Viren mit doppelsträngigem DNA-Genom

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1 Modrow19.qxd:Modrow :09 Uhr Seite Viren mit doppelsträngigem DNA-Genom Es sind viele Viren mit einem doppelsträngigen DNAGenom bekannt, die Säugetiere infizieren. Sie werden in sieben Virusfamilien eingeteilt: Hepadnaviridae, Polyomaviridae, Papillomaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae und Asfarviridae. Mit Ausnahme der Pox- und Asfarviridae hat man in allen Familien Vertreter gefunden, die in Menschen oder Tieren persistierende Infektionen herbeiführen können. Hepadna-, Polyoma-, Papilloma- und Herpesviren stehen in enger kausaler 19.1 Hepadnaviren Beziehung zu Tumorerkrankungen des Menschen. Dies legt nahe, dass Doppelstrang-DNA-Viren über vielerlei Möglichkeiten verfügen, die Abläufe der Zellteilung zu regulieren und zu beeinflussen. Die Hepadnaviren, die zu Beginn dieses Kapitels besprochen werden, stehen den Retroviren sehr nahe. Viele Details ihres Replikationszyklus weisen darauf hin, dass sie sich im Verlauf der Evolution aus den Retroviren entwickelt haben. Form der Leberentzündung (Hepatitis) wurde ein Virus charakterisiert, das als Genom eine teilweise doppelsträngige DNA enthält. Um dieses Virus von Hepatitisviren mit einem RNA-Genom als Erbinformation abzugrenzen, wurde der Name Hepadnaviren als Abkürzung für Hepatitis-DNA-Viren gebildet. In der Folge entdeckte man bei verschiedenen Wirbeltieren andere Viren mit ähnlicher Struktur und einem doppelsträngigen DNAMolekül. Diese ordnete man ebenfalls in die Familie der Hepadnaviren ein Einteilung und charakteristische Vertreter Die Bezeichnung Hepadnaviren steht für eine Virusfamilie, deren Hauptvertreter das Hepatitis-B-Virus des Menschen ist. Dieses Virus hat auch den Namen der Familie geprägt: Als Erreger der mitunter chronischen Die heute bekannten Hepadnaviren werden in zwei Genera eingeteilt (䉴 Tabelle 19.1): Die Orthohepadnaviren infizieren Säugetiere. Zu ihnen zählt als bekanntestes das Hepatitis-B-Virus, das bei Menschen akute und chronische Formen einer Leberentzündung verursacht. Von diesen Viren sind mehrere Varianten bekannt, die sich in der immunologischen Erkennung der viralen Membranproteine (in ihrer Antigenität) unterscheiden. Ähnliche Viren isolierte man aus verschiedenen Prima-

2 Viren mit doppelsträngigem DNA-Genom Tabelle 19.1 Charakteristische Vertreter der Hepadnaviren Genus Mensch Tier Orthohepadnavirus Hepatitis-B-Virus (HBV) Hepatitis-B-Virus des Erdhörnchens (GSHV) Hepatitis-B-Virus des Waldmurmeltieres (WHV) Hepatitis-B-Virus der Wollaffen (WMHBV) Avihepadnavirus Enten-Hepatitis-B-Virus (DHBV) Reiher-Hepatitis-B-Virus (HHBV) Erläuterung der Abkürzungen: HBV: Hepatitis-B-Virus; DHBV: Duck-Hepatitis-B-Virus; GSHV: Ground-Squirrel-Hepatitis-B-Virus; WHV: Woodchuck- Hepatitis-B-Virus; HHBV: Heron-Hepatitis-B-Virus; WMHBV: Woolly-Monkey-Hepatitis-B-Virus ten (Gorillas, Schimpansen, Gibbons, Urang-Utans), Erdhörnchen und amerikanischen Waldmurmeltieren. Die Hepatitis-B-ähnlichen Viren der Primaten weisen hinsichtlich der DNA-Sequenz ihrer Genome eine sehr große Ähnlichkeit zum humanpathogenen Hepatitis-B- Virus auf. Das zweite Genus, Avihepadnavirus, enthält Virustypen, die Vögel (Enten, Störche und Reiher) infizieren. Sie unterscheiden sich von den Orthohepadnaviren, weil ihnen das Gen für das X-Protein fehlt, ein Nichtstrukturprotein, das vermutlich an der Tumorbildung beteiligt ist. Die tierpathogenen Hepadnaviren sind wichtige Modellsysteme für die Klärung der Pathogenese der Hepatitis-B-Virus-Infektion des Menschen, stellen jedoch aus tiermedizinischer Sicht kein infektiologisches Problem dar. Der Genomaufbau der Hepadnaviren und die Art der Replikation ähneln denen der Caulimoviren, einer Gruppe von