Labormethoden. Versuch 1: Messgenauigkeit beim Pipettieren und Wiegen

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1 Labormethoden Einführung Mit den Versuchen an diesem ersten Praktikumstag sollen Sie wichtige Methoden wiederholen bzw. ergänzen, die Sie bereits im Chemischen Praktikum kennengelernt haben. Diese Fertigkeiten werden Sie in den folgenden Praktikumsversuchen immer wieder benötigen. Methoden zum Abmessen von Feststoffen: Wägung Methoden zum Abmessen von Flüssigkeiten: Pipettieren mit Mikroliterpipetten Herstellung von Lösungen definierter Zusammensetzung: Ansetzen von Lösungen und Puffern, Herstellen von Verdünnungsreihen, Konzentrationsberechnungen Analyse charakteristischer Eigenschaften von Lösungen: Messung des ph-wertes, Bestimmung der Lichtabsorption Methoden zur Abschätzung von Fehlern: Streuung von Messwerten, statistische Auswertung von Messergebnissen Stichworte zur Vorbereitung Grundlagen der organischen Chemie: Funktionelle Gruppen (Hydroxy-, Amino-, Oxo-, Keto-, Carboxy-, Thio-), Bindungen (Ether-, Ester-, Thioester-, Anhydrid-, Amid-, Disulfid-), Stoffklassen (Alkohole, Aldehyde, Ketone, Carbonsäuren, Aminosäuren, Peptide), ungesättigte und aromatische Verbindungen, Mesomerie. Säuren und Basen: Dissoziation, ph-wert, pk-wert, Puffer, Pufferkapazität. Eigenschaften von Natronlauge, Phosphorsäure, Salzsäure, Histidin, Glutaminsäure, Natriumcarbonat, NAD + und NADH. Chemisches Rechnen: Stoffmenge und Konzentration: mol, Molmasse, molare Konzentration, Molarität, Verdünnen und Mischen von Lösungen Grundlagen der Statistik: Zufällige und systematische Fehler, Normalverteilung, Mittelwert, Standardabweichung, Variationskoeffizient. Bei der Vorbereitung beachten Sie bitte die Einleitung zum Praktikumsbuch und den Anhang zu diesem Versuch. Für die Versuche werden grundsätzlich Millimeterpapier, Lineal oder Geodreieck, Bleistift, Radiergummi und Taschenrechner benötigt. Versuch 1: Messgenauigkeit beim Pipettieren und Wiegen In diesem Experiment sollen Sie das Pipettieren kleiner Volumina mit den im Praktikum verwendeten Kolbenpipetten üben und dabei die Genauigkeit solcher Pipettierungen ermitteln. Aufgabe: Pipettieren und Wiegen. Lassen Sie sich als erstes in die Bedienung der Waage einweisen. Üben Sie unter Anleitung das Pipettieren. Bestimmen Sie dann die Genauigkeit der Pipette, indem Sie 40mal je 100 µl oder 1000 µl Wasser (Dichte bei 25 C etwa g * cm -3 ) in ein Gefäß pipettieren, das auf der Waage steht. Am Anfang und nach jedem Pipettierschritt wird das angezeigte Gewicht notiert. Die jeweils pipettierte Wassermenge ermitteln Sie dann aus den Gewichtsdifferenzen. 1

2 Auswerten: Programmieren Sie zur Auswertung Ihrer Daten ein Arbeitsblatt und erstellen Sie mit Hilfe des Computers aus den 40 Pipettierungen ein Diagramm. Dazu müssen Sie sich in die Benutzung des der Software einweisen lassen. Das Protokoll sollte die erstellte Grafik enthalten und die folgenden Fragen beantworten: 1. Wie gross sind der Mittelwert und die Standardabweichung der Pipettierungen (Angabe in mg)? 2. Zeigt die Pipette einen signifikanten systematischen Fehler (d.h. eine echte Abweichung zwischen Mittelwert und Sollwert)? Wenn das der Fall ist, Angabe der Abweichung in % des Sollwerts. 3. Mit welchem Variationskoeffizienten (VK) haben Sie pipettiert (Angabe in %)? Versuch 2: Titration biologisch wichtiger Puffersubstanzen und Puffergruppen Dabei sollen Sie die Lösung einer Säure gegen eine Lauge titrieren (bzw. umgekehrt) und durch Messung des ph-wertes die pk-werte der puffernden Substanz und die Pufferkapazität ermitteln. Zur Auswahl stehen die folgenden fertigen Lösungskombinationen: in der Vorlage (20 ml) 1 24 mm Natriumcarbonat mit 140 mm Natriumchlorid Titration mit (in Schritten von 100 µl) 240 mm Salzsäure mm Phosphorsäure 1 M Natronlauge 3 50 mm Glutaminsäure mit 80 mm Salzsäure 4 25 mm Histidin mit 50 mm Salzsäure 1 M Natronlauge 250 mm Natronlauge Aufgabe: Titrieren und ph-messen. Pipettieren Sie 20 ml einer der Lösungen (1, 2, 3 oder 4) in ein kleines Becherglas (30-50 ml) und bestimmen Sie den ph-wert der Lösung. Geben Sie in 100 µl-schritten mit einer Pipette die rechts davon angegebene Lösung hinzu und notieren Sie jeweils den ph-wert, nachdem die Lösungen durch Rühren mit dem Magnetrührer gut durchmischt sind. Insgesamt sind je nach Lösung Pipettierschritte erforderlich. Zeichnen und Auswerten: Zeichnen Sie die Titrationskurve auf Millimeterpapier. In dem Ausdruck sollen Sie die folgenden Auswertungen mit Farbstift vornehmen: 1. Kennzeichnen Sie auf dem Diagramm die ph-bereiche, in dem die titrierte Substanz puffert. 2. Ermitteln Sie grafisch die pk-werte der puffernden Substanz und ordnen sie sie den einzelnen funktionellen Gruppen des titrierten Moleküls zu. Zeichnen Sie dazu die Strukturformel der verwendeten Vorlagelösung. 3. Berechnen Sie die Pufferkapazität. Dazu ermitteln Sie grafisch in einem der Pufferbereiche den Konzentrationszuwachs von Lauge bzw. Säure, der zu einer ph-wert-änderung um eine Einheit führt (Angabe in mol l -1 /ph, siehe Anhang). 2

