REGlOSELEKTIVE REKONSTITUIERUNG VON VITAMIN B12 DURCH NUKLEOTIDIERUNG VON COBYRINSÄURE-HEPTAKIS(CYANMETHYL)ESTER

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1 Diss. ETH Nr REGlOSELEKTIVE REKONSTITUIERUNG VON VITAMIN B12 DURCH NUKLEOTIDIERUNG VON COBYRINSÄURE-HEPTAKIS(CYANMETHYL)ESTER ABHANDLUNG zur Erlangung des Titels DOKTOR DER NATURWISSENSCHAFTEN der EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE ZÜRICH vorgelegt von FRITZ KREPPELT dip!. Chern, der Universitöt Basel geboren am 6. November 1958 von Basel Angenommen auf Antrag von Prof. Dr. A. Eschenmoser. Referent Prof. Dr. D. Arigon i. Korreferent Zürich 1991

2 VII ZUSAMMENFASSUNG Im Rahmen umfassender Arbeiten zur chemischen Rationalisierung der Struktur von Vitamin B12 wird gezeigt, dass die Umsetzung von einem an den 7 Seitenketten undifferenzierten Corrinderivat mit der freien Nukleotidkomponente und anschliessender Ammonolyse zur regioselektiven Bildung von Vitamin B12 führt.* Zur Herstellung des an allen 7 Seitenketten gleich funktionalisierten Corrinderivats (Acetato-cyano-cobyrinsäure-heptakis(cyanmethyl)ester 6A/B) diente Cobyrinsäure-heptamethylester 3, der durch Methanolyse von Vitamin B12 1 gut zugänglich ist. Die durch Hydrolyse von 'Cobester' 3 am Kationentauscher Dowex 50W erhaltene Cobyrinsäure 4 wurde mit Jodacetonitril zu Dicyano-cobyrinsäure-heptakis(cyanmethyl)ester 5 alkyliert. Durch Acetolyse (AcOH/Wasser) des gegenüber Nukleotidierung unreaktiven Dicyano-komplexes 5 erhielt man den reaktiven Acetatocyano-Komplex 6A/B als a/ß-diastereomerengemisch. Die beiden diastereomeren Acetato-Cyano-Komplexe 6A und 6B konnten ehrematographisch getrennt werden. Die verwendete Nukleotidkomponente 2 wurde aus Vitamin B12 in einem Schritt durch Hydrazinolyse gewonnen. Die selektive Nukleotidierung besteht im Stehenlassen des Corrinderivats (sowohl als a/ß-diasteromerengemisch 6A/B als auch als getrennte Diastereomeren 6A und 6B) zusammen mit der Nukleotidkomponente 2 in einem THF/2,4-Pentandiol-Gemisch bei Raumtemperatur während 7-13 Tagen. Aus solchen entweder durch Ammonolyse oder Methanolyse aufgearbeiten Gemischen konnten Vitamin B12 1 resp. Vitamin B12-hexamethylester 16 in Ausbeuten bis gut 40% (in kristalliner Form) isoliert werden. Die Bildung von unnatürlichen Regioisomeren, bei welchen die Nukleotidschleife nicht über die f-seitenkette sondern über eine der anderen Seitenketten (0-, b-, C-, d-, e- oder g-) verläuft, trat (falls überhaupt) nur in unbedeutendem Mass auf. Für die 4 isomeren (f-, e-, d und b-) Vitamin B12-hexamethylester wurde HPL-chromatographisch ein Verhältnis von ca. 30: 1: 1: 1 abgeschätzt. Einen Nachweis durch Isolierung der unnatürlichen Isomeren konnte man wegen zu geringen Substanzmengen nicht erbringen. Bei Nukleotidierungsreaktionen mit den diastereomeren Acetoto Cyano-Komplexen 6A und 6B wurde in beiden Fällen die Bildung von * Diese Arbeit fasst neben eigenen Arbeiten auch die von R.NUSSBERGER und G.BARTELS zusammen.

