Untersuchungen zur Zellzykluskontrolle durch die Anaphase-Promoting-Complex (APC)-abhängige Proteolyse bei der Akuten Myeloischen Leukämie

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1 Aus der Medizinischen Universitätsklinik Abteilung für Innere Medizin I / Hämatologie und Onkologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.br. Untersuchungen zur Zellzykluskontrolle durch die Anaphase-Promoting-Complex (APC)-abhängige Proteolyse bei der Akuten Myeloischen Leukämie INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.br. Vorgelegt 2008 von Dominik Markus Schnerch geboren in Heidelberg i

2 Dekan: Herr Professor Dr. Christoph Peters 1.Gutachter: Herr PD Dr. Ralph Wäsch 2. Gutachter: Herr PD Dr. Richard Fischer Jahr der Promotion: 2009 ii

3 gewidmet Sonja Steurenthaler, meinen Eltern und Großeltern iii

4 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis iv Abkürzungsverzeichnis vii 1 Einleitung Der Zellteilungszyklus Zellzyklusregulation durch Proteolyse Zellzykluskontrolle durch den Anaphase Promoting Complex (APC) Struktur und Funktion des APC Regulation der aktivierenden Untereinheiten Cdc20 und Cdh G1-Phase Etablierung einer stabilen G1-Phase Differenzierungsprozesse während G Regulation des G1-S-Übergangs S-Phase G2-Phase Mitose (M-Phase) APC-abhängige Proteolyse während Mitose Konsequenzen einer fehlerhaften Mitose Mitosekontrolle durch den Spindelcheckpoint (SCP) Grundlagen der Krebsentstehung Entstehung von numerischen und strukturellen Chromosomenaberrationen Numerische Chromosomenaberrationen (Aneuploidie) Strukturelle Chromosomenaberrationen (Translokationen) Chromosomenaberrationen in Tumorzellen Zielsetzung der Arbeit Untersuchung der APC-abhängigen Proteolyse während der G1-Phase bei AML-Zellen _ Untersuchung der APC-abhängigen Proteolyse während Mitose bei AML-Zellen 20 2 Material Chemikalien Nukleinsäuretechniken Kits und Reagenzien PCR-Primer shrna-oligonukleotidsequenzen Verwendete Plasmidvektoren Verwendete Bakterienstämme Elektrophoresetechniken Kits und Reagenzien Antikörper Zellkultur Zelllinien Kulturgefäße Nährmedien Zytokine 28 iv

5 Inhaltsverzeichnis weitere Materialien und Reagenzien Weiteres Zubehör Software Geräte Lösungen 30 3 Methoden Arbeiten mit Zellen Zellkultur Kryokonservierung von humanen Zellen Separation von mononukleären Zellen aus peripherem Blut und Knochenmarkaspirat In vitro Stimulation von primären AML-Zellen Einfach-Thymidin-Synchronisation Doppel-Thymidin-Synchronisation Hervorrufen eines Mitosespindeldefektes Proteasominhibition in Zellinien Immunfluoreszenzmikroskopie Analyse der Schwesterchromatidtrennung von Metaphasechromosomen Durchflusszytometrische Zellzyklusanalyse Bestimmung des Mitoseindex Proteinanalyse Zellzyklusabhängige Proteinquantifizierung am Durchflusszytometer Western Blot Nukleinsäureanalyse RNA-Isolation Reverse Transkription Quantitative PCR DNA-Elektrophorese Sequenzierung von DNA RNA-Interferenz (RNAi) 52 4 Ergebnisse G1-Regulation in AML-Zellen Cdh1-Expression in Tumorzellinien Cdh1-Expression in AML-Zellinien in Korrelation zu AML1-ETO Cdh1-Expression in primären AML-Zellen Transkriptionelle Repression von Cdh1 in AML1-ETO-positiven AML-Zelllinien Expressionsniveau verschiedener Proteine während eines Mitosedurchlaufs Mitoseregulation in AML-Zellen Geringe G2/M-Fraktion und verstärkte Apoptose in AML-Zelllinien G2/M-Verlust und gleichzeitige Apoptosezunahme in Abhängigkeit von der Dauer des Spindelschadens in Kasumi-1-Zellen Abnahme der Cyclin B- und Securin-Spiegel nach Spindelschaden Verminderter Anstieg des densitometrisch berechneten Mitoseindex in Kasumi-1-Zellen Proteasominhibition führt zur Stabilisation von Cyclin B und Securin in Kasumi Schwesterchromatidtrennung in AML-Zelllinien trotz Spindelschaden Sequenzanalyse des für die Mad2-bindende Proteindomäne kodierenden Genabschnitts von Cdc Verminderter BubR1- und Bub1-Gehalt in asynchron wachsenden AML-Zelllinien Bub1- und BubR1-Knockdown in Zelllinien mittels lentiviral vermittelter RNA-Interferenz 72 5 Diskussion 79 v

6 Inhaltsverzeichnis 5.1 Störungen der G1-Regulation Transkriptionelle Repression von APC Cdh1 in AML1-ETO-positiven AML-Zellen Konsequenz einer Repression von APC Cdh1 bei AML1-ETO-positiver AML Störung der Mitoseregulation SCP-Störung in AML Molekulare Untersuchung des SCP-Defekts Konsequenz einer verminderten Expression von BubR1 in AML Klinische Bedeutung der Ergebnisse 90 6 Zusammenfassung 94 7 Literaturverzeichnis 95 Danksagung 108 Lebenslauf 109 Schriftenverzeichnis, Kongressbeiträge und Preise 111 vi

7 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 2N-DNA 4N-DNA AML APC APS BSA CAK Cdk cdna CIAP CKI CML DMSO DNA DNase DTT ds EDTA FACS FCS FITC GFP h HBS HEPES MCC MPIF NCBI OD PBS PCR PFA DNA-Gehalt einer diploiden Zelle vor Replikation DNA-Gehalt einer diploiden Zelle nach Replikation akute myeloische Leukämie Anaphase Promoting Complex (Ubiquitinligase) Ammoniumperoxodisulfat Rinderserumalbumin ( bovine serum albumin ) Cdk-aktivierende Kinase Cyclin-abhängige Kinase ( cyclin-dependent kinase ) komplementär ( complementary ) DNA calf intestinal alkaline phosphatase Cdk-Inhibitor chronisch myeloische Leukämie Dimethylsulfoxid Desoxyribonukleinsäure DNA-spaltendes Enzym Dithiothreitol Doppelstrang ( double-stranded ) Ethylendiamintetraacetat Durchflusszytometer ( fluorescence-activated cell sorting ) fetales Rinderserum ( fetal calf serum ) Fluoresceinisothiocyanat green fluorescent protein Stunde HEPES-buffered saline 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure mitotic checkpoint complex multi-parameter immunofluorescence microscopy National Center for Biotechnology Information optische Dichte phosphate-buffered saline Polymerasekettenreaktion Paraformaldehyd vii

8 Abkürzungsverzeichnis phh3 phospho-histonh3 PI Propidiumiodid PMSF Phenylmethylsulfonylfluoride RISC RNA-induced silencing complex RNA Ribonukleinsäure RNAi RNA-Interferenz RNase RNA-spaltendes Enzym RT reverse Transkriptase / reverse Transkription SCP Spindelcheckpoint SCF Skp1-Cul1-F-Box-Komplex (Ubiquitinligase) SDS Natriumdodecylsulfat shrna short-hairpin RNA sirna short interfering RNA ss Einzelstrang ( single stranded ) subg1 Zellen, die im Zellzklushistogramm einen DNA-Gehalt von < 2N aufweisen TAE Tris/Acetat/EDTA TEMED N,N,N,N -Tetramethylethylendiamin UV ultraviolett v/v Volumen pro Volumen w/v Gewicht pro Volumen x G Vielfaches der Erdanziehungskraft (Zentrifugation) viii

9 - 1 - Einleitung 1 Einleitung 1.1 Der Zellteilungszyklus Während eines Zellteilungszyklus entstehen aus einer Ursprungszelle jeweils zwei Tochterzellen. Der Zellzyklus gliedert sich in vier voneinander abgrenzbare Phasen: G1-, S (Synthese)-, G2- und M (Mitose)-Phase (siehe Abbildung 1) (Morgan, 2007, Alberts, 2008). In der G1-Phase des Zellzyklus wächst die Zelle nach Stimulation durch äußere Faktoren zunächst zu einer bestimmten Größe, um nicht bei jeder Teilung an Größe zu verlieren. Nachdem die Zelle eine bestimmte Größe erreicht hat, passiert sie den Restriktionspunkt. Nach Überschreiten dieses Punktes muss sie einen kompletten Zellteilungszyklus durchlaufen. In der G1-Phase erfolgt außerdem die Vorbereitung auf die DNA-Replikation, die dann in der anschließenden S-Phase stattfindet. In der G2-Phase werden Fehler behoben, die bei der DNA-Replikation auftreten können. Schließlich erfolgen in der Mitose die Chromosomenseparation und die eigentliche Zellteilung. In der folgenden neuen G1-Phase kann die Zelle in die Differenzierung eintreten oder einen neuen Zellteilungszyklus beginnen. Abbildung 1: In der G1-Phase des Zellteilungszyklus nimmt die Zelle an Größe zu und bereitet sich auf die anschließende Replikation des genetischen Materials in der S- Phase vor. In der G2-Phase besteht die Möglichkeit, entstandene DNA- Schäden zu beheben. In der Mitose (M-Phase) findet die Aufteilung der Chromosomen auf die beiden entstehenden Tochterzellen statt, die dann in eine neue G1-Phase eintreten. Hier können die Zellen entweder in einem sogenannten G 0 - Zustand verharren oder sich differenzieren (G T ). Ferner kann durch Passieren des Restriktionspunktes (R) ein neuer Zellteilungszyklus durchlaufen werden. Während der APC vornehmlich während Mitose und G1-Phase aktiv ist, kontrolliert der SCF den G1-S-Übergang. (Wäsch et al., 2005)

