Wann sind Mikroorganismen wirklich tot?

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1 Wann sind Mikroorganismen wirklich tot? Hans-Curt Flemming und Jost Wingender IWW Zentrum Wasser, Universität Duisburg-Essen 1

2 g1 Sind Mikroorganismen unsterblich? van Leeuwenhoek im Jahre 1684: Aus meinen Beobachtungen schloss ich, dass der Essig, mit dem ich meine Zähne putze, nur diese Tiere tötet, die an der Außenseite des Schorfs sind, aber er drang nicht in die Tiefe des ganzen Materials ein 2

3 Folie 2 g1 It has long been recognized that the deposits we now refer to as plaque provide a barrier to many strong chemicals medical microbiologists studying human disease later realized that capsules served as barriers to components of the immune system. The interactions have proven to be very complex and research in this area continues at a high pace. gill geesey;

4 Wiederauferstehung von Mikroorganismen Lazaro Spallanzani, Professor für Physik und Naturphilosophie in Bologna, Rom, St. Petersburg u.a. (1776): Animalcula [Kleinstlebewesen] können durch völlige Austrocknung, erhöhte Temperatur, elektrischen Schock, Behandlung mit verschiedensten Chemikalien getötet werden und anschließend wieder auferstehen Christian Gottfried Ehrenberg, Professor für Mikropaläontologie und Mykologie in Berlin (1838): Das beruht nicht auf Wiederauferstehung, sondern auf einer extreme Verlangsamung von Lebensprozessen Anabiosis (Wilhelm Preyer, 1872): Phänomen der Wiederbelebung von Mikroorganismen Cryptobiosis = verstecktes Leben (Keilin (1959) 3

5 Desinfektion, Sterilisation, Inaktivierung Tod? Desinfektion : Totes oder lebendes Material in einen Zustand versetzen, dass es nicht mehr infizieren kann (Def. nach DAB) Technisch unterscheidet man zwischen Desinfektion und Sterilisation Desinfektion: Reduktion von Krankheitserregern um fünf Log-Stufen, soll heißen: von ursprünglich vermehrungsfähigen Keimen (sogenannte koloniebildende Einheiten, KBE) überlebt nicht mehr als ein Einziger. Sterilisation: Irreversible Inaktivierung (Abtrennung, Abtötung) aller Mikroorganismen, sowie Inaktivierung von Viren, Plasmiden und DNS-Fragmenten, die sich an einem Produkt oder Gegenstand befinden Ab sechs Logstufen Abnahme wird von Sterilisation gesprochen das bedeutet, dass es Überlebende geben kann! Inaktivierung: praktisch (!) vollständige Zerstörung der biologischen Aktivität von Mikroorganismen und biologischen Agentien (CEN 12740) 4

6 Zeichen für Lebensfähigkeit: Koloniebildung Kolonie (KBE) Nur voll lebensfähige Zellen bilden Kolonien Kultivierung ist der Gold-Standard der Überwachung von Wasser, Lebensmitteln etc. Gesamtzellzahl: DNA-spezifischer Farbstoff, aber keine Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen. Ergibt maximale Zahl der Organismen in einer Probe Tot? Inaktiv? Haben keine Kolonie gebildet Zwischen den Kolonien 5 G. Tuschewitzki

7 Wann sind Mikroorganismen wirklich tot? Tote Bakterien befinden sich in einem irreversiblen Zustand des Zerfalls sowohl der Zellstrukturen (Lysis) als auch der metabolischen Funktionen Der Nachweis des Zelltods hängt ausschließlich von der Methode ab, die dafür verwendet wird Entscheidender Parameter: Verlust der Kultivierbarkeit Hat sich in der Praxis vielfach und lange bewährt Aber: Kulturmethode kann bei hartnäckigen Problemen an ihre Grenzen geraten, um Kontaminations- bzw. Infektionsquelle zu identifizieren Heute stehen aber neue Methoden zur Verfügung, mit denen Kulturmethoden sinnvoll zu ergänzen sind 6

8 Grenzen der Kultivierbarkeit Was wir mit Kulturmethoden finden Was wir nicht finden, weil die Organismen nicht wachsen, denn sie brauchen: - andere Nährstoffe - andere Bedingungen (ph, T) - andere Bakterien - sehr lange Zeit zum Wachsen Oder sie sind geschädigt Diese Organismen sind nicht tot, sondern können sich wieder erholen 7

9 Wie viele Bakterien sind überhaupt in einer Probe? Gesamtzellzahl: DNA-spez. Farbstoff DAPI - (4,6-Diamidino-2-phenylindol) Maximale Zellzahl aber: keine Unterscheidung tot/lebend 8