3 Versuch 3: Eichkurven, lineare und nicht-lineare Regression In diesem Versuch sollen Sie eine bereitstehende Phenolrot-Lösung (Konzentration 0,6 mm) verdünnen und eine Eichkurve aufnehmen. Unter Verwendung dieser Eichkurve ermitteln Sie dann die Phenolrot- Konzentrationen der drei bereitstehenden Lösungen unbekannter Konzentration und vergleichen die so gewonnenen Ergebnisse mit den rechnerisch ermittelten Konzentrationen (Lambert-Beer'sches Gesetz). Aufgabe 1: Verdünnen und Absorption messen. Verdünnen Sie die bereitstehende 0,6 mm Phenolrot-Lösung in den Volumenverhältnissen 1:2, 1:3, 1:5, 1:8, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40 und 1:50 mit der bereitstehenden Pufferlösung und bestimmen Sie die Absorption dieser Lösungen und der 0,6 mm Stammlösung bei 560 nm. Zeichnen und Auswerten. Zeichnen Sie den Zusammenhang zwischen Konzentration und gemessener Absorption (y-achse: gemessene Absorption A; x-achse: berechnete Konzentration) und führen Sie eine lineare Regression durch. Läßt sich unter Verwendung aller Meßwerte eine gut angepaßte lineare Regression durchführen? Entscheiden Sie ggf. darüber, welche Verdünnungsstufen deutlich außerhalb des linearen Bereiches liegen und führen Sie eine erneute lineare Regression unter Ausschluß der entsprechenden Meßwerte durch. Berechnen Sie den molaren Absorptionskoeffizienten ε bei einer Wellenlänge von 560 nm. Aufgabe 2: Absorption unbekannter Lösungen messen. Füllen Sie etwa 2 ml der drei Phenolrot-Lösungen unbekannnter Konzentration in eine Küvette und messen Sie die Absorption bei 560 nm gegen einen Leerwert. Auswerten. Berechnen Sie die unbekannnten Konzentrationen mit Hilfe der ε-werte aus Aufgabe 1 und ermitteln Sie die Konzentration der Phenolrot-Lösung aus der von Ihnen erstellten Eichkurve. Vergleichen Sie die Werte miteinander. 3

4 Fragen 1. Wie berechnet man den Mittelwert einer Messreihe? Was versteht man unter Streuung der Messwerte und wie gibt man sie quantitativ an? 2. Wieviel NaCl (Molmasse 58,5) benötigen Sie zum Ansetzen von 2 Litern einer M Lösung? Wie stellen Sie diese Lösung her? 3. Wieviel mg NADH-Na 2 (rel. Molmasse 709,4) müssen Sie abwiegen, um 5 ml einer 1 mm Lösung herzustellen? 4. Welche Konzentration erhält man beim Verdünnen von 2 ml einer M Lösung auf 10 ml? 5. Wie gross ist die Konzentration von Wasser (Angabe in mol l -1 ) in reinem Wasser? 6. Wie ist der ph-wert einer Lösung definiert? Von welchen Grössen hängt er ab? 7. Wie hoch sind die H + -Konzentration und der ph-wert von reinem Wasser bei 25 o C? 8. Warum kann Wasser sowohl eine Säure als auch eine Base sein? 9. Aufgrund welcher chemischen Eigenschaft ist Essigsäure sauer? 10. Wie gibt man die Stärke einer Säure oder Base an? 11. Welche ph-werte haben eine 1 M, eine 0,1 M und eine 10 mm wässrige Salzsäure-Lösung? 12. In welchen Formen kann Phosphorsäure in wässriger Lösung auftreten? Welche davon sind im Blut die häufigsten? 13. Wieviele Ladungen trägt Glutaminsäure a) bei ph 1, b) bei ph 6? 14. Welche Reaktionen finden bei der Titration von salzsaurer Histidin-Lösung mit Natronlauge nacheinander statt? 4