10 - 2 - Einleitung Wesentliche Erkenntnisse, die zum Verständnis der grundlegenden molekularbiologischen Mechanismen der Zellzyklusregulation beitrugen, wurden in Modellorganismen wie der Hefe Saccharomyces cerevisae gewonnen. Es zeigte sich, dass der Zellteilungszyklus durch komplexe Proteininteraktionen reguliert wird. Diese sollen sicherstellen, dass der Zellteilungszyklus nur in eine Richtung erfolgen kann (Reed, 2003) und sollen gewährleisten, dass die Verdopplung des genetischen Materials nur einmal pro Zellteilungszyklus stattfindet. Eine Schlüsselrolle in der Zellzyklusregulation nehmen die sogenannten Cycline ein (Murray, 2004, Wäsch et al., 2005, Bloom et al., 2007). Diese Cycline führen zur Aktivierung Cyclin-abhängiger Kinasen (Cdk) (siehe Tabelle 1), die den Eintritt ruhender Zellen in den Zellzyklus und das Durchlaufen der verschiedenen Zellzyklusphasen regulieren (Morgan, 1997). Die periodische Aktivität der Cdk ist hierbei von entscheidender Bedeutung. Die Proteolyse von Cyclinen ist ein zentraler Mechanismus der Regulation der zyklischen Aktivität der Cdk und damit des Zellzyklus (King et al., 1996, Koepp et al., 1999). Nach ihrem Abbau werden die Cycline erst wieder im darauffolgenden Zellteilungszyklus synthetisiert. Dadurch wird der Wiedereintritt in eine bereits durchlaufene Zyklusphase verhindert (Reed, 2003). Zellzyklusphase Cyclin entsprechende Cdk G1 S M D, E A, E A, B Cdk2, Cdk4, Cdk6 Cdk2 Cdk1, (Cdk2?) Tabelle 1: In Abhängigkeit von der Zellzyklusphase existiert ein spezifisches Aktivitätsmuster von cyclinabhängigen Kinasen (Cdk). Diese werden durch bestimmte Cycline, den jeweiligen aktivierenden Untereinheiten, in ihrer Aktivität phasengerecht gesteuert. Sämtliche Phasenübergänge werden anhand der Aktivität dieser Cdk im Zusammenspiel mit weiteren Kinasen (z.b. Polokinasen, Aurorakinasen) gesteuert (Malumbres et al., 2001, Nigg, 2001). Die Modulation der Cdk durch Expression, aktivierende bzw. inhibitorische Phosphorylierung, der Abbau spezifischer Inhibitoren (CKI) oder die Regulation der Cyclinaktivität (Lokalisation, gezielte Proteolyse) erlaubt eine präzise Kontrolle des Zellteilungszyklus (Malumbres et al., 2001). Vor dem Übergang in eine neue Phase des Zellteilungszyklus erfolgt eine Kontrolle, ob die Voraussetzungen für den Übertritt in die nachfolgende Phase gegeben sind oder ob Fehler vorliegen, die innerhalb der entsprechenden Phase behoben werden müssen. Diese Kontrollen werden von speziellen Kontrollpunkten (Checkpoints) vorgenommen, welche die

11 - 3 - Einleitung Zellzyklusprogression verzögern können (Elledge, 1996, Malumbres et al., 2001, Reed, 2003, Bharadwaj et al., 2004). Dadurch können Reparaturmechanismen einen möglichen Schaden beheben. Fehler, beispielsweise am Erbgut, die in nachfolgende Zellzyklusphasen verschleppt werden oder auf die Tochterzellen weitergegeben werden, führen zur Ansammlung genetischer Veränderungen in den folgenden Zellgenerationen (Bharadwaj et al., 2004, Kastan et al., 2004). Da die Cdks die wesentlichen Regulatoren für den Übergang in eine neue Zellzyklusphase darstellen, sind sie eine wichtige Zielstruktur für diverse Kontrollsignalwege (Malumbres et al., 2001, Reed, 2003, Guardavaccaro et al., 2006). 1.2 Zellzyklusregulation durch Proteolyse Cycline führen zu einer zyklischen Aktivierung von Cdks, die eine entscheidende Rolle in der Steuerung des Zellzyklus spielt. Die zyklische Aktivität der Cdks wird in erster Linie durch Proteinbiosynthese und die anschließende gezielte Proteolyse von Cyclinen reguliert, die wichtige Substrate sogenannter Ubiquitinligasen sind (Glotzer et al., 1991, Malumbres et al., 2001). Letztere sind spezielle Proteinkomplexe, die sich aus einer Vielzahl verschiedener Untereinheiten zusammensetzen (Nakayama et al., 2006). Ihre Aufgabe ist es, Substratproteine zu erkennen und sie mit Ubiquitinketten zu verbinden, um dadurch eine Erkennung durch das Proteasom zu gewährleisten (siehe Abbildung 2). Auf diese Weise kann eine spezifische Degradation bestimmter Proteine erfolgen. E3 Substrat E2 Ub Lys Ub Ub Ub Ub Ub Ub Proteasom ATP AMP + PPi Peptide Abbildung 2: Das Ubiquitin- Proteasom-System. Dieses System ermöglicht es, Ubiquitinmoleküle über eine Reihe von Zwischenschritten auf spezifische Substratproteine zu übertragen und diese dadurch für den anstehenden proteasomalen Abbau zu kennzeichnen. E1 AMP + PPi ATP Dabei werden die Ubiquitinmoleküle in verschiedenen Reaktionen auf die Substratproteine übertragen. Zuerst kommt es unter Verbrauch von ATP zu einer Thioesterverbindung zwischen

12 - 4 - Einleitung dem Ubiquitinmolekül und dem sogenannten Ubiquitin-aktivierenden Enzym (E1). Unter Ausbildung einer erneuten Thioesterbindung wird das aktivierte Ubiquitin auf das Ubiquitinkonjugierende Enzym (E2) übertragen. Im letzten Schritt wird das Ubiquitinmolekül entweder direkt oder unter Vermittlung einer E3-Ubiquitinligase auf die ε-aminogruppe eines Lysinrestes des entsprechenden Substratproteins übertragen, das nun durch das Proteasom erkannt werden kann (Hershko, 1983, Hershko et al., 1998). Das Proteasom ist ein Komplex aus verschiedenen Enzymen mit Proteaseaktivität, der für den Abbau von ubiquitinierten Proteinen verantwortlich ist (Baumeister et al., 1998). 1.3 Zellzykluskontrolle durch den Anaphase Promoting Complex (APC) Für die Zellzykluskontrolle sind der Anaphase Promoting Complex (APC) und der SKP1-CUL1-F- Box-Komplex (SCF) die entscheidenden E3-Ubiquitinligasen (Abbildungen 1 und 2) (Nakayama et al., 2006). Der Fokus der vorliegenden Arbeit liegt auf dem APC Struktur und Funktion des APC Der APC ist von der Mitose bis zur späten G1-Phase aktiv. Er ist ein Proteinkomplex, der aus mindestens zwölf verschiedenen Untereinheiten besteht (Castro et al., 2005, Wäsch et al., 2005, Peters, 2006). Für die in dieser Arbeit untersuchte Regulation des Mitoseaustrittes und der G1- Phase spielen ferner zwei aktivierende Untereinheiten des APC eine wichtige Rolle. Sowohl Cdc20 (APC Cdc20 ) als auch Cdh1 (APC Cdh1 ) ist in der Lage, den APC zu aktivieren als auch eine gewisse Substratspezifität zu vermitteln (Schwab et al., 1997, Visintin et al., 1997). Cdc20 ist während der Mitose aktiv und Cdh1 spielt während der späten Mitose und der folgenden G1- Phase eine entscheidende Rolle (Wäsch et al., 2002, Castro et al., 2005, Wäsch et al., 2005, Peters, 2006). Diese aktivierenden Untereinheiten besitzen spezielle Sequenzelemente, sogenannte C-Boxes oder IR-Tails, über die sie mit dem APC interagieren können (Vodermaier, 2001). Ferner sind sie selbst in der Lage über eine C-terminal lokalisierte Aminosäuresequenz (WD40-Domäne) spezifische APC-Substratproteine zu erkennen (Kraft et al., 2005). Hierbei wird die sogenannte Destruction-Box mit der Konsensussequenz RxxLxxxxN sowohl durch Cdc20 als auch durch Cdh1 erkannt (Glotzer et al., 1991). Cdh1 ist zudem in der Lage, die sogenannte KEN-Box mit der Konsensussequenz KEN zu erkennen (Pfleger et al., 2000, Burton et al., 2001).

