellig durchgeführt wird? Warum kann man die Leitungsgeschwindigkeit nicht einfach aus der Latenz errechnen? Wie groß ist jeweils der Teil der Latenzzeit, der nicht auf die Fortleitung entfällt. Gibt es Unterschiede zwischen medialer und lateraler RF? c. relative und absolute Refraktärzeit 15 Reizung am Vorderende, nur ein Ableitort. Das Reizgerät wird auf Doppelreize umgeschaltet: Auf jeden Tastendruck werden dann zwei gleiche, gerade überschwellige Reize kurz hintereinander abgegeben (warum müssen die Reize so schwach wie möglich sein?).

16 Stellen Sie den Abstand dieser Reize auf 50 ms ein. Wie unter a ist die Reizstärke von Null bis zur Schwelle zu erhöhen. Die Faser reagiert zunächst mit je einem AP auf jeden der beiden Reize. Beachten Sie dabei die am Oszillographen eingestellte Zeitablenkung des Strahl-Überlaufs. Verringern Sie den Reizabstand sukzessive (von 50 ms bis 10 ms um 10, von da an um 1 ms). Welche Effekte können Sie beobachten? Woran erkennen Sie das Erreichen der relativen bzw. absoluten Refraktärzeit? Versuchen Sie durch Wählen geeigneter Reizabstände den Beginn der beider Refraktärzeiten exakt zu bestimmen. Berechnen Sie anhand Ihrer Ergebnisse, wieviele APs pro Sekunde maximal übertragen werden könnten. Ändern Sie dann die Einstellung am Reizgerät auf wiederholt gegebene Einzelreize (repeat) und überprüfen Sie die geschätzte Höchstfrequenz indem die Frequenz der kontinuierlich gegebenen Reize erhöht wird. Erhöhen Sie ggfls. die Reizstärke. Welche Frequenz von APs kann unter diesen Bedingungen (Dauerbelastung) maximal übertragen werden. Wie groß ist die so bestimmte dynamische Refraktärzeit? Literatur Eckert: Tierphysiologie Reichert: Neurobiologie Wehner, Gehring: Zoologie Kükenthal, Renner: Leitfaden für das zool. Praktikum Gerthsen, Gneser, Vogel: Physik Stichworte zur Vorbereitung - Bau und Lage des Regenwurm-Bauchmarks - Bau einer typischen Nervenzelle (Vertebraten/Invertebraten) - Zellmembran - Kanäle - Ionen-Verteilung - Ruhe- und Aktionspotential - Erregungsleitung, Refraktärzeit - intrazelluläre und extrazelluläre Messung von Potentialen - Erregungsübertragung an Synapsen. Klären Sie außerdem folgende Begriffe: Spannung, Strom, Widerstand, Kapazität, elektr. Feld, Amplituden- und Frequenzmodulation. Die Fragen in der Versuchsanleitung müssen zum Kolloquium beantwortet werden können. 16