Pflanzenviren, deren Partikel im Unterschied zu denen der Hepadnaviren allerdings nicht von einer Hüllmembran umgeben sind. Zu ihnen zählt man unter anderen das Blumenkohl - mosaikvirus (cauliflower mosaic virus) und das Dahlienmosaikvirus (dahlia mosaic virus) Aufbau Viruspartikel Die infektiösen Viruspartikel haben eine sphärische Gestalt mit einem Durchmesser von 42 nm. Bei den Hepatitis-B-Viren bezeichnet man sie auch als Dane- Partikel, nach David S. Dane, der sie 1970 entdeckte. In der aus der Membran des endoplasmatischen Reticulums entstandenen Hüllmembran des Virus sind drei unterschiedlich große Formen (LHBsAg, L = large; MHBsAg M = medium, SHBsAg, S = small) des viralen Oberflächenproteins HBsAg (hepatitis B surface antigen) verankert; sie unterscheiden sich durch unterschiedlich lange Sequenzfolgen an ihren aminoterminalen Enden, die carboxyterminalen Domänen sind hingegen bei allen drei Versionen identisch. Das monoglycosylierte SHBsAg stellt das Hauptoberflächenprotein der infek - tiösen Hepatitis-B-Viruspartikel dar: Pro 100 Moleküle des SHBsAg findet man vom LHBsAg und MHBsAg eine beziehungsweise fünf Einheiten. Bei den Vertretern der Avihepadnaviren fehlt eine dem MHBsAg entsprechende Version des Oberflächenproteins; das Verhältnis zwischen dem SHBsAg und dem LHBsAg entspricht demjenigen des humanen Hepatitis-B-Virus. Die Virushüllmembran umgibt das ikosaedrische Capsid (Durchmesser 22 bis 25 nm). Dieses besteht aus 240 Einheiten des viralen Capsidproteins HBcAg (hepatitis B virus core antigen) und enthält das DNA-Genom. Zusätzlich sind in den Viruspartikeln zelluläre Proteine (Proteinkinasen, Chaperone) nachweisbar. Außer den infektiösen Virionen existieren noch sphärische, 22 nm messende, sowie fadenförmige, filamentöse Vesikel (200 bis 300 nm lang und 22 nm im Durchmesser), die nicht infektiös sind und keine DNA enthalten. Man findet sie in großen Mengen zusammen mit infektiösen Viruspartikeln im Blut von Personen, die akut oder chronisch mit dem Hepatitis-B-Virus infiziert sind. Die sphärischen 22 nm Partikel sie werden auch als Australia-Antigen bezeichnet, weil man sie erstmals in Serumproben von Aborigines fand enthalten fast ausschließlich das SHBsAg und geringe Mengen von MHBsAg, beide zum Teil in glycosylierter Form, die in eine Membran eingelagert sind ( Abbildung 19.1). Die Filamente bestehen aus SHBsAg und MHBsAg. Das LHBsAg ist in den nichtinfektiösen Partikeln nur in sehr geringen Konzentrationen nachweisbar. Genom und Genomaufbau Das Genom der infektiösen Partikel hat einen ungewöhnlichen Aufbau. Es besteht aus einer etwa 3 200

3 19.1 Hepadnaviren q HBsAg-Partikel wurden als Impfstoff verwendet Bei der Entwicklung des ersten Impfstoffes gegen Hepatitis- B-Viren, der Anfang der 1980-iger Jahre auf den Markt kam, nutzte man aus, dass insbesondere bei Personen mit chronischen Infektionsverläufen große Mengen nichtinfektiöser HBsAg-Partikel vorkommen. Man isolierte sie aus Blutspenden von chronisch Hepatitis-B-Virus-infizierten Patienten und reinigte sie. Mit diesen Präparationen wurden vor allem Personen mit einem hohen Infektionsrisiko geimpft (medizinisches Personal, Homosexuelle). Diese produzierten da - raufhin Antikörper gegen HBsAg, die einen Schutz vor der eigentlichen Infektion vermittelten. Einige Jahre später wurde dieser Impfstoff durch die erste gentechnisch hergestellte Vakzine abgelöst, die beim Menschen eingesetzt wurde. Hierbei handelt es sich um partikuläres SHBsAg, isoliert und gereinigt aus rekombinanten Hefezellen. Basenpaaren langen, nur teilweise doppelsträngigen DNA, wobei der sogenannte vollständige Strang nicht geschlossen ist; am 5 -Ende hat er ein Molekül des viralen P-Proteins (auch TP = terminal protein genannt) kovalent gebunden. Der unvollständige Strang