13 - 5 - Einleitung Regulation der aktivierenden Untereinheiten Cdc20 und Cdh1 Die Cdc20-Aktivität wird sowohl transkriptionell als auch proteolytisch (durch Cdh1) und durch inhibitorische Phosphorylierung reguliert (Prinz et al., 1998, Pfleger et al., 2000, Kraft et al., 2003, Wäsch et al., 2005). Ferner führt eine Phosphorylierung von APC-Untereinheiten durch Cdk und Polokinasen zu einer verstärkten Affinität für Cdc20 (Sudakin et al., 1995, Descombes et al., 1998, Kramer et al., 2000). Die gezielte Dephosphorylierung von APC-Untereinheiten erwies sich als wichtiger Schritt, um gegen Ende der Mitose die Affinität für Cdc20 zu senken, für Cdh1 jedoch zu erhöhen (Kramer et al., 2000). Cdh1 wird zudem über Veränderung der Lokalisation innerhalb der Zelle reguliert (Jaquenoud et al., 2002, Zhou et al., 2003). Durch Cdk-abhängige Phosphorylierung kommt es für den Zeitraum zwischen S-Phase und dem Ende der darauffolgenden Mitose zu einer Verlagerung von Cdh1 aus dem Zellkern. Dies führt zu einer Inaktivierung des APC (Jaquenoud et al., 2002). Demnach hat eine Verminderung der Cdk- Aktivität eine Funktionszunahme von Cdh1 zur Folge (Zachariae et al., 1998, Jaspersen et al., 1999, Lukas et al., 1999, Jaquenoud et al., 2002). 1.4 G1-Phase Etablierung einer stabilen G1-Phase In der G1-Phase besteht für die Zelle die Möglichkeit, entweder einen erneuten Zellteilungszyklus zu durchlaufen, in eine Ruhephase (G0) oder in einen Differenzierungsprozess einzutreten. Die G1-Phase dient der Vorbereitung auf die bevorstehende Replikation des genetischen Materials. Damit sich die entstehenden Tochterzellen nicht mit jedem Zellteilungszyklus weiter verkleinern, kommt es während der G1-Phase zu einer Zunahme des Zytoplasmas. Zu diesem Zweck wird durch wichtige G1-Regulatorproteine, wie Ras und Akt, der Metabolismus der Zelle gesteigert (Massague, 2004). Dies führt zu einer Steigerung der Proteinsynthese und zu einer verstärkten Glukoseaufnahme (Cohen et al., 2001, Bjornsti et al., 2004, Jope et al., 2004). Ferner kann das Vorliegen von DNA-Schäden zu einer Verzögerung der Zellzyklusprogression führen (Kastan et al., 2000, Wahl et al., 2001, Bartek et al., 2003). Darüber hinaus ist die Zelle empfänglich für Signale aus ihrer direkten Umgebung. Diese beeinflussen unter anderem über den Ras- und PI(3)K-Weg das Zellwachstum und die Zellzyklusprogression (Massague, 2004). Ferner führen beide Signalwege durch Caspaseinhibition zu einer verstärkten Apoptoseresistenz (Massague, 2004). Am Ende der Mitose kommt es durch die Degradation von mitotischen Cyclinen zu einem Abfall der Cdk-Aktivität. Die Degradation läuft in zwei Phasen ab. In der ersten Phase kommt es zu

14 - 6 - Einleitung einer Cdc20-abhängigen Degradation, wodurch es zur Rückbildung der Mitosespindel und zur Zytokinese kommt (Wäsch et al., 2002). Der Abbau der mitotischen Cycline führt daraufhin zur Aktivierung von APC Cdh1, wodurch nun in der zweiten Degradationsphase der Abbau der verbliebenen Mitosecycline, vor allem während der G1-Phase, vermittelt wird (Wäsch et al., 2005). Im Hefe-Modell konnte gezeigt werden, dass während G1 die APC Cdh1 -abhängige Proteolyse des nach Mitose verbliebenen Cyclin B-Analogons Clb2 eine wichtige Rolle für das Zellwachstum und die Länge der G1-Phase spielt (Wäsch et al., 2002, Wäsch et al., 2005). In humanen Zellen konnte analog dazu festgestellt werden, dass asynchron wachsende Cdh1- Knockdown-Zellen schneller in die folgende S-Phase eintreten als Zellen, die ein normales Cdh1- Expressionsniveau aufweisen (Bashir et al., 2004, Engelbert et al., 2008). Allerdings wurde beobachtet, dass Cdh1-Knockdown-Zellen deutlich mehr Zeit für die DNA-Replikation benötigen, was zu der Vermutung führt, dass eine verkürzte G1-Phase und ein verfrühter S-Phase-Eintritt zu Störungen während der DNA-Replikation beitragen (Wäsch et al., 2002, Wäsch et al., 2005, Engelbert et al., 2008). In humanen Cdh1-Knockdown-Zellen konnten erhöhte Expressionslevels von Cyclin A und Cyclin B nachgewiesen werden, die wahrscheinlich als Ursache für den verfrühten Eintritt in die S-Phase in Frage kommen (Engelbert et al., 2008). Diese entscheidenden Grundlagen ließen sich anhand des Mausmodells bestätigen. Anhand embryonaler Fibroblasten konnte auch hier, wie zuvor an humanen Zellen beschrieben, eine Stabilisierung mitotischer Cycline gezeigt werden (Garci-Higuera et al., 2008). Diese führten zu einer verstärkten Aktivität von Cdk1 und Cdk2. Darüber hinaus konnte eine verminderte Bildung von Präreplikationskomplexen auf der DNA nachgewiesen werden, welche vermutlich die oben genannten Verzögerungen während der DNA-Replikation mitverursacht (Garci-Higuera et al., 2008). Es scheint daher wahrscheinlich, dass die APC Cdh1 -abhängige proteolytische Degradation verbliebener mitotischer Cycline zusammen mit Cdk-Inhibitoren die Cdk-Aktivität auch in humanen Zellen wirksam unterdrückt. Dies trägt zu einer stabilen G1-Phase bei und ermöglicht damit eine akkurate DNA-Replikation (Wäsch et al., 2002, Wäsch et al., 2005, Engelbert et al., 2008). In humanen Zellen liefert Cdh1 zudem einen wichtigen indirekten Beitrag zur Aufrechterhaltung einer stabilen G1-Phase, indem es die CKI p21 und p27 stabilisiert. Die Degradation dieser zwei Proteine wird durch das F-Box-Protein Skp2 vermittelt (Yu et al., 1998, Carrano et al., 1999). Durch SCF Skp2 -abhängige Proteolyse von p21 und p27 kommt es zu einer Zunahme der Cyclin E- Cdk2-Aktivität, die zu einem verstärkten S-Phase-Eintritt führt. Es konnte gezeigt werden, dass die aktivierende APC-Untereinheit Cdh1 zur Ubiquitinierung von Skp2 führt (Bashir et al., 2004, Wei et al., 2004).

15 - 7 - Einleitung Die Induktion eines G1-Arrests wird ferner über den Verbund aus dem Retinoblastomprotein (prb) mit Cdh1 erreicht. Vermutlich wirkt prb als ein Modulator der Cdh1-abhängigen Ubiquitinierungsaktivität und führt dadurch zu einer verstärkten Degradation von Skp2 (Binne et al., 2007). Der Verbund aus prb und APC Cdh1 kann sowohl einen kurzfristigen Zellzyklusarrest induzieren als auch eine langfristige Stabilisierung von p27 und wahrscheinlich p21 bewirken, welche vermutlich für Differenzierungsprozesse benötigt wird (siehe Abschnitt 1.4.2) (Binne et al., 2007). Darüber hinaus ist bekannt, dass Zell-Zell-Interaktionen ebenfalls in der Lage sind, die Zellzyklusprogression zu regulieren. So konnte gezeigt werden, dass der Kontakt mit Stromazellen in Non-Hodgkin-Lymphomzellen zu einer Induktion von Cdh1 mit einem daraus resultierenden Zellzyklusarrest führt (Lwin et al., 2007). Es zeigte sich, dass der G1-Arrest durch Stabilisierung von p27 und p21 erfolgt. Die Stabilisierung beider Proteine konnte auf die APC Cdh1 - abhängige Degradation der SCF-Untereinheit Skp2 zurückgeführt werden (Lwin et al., 2007) Differenzierungsprozesse während G1 Für den Ablauf von Differenzierungsprozessen ist die Etablierung einer stabilen G1-Phase von großer Bedeutung (siehe Abschnitt 1.4.1). Einige der in Abschnitt genannten Mechanismen, die zu einem G1-Arrest führen, beziehungsweise helfen, ihn aufrechtzuerhalten, haben daher auch die Funktion, Differenzierungsprozesse zu induzieren (Binne et al., 2007). Als zentraler G1- Regulator greift APC Cdh1 jedoch auch direkt in Differenzierungswege ein: So konnte gezeigt werden, dass wichtige Differenzierungsprozesse vermutlich unter anderem durch Cdh1- abhängige Proteolyse von Id2 (inhibitor of DNA binding 2, inhibitor of differentiation 2) zu erklären sind (Lasorella et al., 2006). Weitere Arbeiten belegen, dass die Cdh1-abhängige Proteolyse in postmitotischen Neuronen einem Auswachsen von Nervenzellfortsätzen und damit der Ausbildung neuronaler Verknüpfungen entgegenwirkt. Diese Inhibition scheint durch einen spezifischen Abbau des transkriptionellen Korepressors SnoN generiert zu werden (Konishi et al., 2004, Stegmuller et al., 2006). Ferner trägt eine Aktivierung des TGF-beta-Signalweges zu einer Smad-Protein-vermittelten Cdh1-abhängigen Proteolyse von SnoN bei (Stroschein et al., 2001, Wan et al., 2001). Die gezielte Degradation des Korepressors SnoN führt auf diese Weise zu einer Verstärkung der TGF-beta-abhängigen Transkription und beeinflusst damit Wachstums- und Differenzierungsvorgänge. So weiß man beispielsweise, dass Smad-Proteine, die wichtige Komponenten des TGF-beta-Signalweges darstellen, zu einer verstärkten Expression der CKI p15 und p21 führen (He et al., 2003). Es konnte gezeigt werden, dass SnoN in einer Vielzahl humaner Malignome verstärkt exprimiert wird (Lymphome, Magenkarzinome, Schilddrüsen- und