10 Verhältnis Gesamtzellzahl : KBE Probenahmestelle Besiedlung (Zellen pro cm 2 ) Anteil kultivierbarer Bakterien (%) Trinkwasser-Rohre (2-99 Jahre) 4,1 x 10 5 bis 2,0 x ,0004 bis 3,4 weichdichtende Schieber (3 Wochen - 4 Jahre) gibt abbaubare Komponenten ab (Weichmacher etc.) 2,7 x 10 6 bis 1,8 x bis fast 100 Unter oligotrophen Bedingungen: sehr geringer Anteil kultivierbar Unter nährstoffreicheren Bedingungen: bis zu 100 % Verhältnis GZ:KBE gibt Hinweis auf Ernährungszustand! 9

11 Lebenszeichen (1): Membran-Integrität Live/Dead-Färbung ( BacLight ) SYTO 9 (bindet an DNA und färbt Zellen grün) Propidiumjodid kann nur durch defekte Membranen eindringen, bindet an DNA und färbt Zellen rot Propidiumjodid Micrococcus luteus und Bacillus cereus 10

12 Lebenszeichen (2): Atmungs-Aktivität Nachweis durch Redox-Reaktion eines fluoreszierenden Tetrazolium-Salzes Beispiel: CTC (Elektronenakzeptor, farblos im oxidierten, fluoreszierend im reduzierten Zustand) DAPI: alle Zellen CTC: Anteil der atmendenden Zellen Gleiches Gesichtsfeld Bilder: G. Schaule 11

13 Lebenszeichen (3): Zellverlängerung Zellen können zwar wachsen, aber sie teilen sich nicht Pipemidinsäure Gram-negative Zellen (DAPI-Färbung) in einem Biofilm (Kogure et al. 1979; Rumpf & Schaule, 2008) 12

14 Lebenszeichen (4): Enzymaktivität Fluoesceindiacetat (FDA, löslich, farblos) wird von intrazellulären Esterasen hydrolysiert Hydrolyse-Produkt: unlösliche Fluorescein-Kristalle, fallen am Ort der Reaktion aus, wo das Enzym aktiv wurde Aber: FDA kann auch abiotisch hydrolysiert werden Stabiler: Fluoresceindibutyrat Wird für Aktivitätsbestimmung in Umweltproben verwendet FDA & FDB sind nicht-spezifische Substrate für eine Reihe hydrolytischer Enzyme, Reaktion dient als Summenparameter O H 3 C-C-O Fluoresceindiacetat Farblos, wasserlöslich O O-C-CH 3 Fluorescein unlöslich, fluoresziert Esterase + 2 CH 3 COOH 13

15 Lebenszeichen (5): Proteinsynthese Fluoreszenz-in situ-hybridisierung (FISH) DAPI (Gesamtzellzahl) Gen-Sonde (FISH-Färbung) Spezifisch für 16S rrna, also: Proteinsynthese Spezifischer, kulturunabhängiger Nachweis von Bakterien auf Art, Gattungs- und Großgruppenebene Beruht auf Bindung der Sonde an rrna Nachweis von Bakterien im VBNC-Stadium möglich 16S rrna ist Vitalitätsmarker Zellen, die Protein synthetisieren, sind nicht tot! 14

16 Persistenz: P. aeruginosa kulturell und mit FISH P. aeruginosa AdS, Isolat aus einem Schadensfall im Biofilm (EPDM, W270) kulturell auf CN-Agar FISH (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung), Gensonde Psae16S ,0E+05 P. aeruginosa (KBE bzw. Zellen/cm²) 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,0E kulturell FISH Zeit nach Beimpfung (d) Hinweis auf Persistenz von P. aeruginosa im Trinkwasser-Biofilm auf EPDM in nicht-kultivierbarem Zustand (VBNC)! 15

17 Lebensfähig, aber nicht kultivierbar (VBNC) VBNC = Viable but not culturable GZ KBE Zellen, die nicht tot sind, aber auch nicht unter den üblichen Bedingungen kultivierbar Können, aber müssen nicht geschädigt sein Bakterien im VBNC-Zustand wachsen nicht auf den üblichen mikrobiologischen Nährmedien, auf denen sie normalerweise nachgewiesen werden! In diesem Zustand weisen sie niedrige Stoffwechselaktivität auf, können sich u.u. aber erholen und sind dann erneut kultivierbar auch infektiös? 16

18 Stress löst Übergang in VBNC-Zustand aus Mögliche Stressfaktoren - Desinfektionsmittel - Temperaturschock - ph-schock - UV-Strahlung - radioaktive Strahlung - Schwermetall-Exposition - Antibiotika-Wirkung Folge von Stress: Kultivierung nur noch auf Spezialmedien möglich Geschädigte Zellen können sich durch Reparaturmechanismen auf molekularer Ebene wieder erholen. Konventionelle mikrobiologische Kulturverfahren unterscheiden nicht zwischen toten und geschädigten Zellen. McFeters & LeChevallier,