umfasst 40 bis 85 Prozent des Genoms. Mit seinem 3 -Ende ist ebenfalls ein Molekül des viralen P-Proteins, hier jedoch nichtkovalent assoziiert ( Abbildung 19.2). Das Genom der Hepatitis-B-Viren besitzt je nach Subtyp zwischen und Basenpaare (3 215 beim Subtyp adr, beziehungsweise bei den Subtypen adw und ayw). Im Dane-Partikel ist nur ein Strang vollständig, und zwar der Negativstrang, der im Infektionsverlauf transkribiert wird. Der kurze DNA- Strang (Plusstrang) umfasst circa bis Basen. Er codiert nicht für virale Genprodukte und wird daher auch nicht transkribiert. Als weitere Besonderheiten weist das Hepadnavirusgenom direkte Wiederholungssequenzen (direct repeats, DR1 und DR2) auf, die eine Länge von je 11 Basenpaaren haben und durch ungefähr 225 Basenpaare voneinander getrennt sind ( Abbildung 19.2). Am 5 -Ende des unvollständigen Stranges befindet sich ein 17 bis 19 Basen langes Oligonucleotid 5 -gecappter RNA, dem die Sequenzen des DR2-Elements folgen. An das 5 -Ende des vollständigen Negativstranges ist das P-Protein gebunden; er endet mit den DR1- Sequenzen. Ungefähr 20 Basenpaare vor dem 3 -Ende des vollständigen Stranges liegt die einzige Consensussequenz für eine Polyadenylierung. Zwischen der Wiederholungseinheit DR1 und dem Poly(A)-Signal befinden sich 60 bis 70 Basenpaare, deren Sequenz derjenigen der U5-Region im LTR-Bereich der Retroviren ähnelt. Allgemein zeigen die Hepadnaviren in einigen Besonderheiten der Se quenz, in der Anordnung der Gene auf der viralen DNA und in der Funktion einzelner Proteine Ähnlichkeiten mit der Familie der Retroviren ( Abschnitt 18.1). Das Genom enthält insgesamt vier offene Leserahmen, die in verschiedenen Leserastern abgelesen werden und sich teilweise überlappen ( Abbildung 19.2). Es handelt sich um den Leserahmen, der für die drei unterschiedlichen Formen des Oberflächenproteins SHBsAg, MHBsAg und LHBsAg codiert, den Leserahmen, der für das Capsid- oder Core-Protein (HBcAg) und das sezernierte Protein HBeAg codiert, den für das P-Protein codierenden Leserahmen sowie den für das sogenannte X-Protein (HBx) codierenden Bereich. Zusätzlich zu diesen Virusgenen gibt es eine Reihe von Kontrollsequenzen für die Regulation der Transkription und den Start der verschiedenen viralen mrna-spezies ( Abbildung 19.2). In vivo wurden bisher drei verschiedene mrna-klassen gefunden. Vermutlich gibt es zu - sätzlich ein viertes Transkript, das 700 Basen umfasst und der Translation des HBx-Proteins dient; unter welchen Bedingungen diese mrna beim Hepatitis-B-Virus produziert wird, ist allerdings unklar. Die Transkripte haben unterschiedliche Startpunkte, enden jedoch alle an dem einzigen im Genom vorhandenen Polyadenylierungssignal. Ein Startpunkt liegt sechs Nucleotide vor der DR1-Einheit. Von hier aus wird eine prägenomische mrna (pgrna) gebildet, die eine Länge von etwa Basen hat, sich über das gesamte Genom erstreckt und am 3 -Ende sogar über einen Bereich von etwa 120 Basen mit den Sequenzen am 5 -Ende überlappt. Von dieser mrna werden das HBcAg und das P-Protein translatiert. Etwa 30 bis 40 Nucleotide vor dem Transkriptionsstart für die pgrna hat man eine weitere Initiationsstelle identifiziert. Bei ihrer Verwendung entsteht eine mrna, die ebenfalls das ganze Genom umfasst und der Synthese des HBeAg dient. Eine zweite