16 - 8 - Einleitung Lungenkrebs (Nomura et al., 1989)). Zudem weiss man, dass dieses Protein in der Lage ist, primäre Zellen zu transformieren (Boyer et al., 1993) Regulation des G1-S-Übergangs Skp2 p27 Cyclin B,A APC Cdh1 G1 Cdk2 p21 p53 Cyclin E E2F S Via Rb Cdk4/6 Mitogene Signale Abbildung 3: Der Restriktionspunkt determiniert den Durchlauf eines neuen Zellzyklus. Das zentrale Steuerelement ist hierbei die cyclinabhängige Kinase 2 (Cdk2). Diese kann durch die Cycline A und E aktiviert werden. Gegenspieler sind die sogenannten CKIs, wie beispielsweise p21 und p27. Nicht nur die E2Fabhängige verstärkte Transkription von Cyclin E, sondern auch die durch Cdk4/6-Aktivierung bedingte Sequestration von p27 sind entscheidende mitogen wirksame Faktoren. Der Übergang in die S-Phase erfordert einen Anstieg von Cyclin E und damit verbunden eine Aktivitätszunahme von Cdk2 (siehe Abbildung 3) (Reed, 2003). Die verstärkte Transkription des Cyclin-E-Genes wird indirekt durch exogene mitogene Signale erreicht: Zahlreiche Signalkaskaden, die empfänglich für exogene Stimulation sind, führen zur Expression von Cyclin D, welches Cdk4 und Cdk6 aktiviert. Dadurch kommt es zu einer Phosphorylierung und Inaktivierung von prb (Morgan, 1997, Murray, 2004). Die spezifische Phosphorylierung von prb führt zur Dissoziation des wichtigen Transkriptionsfaktors E2F. Die E2F-abhängige Transkription kann die Akkumulation von Cyclin E in Gang setzen und damit einen Stimulus für den G1-S- Übergang setzen (siehe Abbildung 3) (Massague, 2004). Die zunehmende Aktivierung von Cdk4/Cdk6 unter dem Einfluss mitogener Stimuli führt ferner zur Sequestration von p27, welches nun nicht mehr für eine Inhibition von Cdk2 zur Verfügung steht. Unter dem Einfluss einer verstärkten Transkription von Cyclin E und einer verminderten Cdk-Inhibition kommt es zu einer Zunahme der Cdk2-Aktivität (Blain et al., 2003). Das Überschreiten des Restriktionspunktes wird einerseits durch die Expression von Cyclin E und Cyclin A, andererseits durch den inhibitorischen Einfluss der CKI, wie p21 und p27, bestimmt (siehe Abbildung 3). Eine verminderte Aktivität von APC Cdh1 kann eine verstärkte Expression von Cyclin A während der G1-Phase bewirken. Dies kann das Kräfteverhältnis zugunsten der Cycline verschieben und so zu einer Verkürzung der G1- Phase beitragen. Eine verkürzte G1-Phase kann zu einer verminderten Bildung von Präreplikationskomplexen auf dem Genom und somit einer unzureichenden Vorbereitung auf die

17 - 9 - Einleitung S-Phase führen, die dann unvollständig ablaufen dürfte (siehe Abschnitt 1.5) (Wäsch et al., 2002, Diffley, 2004, Engelbert et al., 2008, Garci-Higuera et al., 2008). 1.5 S-Phase Während der S-(Synthese-)Phase kommt es zur Replikation des genetischen Materials. Der Eintritt in diesen Abschnitt des Zellteilungszyklus beginnt, sobald die Inhibition des Cdk2-Cyclin E- Komplexes durch Abbau des CKI p27 aufgehoben wird (Carrano et al., 1999, Montagnoli et al., 1999, Shirane et al., 1999, Tsvetkov et al., 1999, Li et al., 2001). Die Aktivität des Cdk2-Cyclin E- Komplexes ist auf ein kurzes Zeitfenster während des G1-S-Phasenübergangs beschränkt, während dessen der Beginn der Replikationstätigkeit vorbereitet wird (Dulic et al., 1992, Koff et al., 1992). Die während des M-G1-Übergangs an umschriebenen Stellen auf dem Genom entstandenen Präreplikationskomplexe sind Ausgangspunkte der nachfolgenden DNA-Replikation (Diffley, 2004). Für deren Bildung ist eine hohe Aktivität von APC Cdh1 nötig, da dieser zu einer niedrigen Cdk-Aktivität führt und ferner inhibitorisch wirksame Proteine, wie das Geminin, degradiert (Diffley, 2004). Voraussetzung für die Neuformierung der Präreplikationskomplexe ist, dass diese zunächst im Verbund mit dem Cdc6-Protein vorliegen. Die Cdk-abhängige Phosphorylierung des Cdc6-Proteins bewirkt dessen Dissoziation vom Präreplikationskomplex. Durch die anschließende Degradierung von Cdc6 (Petersen et al., 2000) wird sichergestellt, dass es zu keiner Neuformierung dieser Komplexe kommt, damit die DNA nur einmal pro Zellteilungszyklus repliziert wird. Die Cdc6-Phosphorylierung erfolgt durch den Cdk2-Cyclin E- und den Cdk2-Cyclin A-Komplex (Mailand et al., 2005), dessen Aktivität durch die Akkumulation von Cyclin A während der S-Phase stark zunimmt. Durch eine zunehmende Akkumulation von Cyclin A kommt es zum Beginn der Replikationstätigkeit (Petersen et al., 1999). Unter dem Einfluss einer verminderten APC Cdh1 -Aktivität während G1 kann es zu einer Stabilisierung mitotischer Cycline kommen. Die verstärkte Expression von Mitosecyclinen kann zu einer verminderten Bildung von Präreplikationskomplexen auf dem Genom führen (Wäsch et al., 2002, Diffley, 2004, Wäsch et al., 2005, Engelbert et al., 2008, Garci-Higuera et al., 2008). Da die Replikation der DNA durch eine geringere Zahl an Replikationskomplexen erfolgen muss, kommt es zu einer Verlängerung der S-Phase. Durch eine unvollständige Degradation von Cyclin B kann es zu einem vorzeitigen Eintritt der Zellen in Mitose kommen. Die verlängerte Replikationstätigkeit kann dazu führen, dass die DNA bei einem verfrühten Mitoseeintritt noch teilweise in unreplizierter Form vorliegt. In diesem Fall sind die Matrizenstränge und die neu synthetisierten DNA-Stränge noch durch die Replikationskomplexe verbunden. Die fortbestehende Verbindung

18 Einleitung der DNA-Stränge kann bei der Chromosomenseparation zu Doppelstrangbrüchen und genetischer Instabilität führen (Wäsch et al., 2005, Engelbert et al., 2008). 1.6 G2-Phase Während der G2-Phase bereitet sich die Zelle auf die Aufteilung des genetischen Materials auf die beiden Tochterzellen vor. Innerhalb dieses Zellzyklusabschnittes existieren eine Reihe von Kontrollpunkten, die zum einen den Abschluss der Replikationstätigkeit, die Duplikation der Zentrosomen als auch die Reparatur von Schäden am genetischen Material sicherstellen sollen (Taylor et al., 2001, Shiloh, 2003). Im Laufe der G2-Phase kommt es durch verstärkte Transkription zur Akkumulation von mitotischen Cyclinen, die mit der entsprechenden Cdk (hier Cdk1) einen Komplex bilden (Guardavaccaro et al., 2006). Cdk1 wird allerdings während der G2- Phase durch inhibitorische Phosphorylierung in einem inaktiven Zustand gehalten (Parker et al., 1992, Booher et al., 1997, Liu et al., 1997). Während des G2-M-Übergangs kann Cdk1 durch die Cdc25-Phosphatase dephosphoryliert und dadurch aktiviert werden. Die exakte Regulierung der Dephosphorylierung stellt einen wirksamen Mechanismus dar, um den richtigen Zeitpunkt für den Mitoseeintritt zu gewährleisten (Draetta et al., 1997). Um eine vollständige Aktivierung von Cdk1 zu erreichen, wird durch bereits dephosphorylierte, aktivierte Cdk1 der Cdc25-Gegenspieler Wee1-Kinase inhibiert. Die gleichzeitig ablaufende weitere Aktivierung der Cdc25-Phosphatase bewirkt einen effizienten Übertritt der Zellen in Mitose (Izumi et al., 1993, Booher et al., 1997, Guardavaccaro et al., 2006). In vergleichbarer Weise kommt der Cdk-aktivierenden Kinase (CAK) eine entscheidende Rolle in der promitotischen Modifikation von Cdk1 zu (Pines, 1995). Diese Komponenten (Cdc25, Myt-1 und Wee-1) stellen aufgrund ihrer zentralen Funktion einen entscheidenden Angriffspunkt dar, um den Beginn der Mitose zu kontrollieren. Dies ist beispielsweise bei Vorliegen von Schäden am genetischen Material der Fall. Hier spielt der Tumorsuppressor p53 eine entscheidende Rolle (Shiloh, 2003). Bei Schäden am genetischen Material können jedoch auch p53-unabhängige Mechanismen (ATM/ATR) durch Hemmung von Cdk1 zu einer Verzögerung des Mitoseeintritts führen (Taylor et al., 2001). 1.7 Mitose (M-Phase) Während der Mitose entstehen aus einer Zelle mit repliziertem Chromosomensatz zwei genetisch identische Tochterzellen mit einfachem Chromosomensatz. In dieser Phase unterscheidet man die Zytokinese, d.h. die Auftrennung des Zytoplasmas, von der Verteilung des genetischen Materials auf die beiden entstehenden Tochterzellen. Die zuverlässige Aufteilung des