19 VBNC-Zustand von Pathogenen Beispiele für VBNC-Zustand von trinkwasserrelevanten Krankheitserregen Organismus Legionella pneumophila Pseudomonas aeruginosa Bedingungen zur Auslösung des VBNC-Zustands Längerer Aufenthalt im Trinkwasser (Wasserphase und Biofilm), Hitzeschock (z.b. 70 C, 30 min), Chlor (z.b. 0.5 mg/l) Relativ wenig bekannt; eigene Untersuchungen: Aufenthalt im Biofilm, Anwesenheit von Kupferionen (z.b. 60 µg/l) Wiederbelebung Durch Wachstum in Amöben z.b.: Aufhebung von Kupfer-Stress 18

20 Beispiel: Cu 2+ (0,6 mg/l) als Auslöser für VBNC-Zustand bei Pseudomonas aeruginosa 1.0E E+006 Gesamtzellzahl ~ 10 6 Zellen/mL 1.0E+005 cfu/ml 1.0E E E E+001 n.n. 1.0E+000 P.a. P. a. + DDTC P. a. + Cu 10 µm P.a. + Cu 10 µm + DDTC 0 h 24 h 3 d 7 d 14 d Cu 2+ -induzierte Inaktivierung von P. aeruginosa konnte durch Kupfer- Chelator DDTC (Na-Diethyldithiocarbamat) aufgehoben werden Völlige Wiederherstellung der Kultivierbarkeit nach 14 Tagen Cu 2+ -Ionen induzieren reversiblen VBNC-Zustand in P. aeruginosa Dr. Jost Wingender

21 Sind VBNC-Zellen nach Wiederbelebung auch wieder infektiös? 120% P.a. 100% P. a. + DDTC P. a. + Cu 10 µm % vital CHO cells 80% 60% 40% P.a. + Cu 10 µm + DDTC 20% 0% Exposition [h] P. aeruginosa inaktiviert (Cu µm): CHO-Zellen nicht geschädigt Cu 2+ -Chelator DDTC hebt Inaktivierung von P. aeruginosa auf Infektiosität wieder hergestellt Kooperationsprojekt mit PD Dr. Elke Dopp, Institut für Hygiene und Arbeitsmedizin, Klinikum der Universität Duisburg-Essen 20

22 Hygienisch relevante Bakterien mit VBNC-Stadium: alle im Wasser vorkommenden Organismen Aeromonas salmonicida Lactobacillus plantarum Serratia marcescens Agrobacterium tumefaciens Lactococcus lactis Shigella dysenteriae Alcaligenes eutrophus Legionella pneumophila S. flexneri Aquaspirillum sp. Listeria monocytogenes S. sonnei Burkholderia cepacia Micrococcus flavus Sinorhizobium meliloti B. pseudomallei M. luteus Streptococcus faecalis Campylobacter coli M. varians Tenacibaculum sp. C. jejuni Mycobacterium tuberculosis Vibrio anguillarum C. lari M. smegmatis V. campbellii Cytophaga allerginae Pseudomonas aeruginosa V. cholerae Enterobacter aerogenes P. fluorescens V. fischeri E. cloacae P. putida V. harveyi Enterococcus faecalis P. syringae V. mimicus E. hirae Ralstonia solanacearum V. natriegens E. faecium Rhizobium leguminosarum V. parahaemolyticus Escherichia coli (including EHEC) R. meliloti V. proteolytica Francisella tularensis Rhodococcus rhodochrous V. shiloi Helicobacter pylori V. vulnificus (types 1&2) Klebsiella aerogenes S. Typhi Xanthomonas campestris K. pneumoniae S. Typhimurium K. planticola Pasteurella piscida (Oliver, 2005) Ursula Obst, Christina Jungfer, Thomas Schwartz, ITC-WGT, Abt. Umweltmikrobiologie

23 VBNC-Zustand: Erkennung und Management! Auf üblichen Nährmedien (wieder) kultivierbar Welche Faktoren lösen VBNC-Zustand aus? Nährstoffmangel Veränderte Umgebungstemperaturen Stressfaktoren wie Hitze, Desinfektionsmittel, toxische Metallionen Welche Faktoren führen zur Wiederbelebung aus dem VBNC-Zustand? Günstige Nährstoffbedingungen Temperaturerhöhung Eliminierung/Neutralisierung von Stressfaktoren Auf üblichen Nährmedien nicht mehr kultivierbar, aber noch lebend. Dieser VBNC-Zustand ist reversibel ("Wiederkultivierung" der Bakterien ist möglich). 22

24 Methoden zur Erkennung von VBNC- Bakterien existieren! Verfügbar für kritische Fälle: Ergänzung der Kultivierungs-Verfahren durch moderne Methoden, z.b.: Gesamtzellzahl-Bestimmung (Epifluoreszenz-Mikroskp.) Membran-Integrität ( live/dead -System) Zellverlängerung ( direct viable count ) Enzymatische Aktivität (Fluoresceindiacetat/butyrat) Proteinsynthese (FISH) Fettsäure-Analyse ( intact polar membrane lipids ) Bei Kontaminationen könnte es sich oft um Wiederbelebung von VBNC-Organismen handeln Forschungsbedarf: Faktoren, die VBNC-Zustand auslösen bzw. revidieren beeinflussen durch Management! 23