4 Viren mit doppelsträngigem DNA-Genom 19.1 Aufbau und Zusammensetzung der infektiösen und nichtinfektiösen Partikel des Hepatitis-B-Virus. Im oberen Teil der Abbildung ist ein infektiöses Hepatitis-B-Virus dargestellt. Es besteht aus einem teilweise doppelsträngigen DNA-Genom, das mit den Capsidproteinen (HBcAg) zu einem ikosaedrischen Nucleocapsid assoziiert ist. Dieses wird von einer Lipidmembran umhüllt, in welche die Oberflächenproteine SHBsAg, MHBsAg und LHBsAg eingelagert sind. Die durch Zuckergruppen modifizierten Formen der Membranproteine sind rot angegeben, die nicht modifizierten schwarz. Die im unteren Teil der Abbildung dargestellten nichtinfektiösen sphärischen beziehungsweise filamentösen Partikel enthalten keine Virusgenome. Sie sind Membranvesikel, welche die verschiedenen Formen der Oberflächenproteine enthalten. Während man in den sphärischen Partikeln fast nur das SHBsAg findet, enthalten die Filamente auch das MHBsAg und geringe Mengen des LHBsAg. Klasse von mrnas ist Basen lang, beginnt ungefähr 38 Nu c leo tide vor dem Beginn des Leserahmens für das LHBsAg und dient dessen Translation. Die Startpunkte für die dritte mrna-gruppe, mit einer Länge von Basen, die von der Menge her mit Abstand am meisten gebildet wird, liegt in der Region, die für das LHBsAg codiert. Die Transkription kann hier an drei Positionen begonnen werden, die nahe beieinander in der Umgebung des Startcodons für das MHBsAg liegen. Abhängig vom jeweiligen Startpunkt wird von diesen heterogenen mrnas das MHBsAg oder SHBsAg translatiert ( Abbildung 19.3). Die mrnas enthalten in der Basenfolge, die dem Stoppcodon zur Beendigung der Translation der Oberflächenproteine folgt, ein cis-aktives Signal, das als PRE (posttranscriptional regulatory element) bezeichnet wird. Es enthält im Bereich der Basen bis eine stabile Haarnadelschleife, die den Transport der Transkripte aus dem Zellkern in das Cytoplasma fördert. Das PRE-Signal wirkt dabei funktionell ähnlich wie das RRE-Element der Lentiviren ( Abschnitt ), im Unterschied zu diesem binden sich jedoch keine viralen, sondern nur zelluläre Proteine an die RNA-Sekundärstruktur und fördern den Transport der viralen mrnas zu und durch die Kernporen. Eine bei der Transkription aktive Enhancer-Sequenz liegt direkt vor dem X-Gen und damit etwa 450 Basenpaare vor dem Beginn des PräC-Genbereichs. Bei Hepatitis-B-Virussubtypen mit einer sehr langen Form des X- Gens (Subtyp adr) liegt diese Sequenz sogar noch im X-Genabschnitt selbst. In vitro binden sich verschiedene

5 19.1 Hepadnaviren TP P-Protein 19.2 Genomorganisation des Hepatitis-B-Virus (Subtyp ayw). Das Genom liegt in den infektiösen Viruspartikeln als teilweise doppelsträngige DNA vor. An das 5 -Ende des vollständigen, nicht zirkulär geschlossenen Minusstranges, der im Verlauf der Replikation transkribiert wird, ist das P-Protein mittels seiner TP-Domäne kovalent gebunden. Dieses Protein ist identisch mit dem P-Protein, das mit dem 3 -Ende des unvollständigen Plusstranges nicht kovalent assoziiert ist. Am 5 -Ende dieses Stranges befindet sich ein kurzes Stück 5 -gecappter RNA. Im Genom befinden sich zwei wiederholte Sequenzfolgen (DR1 und DR2, direct repeat), ein Signal für die Polyadenylierung der mrnas (Poly(A)), ein Enhancer, der die Synthese der mrna (2,1-kB-RNA) verstärkt, die für das SHBsAg codiert, und ein glucocorticoid response element (GRE), an das sich durch Hormonbindung aktivierte Glucocorticoidrezeptoren binden. Die Lage der offenen Leserahmen und die Produkte, für die sie codieren, sind durch die kompakten Pfeile angedeutet. Bisher konnte man in infizierten Leberzellen drei verschiedene mrnas (3,5-kB-, 2,4-kB-, 2,1-kB-RNA) und ihre Startpunkte identifizieren. Sie sind im äußersten Kreis der Abbildung angegeben und codieren für die unterschiedlichen Virusproteine. Alle enden an der Polyadenylierungssequenz. Daneben gibt es Hinweise für die Existenz einer 0,7-kB-RNA, welche der Translation des X-Proteins dienen soll (nicht eingezeichnet). Im Genom gibt es eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym EcoRI. Eine internationale Übereinkunft regelt, dass das erste Adenin in der Erkennungssequenz als Startpunkt für die Nummerierung der Basen verwendet wird.