19 Einleitung genetischen Materials auf die Tochterzellen ist für die Integrität des Erbguts von größter Wichtigkeit (Jallepalli et al., 2001, Musacchio et al., 2002, Bharadwaj et al., 2004, Rajagopalan et al., 2004, Kops et al., 2005) APC-abhängige Proteolyse während Mitose Der exakte Ablauf der Mitose wird durch APC-abhängige Proteolyse reguliert. So kommt es während der Metaphase zu einer APC Cdc20 -abhängigen Degradation von Cyclin B und Securin (Sudakin et al., 1995, Zur et al., 2001, Hagting et al., 2002). Dies bewirkt einen zunehmenden Abfall der Cdk1-Aktivität. Der gleichzeitig stattfindende Abbau von Securin führt zur Aktivierung des Enzyms Separase und damit zur Trennung der Cohesine, die die Schwesterchromatiden verbinden (Cohen-Fix et al., 1996, Uhlmann et al., 1999, Waizenegger et al., 2000, Hauf et al., 2001). Unter dem Einfluss der zunehmenden APC-abhängigen Degradation von Cyclin B kommt es zu einer weiteren Aktivierung der Separase (Stemmann et al., 2001, Gorr et al., 2005). Die abnehmende Aktivität von Cdk1 führt schließlich zur Depolymerisation der Mitosespindel, zur Dekondensation der Chromosomen, zur Wiederausbildung der Membran des Zellkerns und zur Ausbildung einer Teilungsfurche, die die Trennung der beiden Zellkörper bewirkt (Clute et al., 1999, Peters, 2006). Ferner übernimmt infolge der zunehmenden Cyclin B-Degradation und der abnehmenden Cdk1-Aktivität die aktivierende APC-Untereinheit Cdh1 die vorherrschende Rolle. Sie erfüllt vornehmlich Aufgaben in der folgenden G1-Phase (siehe Abschnitt 1.4) und führt unter anderem zum APC-vermittelten Abbau von Cdc20 (Huang et al., 2001, Wäsch et al., 2002, Castro et al., 2005, Wäsch et al., 2005, Peters, 2006) Konsequenzen einer fehlerhaften Mitose Fehlerhafte Mitosen können entweder dazu führen, dass eine Auftrennung der Chromosomen unterbleibt oder dass es zu einer Fehlverteilung von Einzelchromosomen kommt (Jallepalli et al., 2001, Musacchio et al., 2002, Bharadwaj et al., 2004, Rajagopalan et al., 2004, Kops et al., 2005). Aus einer unterbliebenen Zellteilung resultiert eine Tochterzelle mit einem tetraploiden Chromosomensatz (Storchova et al., 2004). Ob sie in der Lage ist, in einen erneuten Zellteilungszyklus einzutreten, hängt von Checkpointmechanismen innerhalb der G1-Phase ab (Lanni et al., 1998, Andreassen et al., 2001). Tetraploide Zellen verharren in der Regel in der G1- Phase. Funktionelles p53 spielt bei diesem G1-Arrest eine wichtige Rolle. Zellen mit gestörter p53-funktion sind in der Lage, trotz fehlerhafter Mitose in einen erneuten Zellteilungszyklus einzutreten. Es konnte gezeigt werden, dass der Eintritt nicht-diploider Zellen in einen erneuten

20 Einleitung Zellteilungszyklus zu erheblichen Veränderungen an der DNA führt (Fujiwara et al., 2005, Shi et al., 2005) Mitosekontrolle durch den Spindelcheckpoint (SCP) (Konfokale Mikroskopie, Schnerch D. und Wäsch R.) Abbildung 4: Aufteilung der Chromosomen während Mitose. Die Chromosomen sammeln sich zunächst während der Metaphase in der Äquatorialebene der Mitosespindel. Dabei kommt es zu einer Verbindung zwischen den Mikrotubuli der Spindel und der Zentromerregion der Chromosomen. Sobald jedes einzelne Chromosom eine korrekte Verbindung hergestellt hat, kommt es während der Anaphase zur Auftrennung der Chromosomen auf die beiden entstehenden Tochterzellen. Die weitere Trennung der Zellkörper erfolgt während der Telophase Struktur und Aufbau des SCP Der SCP ist ein wichtiger Kontrollmechanismus, der gewährleisten soll, dass während der Mitose das genetische Material zu gleichen Teilen auf die beiden Tochterzellen verteilt wird (Jallepalli et al., 2001, Musacchio et al., 2002, Musacchio et al., 2007). Diese Aufgabe dient der Sicherstellung der genetischen Integrität und Stabilität während der folgenden Zellgenerationen. Diese Kontrollfunktionen werden von einem Proteinkomplex erfüllt, der sich in der Kinetochorregion der Chromosomen befindet (Cleveland et al., 2003, Bharadwaj et al., 2004, Tanaka et al., 2005, Yuen et al., 2005, Musacchio et al., 2007). Dieser Kinetochorkomplex besteht aus einer Vielzahl verschiedener Proteine. Seine Aufgabe ist es, wichtige Aspekte der Mitosekontrolle, wie korrekte Verbindung der Chromosomen mit der Mitosespindel als auch die Ausbildung einer polwärts gerichteten Zugkraft, integrativ zu erfassen (Rieder et al., 1994, Nicklas et al., 1995, Rieder et al., 1995, Stern et al., 2001).

21 Einleitung Funktion des SCP Der SCP ist solange inhibitorisch wirksam, bis alle Chromosomen in der korrekten Art und Weise mit den Mikrotubuli im Metaphaseäquator verbunden sind (siehe Abbildung 5). Amphitelische Orientierung Monotelische Orientierung Merotelische Orientierung Syntelische Orientierung Abbildung 5: Für die fehlerfreie Auftrennung des genetischen Materials ist eine korrekte Verbindung der Chromosomen mit der Mitosespindel nötig. Eine Schlüsselrolle spielen hierbei die Kinetochoren der beiden noch verbundenen Schwesterchromatiden. Eine wesentliche Voraussetzung für eine fehlerfreie Auftrennung ist, dass es zu einer korrekten Verbindung der beiden Kinetochoren mit den Mikrotubulistrukturen kommt. Bei diesem Prozess gibt es vielfältige Störungen, die eine fehlerfreie Auftrennung der Schwesterchromatiden verhindern können (Schnerch et al., 2006). Fehler in der Erkennung einer gestörten Verbindung zwischen Chromosomen und Mitosespindel (siehe Abbildung 5) werden als Hauptursache für Chromosomenfehlverteilungen angesehen (Jallepalli et al., 2001, Bharadwaj et al., 2004, Yuen et al., 2005). Sind alle Chromosomen in der korrekten Art und Weise mit der Mitosespindel verbunden, kommt es zur Cdc20-abhängigen Proteolyse von Securin und Cyclin B (Clute et al., 1999, Hagting et al., 2002). Damit beginnt die Trennung der Schwesterchromatiden (Musacchio et al., 2002). Der SCP ist somit fähig, den Beginn der Anaphase zu verzögern bis jedes fehlerhaft verbundene Chromosom eine korrekte Verbindung hergestellt hat (siehe Abbildung 5) (Rieder et al., 1994, Rieder et al., 1995) APC-Hemmung durch den SCP Falls nicht alle Chromosomen mit den Mikrotubuli im Metaphaseäquator verbunden sind oder sich keine ausreichende polwärts gerichtete Zugkraft über den Kinetochoren entwickelt, kommt es unter Vermittlung der Regulatorproteine des Kinetochorkomplexes des entsprechenden Chromosoms zur Ausbildung des sogenannten Mitotic Checkpoint Complex (MCC). Dieser stellt einen Komplex aus drei Proteinen (BubR1, Bub3 und Mad2) dar, die in der Lage sind, die aktivierende APC-Untereinheit Cdc20 effektiv zu binden und dadurch zu inaktivieren (siehe

22 Einleitung Abbildung 6) (Sudakin et al., 2001, Yu, 2002). Die ubiquitinabhängige Proteolyse von Cyclin B und Securin kann nicht erfolgen. Abbildung 6: Der Spindelcheckpoint (SCP). Der SCP ist für die korrekte mitotische Aufteilung der Chromosomen verantwortlich. Er stellt sicher, dass eine Trennung der Schwesterchromatiden erst erfolgen kann, wenn jedes einzelne Chromosom mit der Mitosespindel verbunden ist und sich über den Kinetochoren eine Zugkraft ausgebildet hat, die auf die beiden Spindelpole hin gerichtet ist. (Abbildung modifiziert nach Schnerch et al., 2006) Das MCC-Protein BubR1 hat eine besondere klinische Bedeutung, da biallelische Mutationen in dem dafür kodierenden hbub1b-gen zu dem seltenen MVA-Syndrom führen, welches mit einer hohen Prädisposition für Tumorerkrankungen einhergeht (Hanks et al., 2004, Lengauer et al., 2004). Das Protein Bub1 ist eine mitotische Kinase, die verschiedene Funktionen innerhalb des SCP-Netzwerks erfüllt. Bub1 trägt wesentlich zur Bildung des MCC bei (Seeley et al., 1999, Brady et al., 2000). Gleichzeitig kann Bub1 eine direkte Inhibition der APC Cdc20 -abhängigen Proteolyse durch Phosphorylierung von Cdc20 bewirken (Tang et al., 2004). Ferner ist Bub1 dafür verantwortlich, dass die Schwesterchromatiden während der Metaphase nur noch im Bereich der Kinetochore durch die sogenannten Cohesine verbunden bleiben. Diese können dort durch das Enzym Separase gespalten werden und ermöglichen die Verteilung der Schwesterchromatiden. Cohesinverbindungen im Bereich der Chromosomenarme würden zu einem Fortbestand der Schwesterchromatidverbindung führen und könnten deshalb die Auftrennung der DNA während der Anaphase stören (Kitajima et al., 2004, Kitajima et al., 2005). Aus der Komplexität der Interaktionen innerhalb des Proteinnetzwerks und der Vielzahl der beteiligten Komponenten erklärt sich dessen Anfälligkeit gegenüber verschiedensten Störeinflüssen. Eine veränderte Transkription oder der Verlust einzelner Komponenten können daher zu Störungen der SCP-Funktion führen.