3 VIII Vitamin B12 1 beobachtet, jedoch in unterschiedlichem Ausmass (290k mit 6A gegenüber 17% mit 68). Die erstaunliche Regioselektivität der Nukleotidierungsreaktion gab Anlass zu einer qualitativen Konformationsanalyse der über die f-seitenkette verlaufenden Nukleotidschleife in Vitamin B12. Diese umfassende, von Hand durchgeführte Analyse berücksichtigt für sämtliche 9 untersuchten Einfachbindungen je 3 Konformationen, entsprechend ideal gestaffelten Anordnungen, und gebraucht als hauptsächliches Ausschlusskriterium das Vermeiden von "1,5-Repulsionen". Die Analyse führt zur Einsicht, dass von 19'683 (=39) formal möglichen Konformationen nur deren 16 sterisch am wenigsten behindert sind. Diese Konformationen sind allesamt nicht cyclisch und weisen infolge der zweifach sekundär gebundenen Phosphatgruppe zwei 0 bligate "l,5-repulsionen" auf. Eine Verfeinerung der Analyse durch partielle Entstaffelung dieser beiden Bindungen im Phosphatbereich ergibt 12 sterisch bevorzugte (entidealisierte) Konformationen, von denen nunmehr zwei eine "q ua sicyclische" Struktur aufweisen. Die beiden "quasi-cyclischen" Konformationen der Nukleotidschleife unterscheiden sich nur in einer vertauschten Anordnung des Amidbezirks und erweisen sich im Konformationstyp als identisch mit der Konformation, wie sie nach zahlreichen Röntgenstrukturanalysen in Vitamin B12 vorkommt. Dieses Resultat kommt einer qualitativen De-utung der Konformation der Nukleotidschleife in Vitamin B12 gleich. b ~ d Verbindung fa 68 Seitenketten 0 - g alle CON~, ausser f * alle C~CH3' ausser f* allec~ch3 alle COOH axiale Liganden X y CN /H 2 0 CN AcO AcO CN f * Carboxylgruppe amidisch mit Nukleotid 2 verknüpft 2** komplexlert mit Benzimidazolstickstoff des gebundenen Nukleotldes 2

4 IX SUMMARY As part or a greater effort aimed at providing a chemical rationalization for the structure of vitamin B12, it has been shown that the reaction of the free nucleotide with a corrin derivative containing 7 undifferentiated side chains followed by ammonolysis leads virtually exclusive to the formation of vitamin B12.* Cobyrinic acid heptamethyl ester 3, readily available by methanolysis of vitamin B12, was the starting material for the preparation of the side choln undifferentiated corrin derivative 6A/B. Hydrolysis of3 with the cation exchange resin, Dowex SOW, gave cobyrinic acid 4 whlch was converted to the heptakis(cyanomethyl) ester of cobyrinic acid 5 by treatment with iodoacetonitrile. The dicyano complex 5 which is inert toward reaction with nucleotide 2 was converted to the more reactive acetato-cyano complex 6A/B by acetolysis (AcOH/H20). This complex existed as a mixture of diastereoisomers 6A/B which were separable by chromatography. The nucleotide component 2 was prepared by hydrazinolysis of vitamin B12 in a single step. Selective formation of the vitamin was achieved by allowing a mixture of corrin derivative (as mixture of 6A/B or as pure isomers 6A or 6B) and the nucleotide component 2 to stand in THF/2,4-pentane-diol at room temperature for 7-13 days. Work up of the reaction mixture either with ammonia or methanol led respectively to vitamin B12 1 or its hexamethyl ester analog 16 in isolated yields of up to 40% (crystalline). The unnatural regioisomers in which the nucleotide is connected to one of the other side chains (0-, b-, C-, a-, e- or g-) were tormed. if at oll. to an insignificant extent. HPLC analysis ot a crude methanolysed reaction mixture revealed four components which corresponded to reference sampies for the f-, e-, d- and b- isomers in approx. 30: 1 : 1 : 1 ratio respectively. Due to the small amounts formed an isolation of the unnatural isomers and definitive structural assignment was not possible. Pure 6A or pure 6B both yield vitamin B12 upon reaction with the nucleotide 2 but in somewhat different yields (29%vs. 17%). The remarkable regioselectivity of the nucleotide coupling reaction provided occasion for a qualitative conformation analysis of the nucleotide loop in vitamin B12. In this "hand performed" analysis three ideal staggered conformations were considered for nine single bonds of * This wor\< also includes studies pertorrneo by R.NUSSBfRGfRand G.BARTfLS.

5 x the nucleotide loop. By minimizing the number of repulsive 1,5 interactions the initial 19'683 (=3 9 ) possible conformations could be reduced to 16 least hindered conformations. None of these, however, showed cyclic structure. As a result of the two secondary phosphate ester functions two 1,5 repulsions are obligatory in each of these favorable conformations. In a refinement of the analysis the two phosphate ester bonds were ollowed to deviate from the staggered geometry leading to 12 sterically favored conformations. Two of these displayed 0 "quasi cyclic" structure. These two conformations ot the nucleotide loop differ only in their constellation around the trans amide bond. One of those conformations is in fact identical to that observed in numerous x-rov structures ot vitamin B12. Ihus. in a qualitative manner the conformation of the nucleotide loop in vitamin B12 has been rationalized. compound fa 6B slde eheins 0 - g oll CONH 2, except f* oll C~CH3' except f* oll CO:zCHa ollcooh oll CO:zCH2CN oll CO:zCH2CN 0IlC~CH2CN axial ligands X y CN CN CN /H 20 CN AcO AcO CN f * corboxomlde with nucleotide2 2** complexed wlth benzimidozole nitrogen ot bound nucleotide 2