6 Viren mit doppelsträngigem DNA-Genom A 1. 3,5-kB-mRNA Position: (Base) AS 183 AS PräHBcAg p25 (membranständig) Abspaltung des Signalpeptids 10 AS 10 AS 183 AS 151 AS PräHBcAg p23 (membranständig) proteolytische Spaltung HBeAg p16 (sezerniert) ,5-kB-RNA Position: (Base) AS HBcAg p22c (Capsidprotein) 19.3 Die Syntheseprodukte der Leserahmen, welche für Core/Capsid- und Oberflächenproteine des Hepatitis-B-Virus (Subtyp ayw) codieren. A: Der Leserahmen Core codiert für unterschiedliche Formen des Capsidproteins HBcAg und des sezernierten HBeAg. Das HBeAg und die mit ihm verwandten Proteine werden von der 3,5 kb langen PräC mrna translatiert (die Zahlenangaben beziehen sich auf die Nucleotidposition im Virusgenom, gerechnet ab der EcoRI-Schnittstelle als Position 1). 29 Codons danach findet man ein weiteres Startcodon, das für die Initiation des HBcAg verwendet wird. Die 29 aminoterminalen Aminosäuren repräsentieren den PräC-Anteil und steuern die Synthese des Proteins am endoplasmatischen Reticulum. Nach Abspaltung des Signalpeptids am aminoterminalen Ende und der carboxyterminalen Domäne entsteht daraus das HBeAg. Das HBcAg wird im Unterschied hierzu von der 3,5 kb langen mrna als 183 Aminosäuren langes Protein translatiert, wobei das Startcodon an Position 1903 für die Initiation benutzt wird (unterer Teil der Abbildung). zelluläre Proteine an diesen Enhancer. Es gibt Hinweise darauf, dass von hier aus speziell in Leberzellen eine verstärkte Transkription der Virusgene gesteuert wird. Im Bereich des für das HBsAg codierenden Gens ist eine 18 Nucleotide lange Region lokalisiert, die der Erkennungsstelle von humanen Glucocorticoidrezeptoren (GRE = glucocorticoid response element) ähnelt. In Anwesenheit von Glucocorticoiden wird die Expression des HBsAg um ungefähr das Fünffache gesteigert Virusproteine HBcAg und HBeAg Das Capsid setzt sich aus den viralen Core-Proteinen (HBcAg) zusammen, die ein Molekulargewicht von 22 kd (p22) besitzen ( Abbildung 19.3A). Das HBcAg wird im Verlauf der Virusreplikation wahrscheinlich durch eine zelluläre Kinase an Serinresten phosphoryliert. Am carboxyterminalen Ende befinden sich basische Aminosäuren, die im Viruspartikel vermutlich eine Verbindung mit dem Genom eingehen. Das HBcAg hat die Eigenschaft, sich in der Zelle zu partikulären Strukturen zusammenzulagern, und es spielt eine wichtige Rolle beim viralen Self-Assembly. Außerdem wird eine carboxyterminal um 32 bis 34 (abhängig vom Virussubtyp) Aminosäuren verkürzte Form des HBcAg (16 kd) gebildet. Ihr fehlen die basischen Aminosäuren, die mit dem Genom interagieren ( Abbildung 19.3A). Dieses als HBeAg bezeichnete Protein ( e steht für early, weil es sehr früh während der Infektion im Blut nachweisbar ist) wird in einer Version synthetisiert, die gegenüber dem HBcAg am aminoterminalen Ende durchschnittlich 29 zusätzliche Aminosäurereste aufweist. Die Translation erfolgt von der

7 19.1 Hepadnaviren B 5 EcoR I 3 2,4-kB-mRNA Position: (Base) PräS1 PräS2 128 AS 55 AS 226 AS gp42 p39 LHBsAg (400 AS) 2,1-kB-mRNAs Position: (Base) 5 EcoR I PräS2 55 AS 226 AS gp36 p33 MHBsAg (281 AS) AS gp27 p24 SHBsAg 19.3 (Fortsetzung) B: Von der 2,4 kb langen mrna wird das LHBsAg translatiert (die Zahlenangaben beziehen sich auf die Nucleotidposition im Virusgenom, gerechnet ab der EcoRI-Schnittstelle als Position 1). Das LHBsAg (p39 beziehungsweise gp42) beginnt an Position und enthält gegenüber dem MHBsAg 128 zusätzliche Aminosäuren am Aminoterminus. Das MHBsAg (p33 beziehungsweise gp36) beginnt mit dem Startcodon an Position 3172 und ist dadurch am aminoterminalen Ende 55 Aminosäuren länger als das SHBsAg. Beide werden von einer Gruppe etwa 2,1 kb langer mrnas translatiert, die heterogene 5 -Enden besitzen (unterer Teil der Abbildung). Bei der Synthese des kleinen SHBsAg wird das Startcodon an Position 155 verwendet; es entsteht ein Protein von 226 Aminosäuren Länge (p24), das teilweise glycosyliert