23 Einleitung 1.8 Grundlagen der Krebsentstehung Bei der Krebsentstehung führt eine Vielzahl verschiedener Ursachen zu Veränderungen am genetischen Material. Es existieren verschiedene Modelle, die in der Lage sind, maligne Zellen anhand bestimmter Eigenschaften gegenüber somatischen Zellen abzugrenzen. Eines dieser Modelle beschreibt immer wiederkehrende Merkmale, die sich in praktisch allen malignen Zellen in variablem Ausmaß nachweisen lassen: Dazu gehört die Fähigkeit, sich zu teilen ohne sich durch inhibitorische Signale beeinflussen zu lassen. Darüber hinaus sind maligne Zellen in der Lage, Apoptose zu umgehen, Seneszenz zu vermeiden, Gefäßstrukturen zu induzieren, fremde Gewebe zu infiltrieren und Absiedlungen in fernen Körperarealen zu bilden (Hanahan et al., 2000, Evan et al., 2001, Malumbres et al., 2001, Hahn et al., 2002). Diese Veränderungen ermöglichen es der Zelle, sich unabhängig vom umliegenden Gewebe unbegrenzt zu vervielfältigen. Aufgrund der hohen proliferativen Aktivitäten treten maligne Zellen kaum noch in eine Differenzierung ein. Hierbei sind unter anderem zwei Komponenten von Bedeutung, die beide APC Cdh1 -abhängig reguliert werden (siehe Anschnitt 1.4.2). So werden Differenzierungsstörungen beispielsweise durch Veränderungen der transmembranären TGF-β Signaltransduktion verursacht. In normalen humanen Zellen führt dieser Signalweg durch Induktion der CKIs p21 und p15 zu wachstumshemmenden Effekten (Siegel et al., 2003) und dürfte im Zusammenspiel mit Cdh1 Differenzierungsprozesse unterstützen. Weiterhin sorgt die Familie der sogenannten Id (inhibitor of differentiation)-proteine dafür, dass innerhalb einer bestimmten Zellpopulation eine terminale Differenzierung unterbleibt. Dies wird unter anderem durch eine verminderte Transkription der CKIs p15, p16 und p21 erreicht (Ruzinova et al., 2003, Sikder et al., 2003). Dadurch ist gewährleistet, dass stets ein ausreichender Stammzellpool vorhanden ist, um die ständige Selbsterneuerung und das Wachstum der entsprechenden Zellpopulation zu garantieren (Ruzinova et al., 2003, Sikder et al., 2003). Diese Entwicklungen führen zur Beeinträchtigung von betroffenen Strukturen und Geweben und bei progredienter Entwicklung zum Tod des Organismus. Eine Vielzahl an Studien deuten darauf hin, dass Fehler in der Überwachung der genomischen Integrität dazu beitragen, dass sich zunehmende Veränderungen am genetischen Material in der Zelle einstellen (Lengauer et al., 1998, Loeb, 2001, Loeb et al., 2003). So kann es zu Mutationen und damit zum Funktionsverlust von sogenannten Tumorsuppressoren kommen, die eine antiproliferative Wirkung haben. In vergleichbarer Weise können Mutationen zu einer Aktivierung sogenannter Onkogene mit wachstumsfördernder Wirkung führen (Sherr, 2004, Vogelstein et al., 2004). Auch eine veränderte Transkription von Tumorsuppressoren und Onkogenen kann zu Wachstumsveränderungen führen (Vogelstein et al., 2004). Die Transkriptionsrate kann sich unter dem Einfluss bestimmter Transkriptionsfaktoren verändern, die die Bindung der RNA-Polymerase

24 Einleitung an die DNA regulieren und damit das Ausmaß der RNA-Synthese steuern. Polyploide und hypodiploide Chromosomensätze führen dazu, dass in einer Zelle mehr oder weniger Matrizen- DNA vorliegt als in diploiden Zellen. Durch das vermehrte oder verminderte Vorliegen spezifischer Genorte kommt es entsprechend zu einer veränderten Transkription (Pihan et al., 2003). Veränderungen der Basenabfolge des genetischen Materials, der Verlust von ganzen Chromosomen oder von Chromosomenbruchstücken oder epigenetische Veränderungen können somit die Entwicklung eines Krebsphänotyps hervorrufen. 1.9 Entstehung von numerischen und strukturellen Chromosomenaberrationen Numerische Chromosomenaberrationen (Aneuploidie) Bedeutung der numerischen Chromosomenaberrationen (Aneuploidie) Unter numerischer Chromosomenaberration oder Aneuploidie versteht man eine Abweichung der Chromosomenzahl von den unter normalen Umständen vorhandenen 46 (Schnerch et al., 2006). Diese Veränderung des Karyotyps sind in den meisten Krebsarten zu finden (Rajagopalan et al., 2004). Durch den aneuploiden Chromosomensatz kann sich das Gewebe besser an veränderte Umweltfaktoren anpassen und daher stärker proliferieren. Man nimmt an, dass Gendosiseffekte, die durch Hinzugewinn, Amplifikation oder Verlust von Sequenzen erklärbar sind, mit einem Selektionsvorteil für die Zelle einhergehen können. Der Verlust von Tumorsuppressorgenen und Hinzugewinn von Onkogenen kann, wie oben erwähnt, zu einer gesteigerten Proliferation führen (Duesberg et al., 1998, Hanahan et al., 2000, Li et al., 2000, Schnerch et al., 2006). Mit wachsender genetischer Instabilität kommt es zu einer zunehmenden Heterogenität innerhalb des Tumorgewebes. Dadurch ist gewährleistet, dass sich das Gewebe an wechselnde Bedingungen besser adaptieren und unter Selektionsdruck ein Auswachsen begünstigter Klone erfolgen kann. Trotzdem ist nicht abschließend geklärt, ob Aneuploidie ursächlich für die Tumorentstehung verantwortlich ist oder ob sie nur ein Begleitphänomen darstellt (Rajagopalan et al., 2004, Storchova et al., 2004, Schnerch et al., 2006). Eine Vielzahl verschiedener Mechanismen kann zur Entstehung von Aneuploidie führen, von denen die wichtigsten im Folgenden vorgestellt werden sollen.

25 Einleitung Ursachen numerischer Chromosomenaberrationen Ein Großteil der numerischen Chromosomenveränderungen ist durch Defekte während der Zellteilung bedingt (Dey, 2004, Rajagopalan et al., 2004, Schnerch et al., 2006). Eine fehlerhafte Aufteilung des genetischen Materials auf die beiden Tochterzellen kann sowohl durch die fehlerhafte Ausbildung der Mitosespindel als auch durch unzuverlässige Kontrollmechanismen hervorgerufen werden. Defekte Mitosespindeln sind beispielsweise multipolare Spindeln mit überzähligen Polen, die entstehen, wenn mehr als zwei Zentrosomen pro Zelle vorliegen (siehe Abbildung 7) (Nigg, 2002). Als wichtigste Ursache für Fehlverteilungen von Einzelchromosomen gelten gestörte Kontrollmechanismen durch SCP-Defekte (Jallepalli et al., 2001, Bharadwaj et al., 2004, Kops et al., 2005). Hierbei ist eine zuverlässige Verbindung der Chromosomen mit der Mitosespindel nicht mehr als unmittelbare Voraussetzung für den Beginn der Chromatidentrennung nötig. Es konnte gezeigt werden, dass Fehlverteilung von Chromosomen und spontane Aberrationen in einem weit größeren Ausmaß in Zellen beobachtet werden, die einen tetraploiden Chromosomensatz aufweisen (Fujiwara et al., 2005, Shi et al., 2005). (Konfokale Mikroskopie, Schnerch D. und Wäsch R.) Abbildung 7: Störungen der Chromosomentrennung. Als Ursachen von Aneuploidie werden SCP-Defekte, kritische Telomerverkürzung, multipolare Mitosespindeln (A) als Folge von Zentrosomenaberrationen, Tetraploidisierungen und defekte DNA- Reparaturmechanismen diskutiert. Hierbei kann es entweder zu einer primären Fehlverteilung von Chromosomen oder zur Ausbildung von Anaphasebrücken (B) während sogenannter Breakage-Fusion-Bridge- Zyklen (siehe Text) kommen. (Die Pfeile unter (A) zeigen die Position der Spindelpole an. Die Pfeile unter (B) markieren eine Anaphase-Brücke) Ebenfalls können übermäßig verkürzte Telomersequenzen, die sich mit jeder durchlaufenen Zellteilung weiter verkürzen (Engelhardt et al., 1997, Engelhardt et al., 2004), über sogenannte Breakage-Fusion-Bridge-Zyklen (Maser et al., 2002, Pihan et al., 2003) zu einer generellen Durchmischung des Genoms mit damit einhergehender Variabilität der Gesamtzahl der