5 Anhang 1: Konzentrationsberechnungen Einheit der Stoffmenge Einheit der Stoffkonzentration : mol : mol l -1, abgekürzt: M ( molar ) 1 M (molar) : die Lösung enthält pro Liter 1 mol des Stoffes 1 mm (millimolar) : die Lösung enthält pro Liter 10-3 mol des Stoffes 1 µm (mikromolar) : die Lösung enthält pro Liter 10-6 mol des Stoffes 1 nm (nanomolar) : die Lösung enthält pro Liter 10-9 mol des Stoffes Rechnen mit kleinen Zahlen Beim Umgang mit kleinen Konzentrationen bedient man sich am besten der Potenzdarstellung, d.h. 1 = 10 0 = = 10-1 = = 10-2 = = 10-3 = usw. Man schreibt kleine Zahlen als Produkt einer Zahl zwischen 1 und 10 und der zugehörigen Zehnerpotenz, also z.b als 4.52*10-4 Multiplikation: (x 10 a ) (y 10 b ) = x y 10 (a+b) Beispiel: = (2-4) = Division: (x 10 a ) / y 10 b = (x / y) 10 (a-b) Beispiel: / = (1/4) 10-4 (-6) = = 25 Verdünnen und Mischen Beim Verdünnen und Mischen geht kein gelöster Stoff verloren, d.h. die Stoffmenge (= Konzentration Volumen) bleibt gleich. Verdünnt man V 1 ml einer Lösung der Konzentration c 1 mit reinem Lösungsmittel auf ein Endvolumen von V 2 ml, gilt c 1 V 1 = c 2 V 2, d.h. c 2 = c 1 (V 1 /V 2 ) Beispiel: 5 ml einer Lösung der Konzentration M werden auf 250 ml verdünnt. Die entstehende Lösung hat in diesem Fall die Konzentration c 2 = (5/250) M = M. b) Beim Mischen von Lösungen der Konzentrationen c 1 und c 2 gilt für Konzentration c 3 c 3 = (c 1 V 1 + c 2 V 2 ) / (V 1 + V 2 ) Beispiel: 4 ml einer Lösung der Konzentration M werden mit 6 ml einer M Lösung gemischt. Die neue Konzentration ist dann c 3 = ( ) / 10 = M 5

6 Anhang 2: Grundlagen der Statistik Bei rein zufälligen Fehlern gilt die Gauss sche Normalverteilung. Sie ist charakterisiert durch den Mittelwert m und die Standardabweichung s. Als Faustregel kann man sich merken, dass ein systematischer Fehler wahrscheinlich dann vorliegt, wenn sich Mittelwert und Sollwert um mindestens 2 s unterscheiden. Gauss'sche Normalverteilung m-s s m s m + s hier: s = 16.0 m = Häufigkeit m = Σ x i / n s = Σ (x i - m) 2 / (n-1) Varianz = s 2 VK = 100. s / m (%) Meßwert Anhang 3: Titrationskurven und Pufferkapazität Im Beispiel handelt es sich um eine zweiprotonige Säure mit pk-werten von 3 und ph pk 2 ph V pk 1 Pufferbereich ml NaOH Pufferkapazität = c / ph ( in m ol / l) Zur Bestimmung der Pufferkapazität wurde im Pufferbereich 2 durch ein Steigungsdreieck graphisch ermittelt, dass zur Erhöhung des ph-werts um 2 Einheiten (von 8-10) 1 ml NaOH nötig war. Wenn wir annehmen, dass die zur Titration verwendete NaOH die Konzentration 1 M hatte und das Ausgangsvolumen der zu titrierenden Lösung 20 ml betrug, ergibt sich aus der Abbildung eine maximale Pufferkapazität der Lösung von ungefähr mol l -1 (Näherungsrechnung: Um den ph-wert um zwei Einheiten zu erhöhen, wurde 1ml 1 M NaOH auf etwa 21.5 ml verdünnt. Wie kann man ein genaues Ergebnis erhalten?). 6

7 Eichkurve Phenolrot Grundpraktikum Humanbiologie I -Labormethoden Verdünnung Stamm 1:2 1:3 1:5 1:8 1:10 1:20 1:30 1:40 1:50 unbek. Lsg I unbek. Lsg II unbek. Lsg III Konzentration (mol l -1 ) ε = l mol -1 cm -1 Absorption (gemessen) Name: Gruppe:... 7

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