wird (gp27). PräC-mRNA und beginnt an einem Startcodon, das im gleichen Leseraster liegt wie dasjenige des HBcAg ( Abbildung 19.3A). Das entstehende Protein ist da - durch am aminoterminalen Ende gegenüber dem HBcAg um die 29 Aminosäuren des PräC-Anteils verlängert. Dieser in der Länge leicht variable PräC - Anteil dient als Signalpeptid und sorgt dafür, dass die Proteinsynthese an der Membran des endoplasmatischen Reticulums stattfindet; er wird im weiteren Verlauf abgespalten. Das Protein wird durch den Golgi- Apparat an die Zelloberfläche transportiert und von der Zelle abgegeben. Eine Variante des HBeAg findet man in der Zellmembran. Das Protein ist kein Bestandteil der Virionen. Während der Infektion findet es sich im Blut der infizierten Personen. Einen Überblick über Eigenschaften und Funktionen der verschiedenen Virusproteine liefert Tabelle Das Oberflächenprotein HBsAg In die Hüllmembran der Orthohepadnaviren sind drei verschiedene Formen des viralen Glycoproteins HBsAg eingelagert ( Abbildung 19.1): Das Hauptprotein im infektiösen Viruspartikel, die kleine Form SHBsAg, besitzt ein Molekulargewicht von 24 kd (p24) und umfasst 226 Aminosäuren. Ein Teil des SHBsAg ist an einem Asparaginrest (Asn146) glycosyliert (27 kd, gp27). Zusätzlich sind zwei weitere HBsAg-Variationen in die Hüllmembran des Virus eingelagert, die am aminoterminalen Ende über zusätzliche Aminosäurefolgen verfügen. Ansonsten stimmen sie jedoch in ihrer Sequenz mit derjenigen des SHBsAg überein ( Abbildung 19.3B). Man bezeichnet sie als MHBsAg (PräS2- HBsAg, 33 kd) und LHBsAg (PräS1-HBsAg, 39 kd). Im Vergleich zum SHBsAg verfügen MHBsAg und LHBsAg mit ihren PräS2- und PräS1-Domänen über 55 bezie-

8 Viren mit doppelsträngigem DNA-Genom Tabelle 19.2 Eigenschaften und Funktionen der vom Hepatitis-B-Virus codierten Proteine Protein Molekulargewicht Modifikation Funktion SHBsAg 24 kd Oberflächenprotein; Induktion neutralisierender Antikörper; (HBsAg) 27 kd glycosyliert Partikelbildung MHBsAg 33 kd Oberflächenprotein; Induktion neutralisierender Antikörper; (PräS2-HBsAg) 36 kd glycosyliert Bindung an Serumalbumin LHBsAg 39 kd myristyliert, Adsorption an Rezeptor; Induktion neutralisierender (PräS1-HBsAg) 42 kd glycosyliert Antikörper; Oberflächenprotein HBcAg 22 kd phosphoryliert Capsidprotein; Interaktion mit dem Genom; Partikelbildung HBeAg 16 kd sezerniertes Protein; carboxyterminal verkürzte Form des HBcAg; zum geringen Teil membranassoziiert P 90 kd? DNA- und RNA-abhängige DNA-Polymerase (reverse Transkriptase); RNaseH; terminales Protein für die Initiation der Replikation HBx (X-Protein) 17 kd Transaktivator für virale und zelluläre Promotoren; Bindung an Tumorsuppressorprotein p53 und DDB-Protein 1; Stimulation von Proteinkinase C hungsweise über 108 bis 128 zusätzliche Aminosäuren, abhängig vom jeweiligen Genotyp. An Position 4 der PräS2-Domäne befindet sich ein N-Glycosylierungssignal, daneben findet man bei den Genotypen B bis H in der PräS2-Domäne am Threonin 37 O-glycosidisch angefügte Kohlenhydratgruppen. In der glycosylierten Form beträgt das Molekulargewicht des MHBsAg und LHBsAg 36 kd beziehungsweise 42 kd. Die in der PräS1- Domäne vorhandenden Glycosylierungssignale werden nicht verwendet, weil diese Domäne während der Translation im Cytoplasma orientiert ist; die Position 2 des LHBsAg wird jedoch mit Myristinsäure modifiziert. Man nimmt an, dass alle Formen der HBsAg-Proteine vier Transmembranregionen besitzen und dass die amino- und carboxyterminalen Enden beim SHBsAg und MHBsAg an der Partikeloberfläche gelegen sind. Bei 50 Prozent des LHBsAg scheint hingegen die PräS1- Domäne in das Partikelinnere orientiert zu sein. Disulfidbrücken zwischen den SHBsAg-spezifischen Domänen verbinden die Oberflächenproteine sowohl der infektiösen Viren als auch der nichtinfektiösen Partikel kovalent miteinander; man kann sie durch Behandlung mit Detergenzien nicht voneinander lösen. Die HBsAg- Proteine