26 Einleitung Chromosomen und Aneuploidie führen (Artandi et al., 2000, Hackett et al., 2002). Im Rahmen der Breakage-Fusion-Bridge-Zyklen kommt es zur Fusion von kritisch verkürzten Chromosomen. Dies kann die Ausbildung sogenannter dizentrischer Chromosomen mit jeweils zwei Kinetochorregionen nach sich ziehen. Diese Dizentrizität kann dazu führen, dass die beiden Kinetochore während der Anaphase zu entgegengesetzten Spindelpolen gezogen werden. Dadurch entstehen sogenannte Anaphase-Brücken (siehe Abbildung 7). Dadurch kommt es zu Chromosomenbrüchen. Die Fusion der Bruchstellen entweder mit weiteren geschädigten Chromosomen oder mit kritisch verkürzten Chromosomen bewirkt eine zunehmende Durchmischung des Genoms. Aneuploidie durch Breakage-Fusion-Bridge-Zyklen wird ebenfalls beobachtet, wenn DNA-Doppelstrangbrüche nicht zeitgerecht von den entsprechenden Reparaturmechanismen prozessiert werden (Pihan et al., 2003). Aneuploidie wird deshalb regelmäßig bei Vorliegen von DNA-Reparaturdefekten vorgefunden (van Gent et al., 2001, Maser et al., 2003, Mills et al., 2003) Strukturelle Chromosomenaberrationen (Translokationen) Diese chromosomalen Aberrationen spielen eine Rolle in der Pathogenese verschiedener hämatologischer Neoplasien. Chromosomale Translokationen lassen sich in zwei Untergruppen aufteilen. Die Aufteilung erfolgt anhand bestimmter Charakteristika wie dem Vorkommen in spezifischen Tumorentitäten und dem jeweils vorliegenden genetischen Hintergrund (Lengauer et al., 1998). Beiden Translokationstypen ist gemein, dass sie in der Lage sind, der entsprechenden Zelle zu einem Selektionsvorteil zu verhelfen und dadurch wesentlich zur Generierung neuer Tumorklone beitragen (Lengauer, 2001) Balancierte Translokationen Balancierte (einfache) Translokationen sind chromosomale Veränderungen, bei denen es zu keinen Veränderungen der Gesamtmenge des genetischen Materials kommt. Bei Translokationen kommt es zu einer Verbindung bestimmter Chromosomenabschnitte mit anderen Chromosomen. Einen Sonderfall stellt der Austausch von Chromosomenabschnitten zwischen nicht-homologen Chromosomen dar. Dies bezeichnet man als reziproke Translokation. Oft weisen balancierte Translokationen eine beachtliche Spezifität für eine spezielle Tumorentität auf. Daher wird eine kausale Rolle dieser Aberrationen in der Tumorentstehung vermutet. Translokationen bringen weit voneinander entfernte Sequenzbereiche in eine direkte Nachbarschaft. Dadurch können beispielsweise hochaktive Promotorsequenzen in die direkte Nachbarschaft eines spezifischen

27 Einleitung Genorts gelangen. Das betroffene Genprodukt kann als direkte Folge verstärkt exprimiert werden. Balancierte Translokationen können deshalb zu verstärkter Wachstumstendenz, verminderter Neigung zu Apoptose oder zu einem Differenzierungsblock führen. Im Hinblick auf die Ergebnisse dieser Arbeit ist insbesondere die Translokation t(8;21) von Bedeutung, die zu dem Fusionsprotein AML1-MTG8/AML1-ETO führt, das als Transkriptionsrepressor wirksam ist und in der Entstehung der akuten myeloischen Leukämie eine wichtige Rolle spielt Unbalancierte Translokationen Bei unbalancierten (komplexen) Translokationen kommt es zum Verlust oder Hinzugewinn von genetischem Material. Ein klassisches Beispiel ist die sogenannte Translokationstrisomie 21, bei der sich zusätzliches genetisches Material des Chromosoms 21, neben den beiden unverändert vorliegenden Chromosomen 21, an ein anderes Chromosom angelagert hat. Die entsprechenden Zellen weisen meist eine Vielzahl verschiedener genetischer Veränderungen auf (Lengauer, 2001). Ein wesentlicher Unterschied zu balancierten Translokationen sind die regelmäßig auftretenden Deletionen und Amplifikationen, die zu Gendosisveränderungen führen (Artandi et al., 2000, Lengauer, 2001) Chromosomenaberrationen in Tumorzellen Sowohl numerische als auch strukturelle Chromosomenaberrationen können in Tumorzellen zu einem Wachstumsvorteil führen. Strukturelle Chromosomenaberrationen, wie beispielsweise die Translokation t(8;21), werden häufig in akuten myeloischen Leukämien gefunden und sind daher für das Verständnis der molekularen Leukämogenese essentiell. Numerische Chromosomenaberrationen können durch Störungen während der Mitose entstehen. Deregulationen der APC-abhängigen Proteolyse können daher zur Entstehung von aberranten Chromosomensätzen beitragen.

28 Einleitung 1.10 Zielsetzung der Arbeit Untersuchung der APC-abhängigen Proteolyse während der G1-Phase bei AML- Zellen Derzeitige Theorien zur Krebsentstehung konzentrieren sich unter anderem auf die Deregulation von zentralen Steuerungsproteinen, die wichtige Funktionen während der G1-Phase erfüllen. Daher sollte die Funktionalität der APC Cdh1 -abhängigen Regulationsmechanismen während dieser sensiblen Zellzyklusphase untersucht werden. Die aktivierende APC-Untereinheit Cdh1 ist ein wichtiges Protein in der Regulation der Zellzykluskontrollproteine während der G1-Phase und ist zusammen mit den CKI p21 und p27 an der zeitlichen Steuerung dieses Zellzyklusabschnittes beteiligt. Neuere Arbeiten legen zudem eine wichtige Rolle für APC Cdh1 in Differenzierungsprozessen während der G1-Phase nahe. Deregulationen von APC Cdh1 können somit sowohl ein vorzeitiges Überschreiten des Restriktionspunktes mit verfrühtem Eintritt in einen neuen Zellteilungszyklus als auch gestörte Differenzierungsprozesse nach sich ziehen. Da beides klassischerweise in Tumoren beobachtet werden kann, sollte die Rolle von APC Cdh1 bei der AML bei der Regulation dieser Prozesse näher untersucht werden Untersuchung der APC-abhängigen Proteolyse während Mitose bei AML-Zellen Die aktivierende APC-Untereinheit Cdc20 ist vor allem während der Mitose aktiv und stellt die Zielstruktur des Spindelcheckpoint (SCP) dar. Bei Störungen während der Mitose wird durch Inhibition von APC Cdc20 eine Verzögerung des Anaphasebeginns bewirkt, um eine Chromosomenfehlverteilung zu verhindern. Die meisten Tumoren weisen einen aneuploiden Chromosomensatz auf (Rajagopalan et al., 2004). In einem kleinen Teil dieser Tumoren konnten Mutationen in SCP-Genen nachgewiesen werden (Cahill et al., 1998, Ohshima et al., 2000, Ru et al., 2002, Hempen et al., 2003, Kops et al., 2005). Im Hinblick auf die Häufigkeit von SCP- Defekten stellen Mutationen jedoch ein relativ seltenes Ereignis dar, so dass epigenetische Faktoren und die unterschiedliche Expression von SCP-Proteinen als wesentliche Mechanismen diskutiert werden (Takahashi et al., 1999, Jaffrey et al., 2000, Gemma et al., 2001, Shigeishi et al., 2001, Shichiri et al., 2002, Doak et al., 2004). Es konnte gezeigt werden, dass diese Defekte zu einer Chromosomenfehlverteilung während der Zellteilung führen und sie damit in der Lage sind, einen aneuploiden Chromosomensatz zu generieren (Kops et al., 2005). Aneuploide Chromosomensätze treten besonders häufig in soliden Tumoren auf. Deshalb wurde die Integrität des SCP-Netzwerks bei diesen Erkrankungen bereits in vielen Arbeiten untersucht (siehe oben). Hierbei konnte ein Zusammenhang zwischen SCP-Defekten und dem Vorliegen von Aneuploidie

29 Einleitung hergestellt werden (Rajagopalan et al., 2004). Da viele hämatologische Neoplasien nur leichte Karyotypveränderungen aufweisen ist die Rolle von SCP-Störungen bei diesen Erkrankungen weniger klar als in soliden Tumoren. Jedoch konnten wir in AML-Zelllinien Hinweise auf Störungen des SCP finden. Die Untersuchungen des Mitoseablaufs an verschiedenen AML- Zellinien sollten zeigen, ob eine regelrechte proteolyseabhängige Anaphasekontrolle in akuter myeloischer Leukämie vorliegt oder ob sich Störungen in der Mitose nachweisen lassen. Spindelcheckpoint-Defekte bei akuter myeloischer Leukämie könnten als Ursache für die Entstehung und Progression von Krankheitsfällen mit Karyotypveränderungen in Betracht kommen.