induzieren im Infektionsverlauf eine schützende humorale Immunantwort. Das wichtigste immunogene Epitop ist die Determinante a ; sie wird durch zwei exponierte Domänen des SHBsAg (Aminosäuren ) definiert und induziert die Bildung von neutralisierenden Antikörpern. Hepatitis-B-Virusvarianten, deren Aminosäuresequenzen in diesen Proteindomänen durch Mutationen verändert sind, können den durch aktive und/oder passive Immunisierung induzierten Immunschutz unterlaufen. Derartige HBsAg-Varianten werden in üblichen serologischen Tests oft nicht er - kannt. Bei den Avihepadnaviren fehlt das MHBsAg; SHBsAg und LHBsAg sind im Unterschied zu den Vertretern der Orthohepadnaviren nicht glycosyliert, sondern liegen in phosphorylierter Form vor. Ein weiterer Unterschied ist, dass die Oberflächenproteine beim Enten-Hepatitis-B- Virus nicht mittels Disulfidbrücken miteinander vernetzt sind. Polymerase (P-Protein) In den infektiösen Viruspartikeln ist das P-Protein (Molekulargewicht etwa 90 kd) nichtkovalent mit dem 3 -Ende des unvollständigen DNA-Stranges komplexiert. Das P-Protein kann man in drei Domänen unterteilen: Über einen Tyrosinrest in der aminoterminalen TP-Domäne (terminal protein) ist es kovalent an das 5 - Ende des vollständigen DNA-Stranges gebunden. Bei der Genomreplikation dient das Tyrosin der TP- Domäne als Primer für die Initiation der DNA-Synthese. Der TP-Domäne folgen diejenigen der Polymerase, welche die Aktivität einer reversen Transkriptase, also einer RNA- und DNA-abhängigen DNA-Polymerase besitzt und diejenigen der RNaseH.

9 19.1 Hepadnaviren HBx-Protein Das als Homodimer vorliegende X-Protein (17 kd) der Orthohepadnaviren wird am häufigsten mit deren Fähigkeit zur Induktion von Tumoren in Verbindung gebracht. Das X-Protein findet sich gelegentlich in geringen Mengen in Leberbiopsien von Hepatitis-B- Virus-Infizierten und Patienten mit einem primären hepatozellulären Karzinom. Diese Personen produzieren auch Antikörper gegen das HBx-Protein. Wird es in der Leber von transgenen Mäusen exprimiert, so induziert es Hepatome. Beim Hepatitis-B-Virus der Waldmurmeltiere ist es auch für deren Infektiosität in vivo notwendig. Das HBx-Protein wirkt als Transaktivator der viralen und einer großen Zahl verschiedener zellulärer Promotoren. Es bindet sich dabei nicht selbst an die DNA der Promotoren, sondern verstärkt deren Funktion indirekt durch Wechselwirkung mit zellulären Transaktivatoren, vor allem den Mitgliedern der CREBund ATF-Familien und generellen Transkriptionsfaktoren wie dem TBP (TATA-box-binding-protein). Des Weiteren bindet sich das X-Protein über seine carboxyterminale Domäne an das p53-tumorsuppressorprotein und hemmt dessen Transaktivatorfunktion. Dadurch unterbleibt die Expression der p53-abhängigen Gene, die bevorzugt an DNA-Reparaturvorgängen, an der Regulation des Zellzyklus sowie an der Einleitung der Apoptose beteiligt sind ( Kapitel 6). Das X-Protein verhält sich funktionell also ähnlich wie das T-Antigen von SV40 ( Abschnitt ), das E6-Protein der humanen Papillomviren ( Abschnitt ) und das E1B-Protein der Adenoviren ( Abschnitt ): Alle beeinflussen wenn auch auf unterschiedliche Weise die Funktion des p53 und induzieren so die Zellteilung. Auch fand man, dass das X-Protein mit dem UV-DDB- Protein (ultraviolet-damaged DNA-binding-protein) interagiert. Dieses zelluläre Protein ist eine Komponente des Exzisionsreparatursystems zum Herausschneiden von fehlerhaft gepaarten Basenabschnitten, wie sie beispielsweise durch ultraviolette Strahlen hervorgerufen werden. Man diskutiert unter anderem auch über eine direkte Wechselwirkung mit den unterschiedlichen Zellkomponenten sowie die Aktivierung der Proteinkinase C und der mit dieser Kinase verbundenen Signalkaskade, wodurch die Aktivität verschiedener Transkriptionsfaktoren beeinflusst werden kann. Andere Daten zeigen, dass das HBx-Protein über reaktive Sauerstoffintermediate den Transaktivator NFκB aktiviert und dass es die Aktivität der CDK2-Kinasen und über sie auch die Zellzyklusrate steigert Replikation Das Enten-Hepatitis-B-Virus bindet sich über die PräS1-Domäne des LHBsAg an eine membranständige Form der Carboxypeptidase D (gp180) als zellulären Rezeptor. Die Aufnahme der Viruspartikel erfolgt im nächsten Schritt mittels rezeptorvermittelter Endocytose, für ihre Freisetzung ist jedoch die Ansäuerung des Endosomeninhalts nicht notwendig. Ähnliche Aufnahmemechanismen vermutet man auch für das hu man - pathogene Hepatitis-B-Virus. Der zelluläre Rezeptor konnte noch nicht endgültig identifiziert werden, jedoch scheinen auch hier die aminoterminalen PräS1-Domänen des LHBsAg für die Adsorption verantwortlich zu sein. Als mögliche Interaktionspartner wurden unter anderem Annexin V (früher bekannt als Endonexin II), der Asialoglycoproteinrezeptor und ein membranständiger Serin-Protease-Inhibitor beschrieben. Möglicherweise wird die Anheftung zusätzlich über Serumalbumin vermittelt, das sich an die PräS2-Sequenzen des MHBsAg und an einen Rezeptor auf Hepatocyten bindet. Die Serumalbuminbindung wird auch für Autoimmunmechanismen verantwortlich gemacht, die oft in Assoziation mit der Hepatitis-B-Virusinfektion auftreten. Man vermutet, dass sich das Serumalbumin durch die Wechselwirkung mit den Viruspartikeln geringfügig in seiner Struktur verändert und dadurch als Fremdantigen angesehen wird. Abbildung 19.4 veranschaulicht den Weg, den Hepatitis-B-Viren in der infizierten Zelle nehmen. Nach Eintritt in die Zelle werden die Capside mit dem in ihnen enthaltenen Virusgenom entlang der Microtubuli zu den Kernporen transportiert; verantwortlich ist hierfür ein Kernlokaliserungssignal in der aminoterminalen Do - mäne des Capsidproteins HBcAg und dessen Wechselwirkung mit den Kernimportrezeptoren Importin α und β. An den Kernporen findet die Freisetzung der nicht - kovalent geschlossenen Virusgenome (rcdna, relaxed circular DNA) statt, die im weiteren Verlauf in den Kern gelangen. Der unvollständige DNA-Strang wird nun durch die mit ihm assoziierte Polymeraseaktivität des P- Proteins zum Doppelstrang ergänzt. Dabei wird das 5 - gecappte RNA-Oligonucleotid abgebaut, das TP-Protein entfernt und die Lücke geschlossen. So entsteht ein zirkulär geschlossener DNA-Doppel strang (cccdna, covalently closed circular DNA), der mit Histonproteinen zu Nucleosomen assoziiert in superhelikaler Struktur vorliegt. In seltenen Einzelfällen werden in dieser Infektionsphase das komplette Hepatitis-B-Virusgenom oder Teile davon in das Zellgenom integriert. Im Kern erfolgt die Transkription des episomalen Virusgenoms durch die zelluläre RNA-Polymerase II.

10 Viren mit doppelsträngigem DNA-Genom P-Protein RNA-Polymerase II Synthese am ER PräC, Core P-Protein LHBsAg MHBsAg SHBsAg 0,7 X-Protein 19.4 Der Verlauf der Replikation des Hepatitis-B-Virus in einer Zelle. 1. Adsorption. 2. Rezeptorvermittelte Endocytose. 3. Transport des viralen Capsids zu den Kernporen und Transport des viralen DNA-Genoms (rcdna) in den Kern. 4. Vervollständigung zur zirkulär geschlossenen, supercoiled DNA (cccdna). 5. Transkription. 6. Export der verschiedenen mrna- Spezies aus dem Zellkern in das Cytoplasma. 7. Translation der mrna: HBsAg und HBeAg am endoplasmatischen Reticulum mit anschließendem Transport über den Golgi-Apparat; HBcAg, Polymerase und X-Protein an freien Ribosomen im Cytoplasma. 8. Verwendung der 3,5 kb langen pgrna als Prägenom. 9. Initiation der Synthese des DNA-Stranges durch die virale Polymerase (Priming durch das P-Protein). 10. Abbau des RNA-Anteils im Hybrid durch die RNase-H-Aktivität des P-Proteins. 11. Beginn der Synthese des Doppelstranges der viralen DNA nach Primer-Transfer. 12. Aggregation des HBcAg. 13. Verpacken des unvollständigen Genoms mit den HBcAg-Aggregaten. 14. und 15. Freisetzung des infektiösen Partikels, das am endoplasmatischen Reticulum mit der HBsAg-haltigen Membran umgeben wird.