30 Material 2 Material 2.1 Chemikalien Acrylamid/Bisacrylamid 40% Bio-Rad Labortories (Hercules, USA) Agarose Invitrogen (Carlsbad, USA) Albumin Fraktion V Carl Roth GmbH (Karlsruhe, D) Ammoniumperoxodisulfat Bio-Rad Labortories (Hercules, USA) Ampicillin Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) Aqua dest Invitrogen (Carlsbad, USA) β-mercaptoethanol Fluka Chemie AG (Buchs, CH) Blasticidin Invitrogen (Carlsbad, USA) Bromphenolblau Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) Chloroform Mallinckrodt Baker (Deventer, NL) Chloroquin Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) EDTA Carl Roth GmbH (Karlsruhe, D) Essigsäure 100% Merck KGaA (Darmstadt, D) Ethanol 100% VWR International (Fontenay, F) Ethidiumbromid 10mg/ml Invitrogen (Carlsbad, USA) Giemsa Azur-Eosin-Methylenblaulösung Merck KGaA (Darmstadt, D) Glycerin Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) Glycin Carl Roth GmbH (Karlsruhe, D) Hepes Buffer Solution 1M Invitrogen (Carlsbad, USA) Hoechst Calbiochem (Darmstadt, D) Isopropanol Carl Roth GmbH (Karlsruhe, D) Kaliumchlorid Carl Roth GmbH (Karlsruhe, D) Methanol Merck KGaA (Darmstadt, D) MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al) Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) Natriumchlorid Fluka Chemie AG (Buchs, CH) Natriumdodecylsulfat (SDS) Carl Roth GmbH (Karlsruhe, D) Natriumhydroxid 10% Merck KGaA (Darmstadt, D) Natriumvanadat Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) Normal Donkey Serum Jackson IR (West Grove, USA)

31 Material Paraformaldehyd (PFA) Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) Polybrene Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) Polylysin Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) Phosphate Buffered Saline (Pulverform) Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) PMSF Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) Propidiumiodid (PI) Molecular Probes (Leiden, NL) Propylgallat Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) Puromycin Invitrogen (Carlsbad, USA) RNase A Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) Salzsäure 25% Merck KGaA (Darmstadt, D) Skim Milk Powder Fluka Chemie AG (Buchs, CH) TEMED Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) Triton X-100 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) Trizma Base Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) Xylencyanol Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 2.2 Nukleinsäuretechniken Kits und Reagenzien DNAse Kit (DNA-free) Ambion Inc. (Austin, USA) ET-Terminator-Mix Amersham (Little Chalfont, GB) Nucleotid-Mix für PCR MBI Fermentas (Burlington, C) PCR Buffer 10x Qiagen Inc. (Valencia, USA) PCR-Hütchen 0,2mL (MicroAmp) Applied Biosyst. (Foster City, USA) PCR Purification Kit Qiagen Inc. (Valencia, USA) QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen Inc. (Valencia, USA) QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen Inc. (Valencia, USA) MinElute Gel Extraction Kit Qiagen Inc. (Valencia, USA) CIAP-Kit MBI Fermentas (Burlington, C) T4-DNA-Ligase inkl. Puffer New England Biolabs (Ipswich, USA) Phaselog Gel 2.0mL heavy Eppendorf (Hamburg, D) Sämtliche Restriktionsenzyme New England Biolabs (Ipswich, USA) RNeasy Mini Kit (50) Qiagen Inc. (Valencia, USA) RT-Kit (SuperScript First Strand Synthesis

32 Material System for RT-PCR) Taq DNA Polymerase Trizol LS Reagent Invitrogen (Carlsbad, USA) Qiagen Inc. (Valencia, USA) Invitrogen (Carlsbad, USA) PCR-Primer Produktname Primersequenz Cdh1 Sense: 5`-GAGCACGCACGGCTACTCAC-3` (AS:1251) Antisense: 5`-ACATGGTTCACAATCAGGCATTTA-3` (AS:1651) GAPDH Sense: 5`-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3` (AS: 88) Antisense: 5 -ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3` (AS: 408) Bub1 Sense: 5`-AGCCCAAAACAGGCCTTGTCG-3` (AS:2073) Antisense: 5`-GAGATGACAAGACCTTGAGGC-3` (AS:2779) p21 Sense: 5 -GACACCACTGGAGGTGACT-3 (AS: 246) Antisense : 5 -ACAAGTGGGGAGGAGGAAGT-3 (AS: 930) Cdc20 (Primerpaar 1) Sense: 5`-CGCCAACCGATCCCACAG-3` (AS:245) Antisense: 5`-CAGGTTCAAAGCCCAGGC-3` (AS:470) Cdc20 (Primerpaar 2) Sense: 5`-CCAGACGCCCACCAAGAA-3` (AS:421) Antisense: 5`-CAGGATACGGTCTGGCAG-3` (AS:638) shrna-oligonukleotidsequenzen Bezeichung Sequenz Bub1-1 Top Strand Bub1-1 Bottom Strand 5' gatccccgaagtgcctcatgctgaagttcaagagacttcagcatgaggcacttctttttggaaa 3' 5' agcttttccaaaaagaagtgcctcatgctgaagtctcttgaacttcagcatgaggcacttcggg 3' Bub1-2 Top Strand Bub1-2 Bottom Strand 5' gatccccctgcacaacttgcgtctacttcaagagagtagacgcaagttgtgcagtttttggaaa 3' 5' agcttttccaaaaactgcacaacttgcgtctactctcttgaagtagacgcaagttgtgcagggg 3' Bub1-3 Top Strand Bub1-3 Bottom Strand 5' gatccccggactgttgatgctccaaattcaagagatttggagcatcaacagtcctttttggaaa 3' 5' agcttttccaaaaaggactgttgatgctccaaatctcttgaatttggagcatcaacagtccggg 3'

33 Material Bub1-4 Top Strand Bub1-4 Bottom Strand 5' gatcccccccaagactgaatttcaatttcaagagaattgaaattcagtcttgggtttttggaaa 3' 5' agcttttccaaaaacccaagactgaatttcaattctcttgaaattgaaattcagtcttgggggg 3' BubR1-1 Top Strand BubR1-1 Bottom Strand 5 gatccccgttatagtgatcctcgatttttcaagagaaaatcgaggatcactataatttttggaaa 3 5 agcttttccaaaaattatagtgatcctcgattttctcttgaaaaatcgaggatcactataacggg 3 BubR1-2 Top Strand BubR1-2 Bottom Strand 5 gatccccggaaagcagatgcgatattttcaagagaaatatcgcatctgctttcctttttggaaa 3 5 agcttttccaaaaaggaaagcagatgcgatatttctcttgaaaatatcgcatctgctttccggg 3 BubR1-3 Top Strand BubR1-3 Bottom Strand 5 gatccccgaagagacgatgcctacaattcaagagattgtaggcatcgtctcttctttttggaaa 3 5 agcttttccaaaaagaagagacgatgcctacaatctcttgaattgtaggcatcgtctcttcggg 3 BubR1-4 Top Strand BubR1-4 Bottom Strand 5 gatccccgcagcagaaacgggcatttttcaagagaaaatgcccgtttctgctgctttttggaaa 3 5 agcttttccaaaaagcagcagaaacgggcattttctcttgaaaaatgcccgtttctgctgcggg 3 BubR1-5 Top Strand BubR1-5 Bottom Strand 5 gatccccgccctctggatgtttgggatttcaagagaatcccaaacatccagagggtttttggaaa 3 5 agcttttccaaaaaccctctggatgtttgggattctcttgaaatcccaaacatccagagggcggg 3 BubR1-6 Top Strand BubR1-6 Bottom Strand 5 gatccccgcccatgaaataacagtgttttcaagagaaacactgttatttcatgggtttttggaaa 3 5 agcttttccaaaaacccatgaaataacagtgtttctcttgaaaacactgttatttcatgggcggg Verwendete Plasmidvektoren psuper plenti6/ubc/v5-gw plentilox 3.7 pbabe-puro pmdlg/prre prsv-rev pmd2g (VSV) Verwendete Bakterienstämme Top10 E. coli Stbl3 E. coli DB3.1 E.coli DH5alpha E.coli

34 Material 2.3 Elektrophoresetechniken Kits und Reagenzien Bradford Solution (Konzentrat) Bio-Rad Labortories (Hercules, USA) DNA-Ladder Mix (SM0331) MBI Fermentas (Burlington, C) ECL Plus Amersham (Little Chalfont, GB) Entwicklungsfilme (ECL-Filme) Amersham (Little Chalfont, GB) Ponceau S Solution Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) Kaleidoskopstandard für WB ( ) Bio-Rad Labortories (Hercules, USA) Re-Blot Plus Strong/Mild Chemicon Int. (Temecula, USA) SuperSignal West Pico ECL-Lösung Pierce Biotechnology (Rockford, USA) Tween 20 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) Western Blot Transfermembranen Millipore Corp. (Billerica, USA) Whatman-Papier (Filterwatte) Whatman (Middlesex, GB) Antikörper Cdc20 (sc-8358) Santa Cruz Biotechnology Cyclin A (611268) BD (Franklin Lakes, USA) Cyclin B (sc-752) Santa Cruz Biotechnology Cdh1 (CC43) Oncogene Research Products Actin (A 2066) Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) Alpha-Tubulin (T 5168) Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) Rabbit-anti-Mouse Cy3 ( ) Jackson IR (West Grove, USA) Mad2 (sc-6329) Santa Cruz Biotechnology Bub1 (A A) Dunn Labortechnik GmbH BubR1 (612502) BD (Franklin Lakes, USA) Bub3 (611730) BD (Franklin Lakes, USA) MOPC-21 (M 7894) Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) Securin (PTTG1) Zytomed Systems (Berlin, D) Goat-anti-Rabbit FITC ( ) Jackson IR (West Grove, USA) Goat-anti-Mouse FITC (F 0479) DakoCytomation (Glostrup, DK) Phospho-HistoneH3 (Ser10) (#9701) Cell Signaling Technology Donkey-anti-Rabbit-HRP (NA9340) Amersham (Little Chalfont, GB) Sheep-anti-Mouse-HRP (A5906) Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) Bovine-anti-Goat-HRP (sc-2378) Santa Cruz Biotechnology

35 Material 2.4 Zellkultur Zelllinien HL-60 AML M3 Kasumi-1 AML M2, t(8;21) SKNO-1 AML M2, t(8;21) KG-1 AML K562 CML, Blastenkrise Karpas422 B-NHL (diffus-großzellig) MC116 B-NHL BV173 B-ALL U698 B-NHL Jurkat T-ALL PF382 T-ALL DG-75 Burkitt-Lymphom Raji Burkitt-Lymphom NCI-H82 kleinzelliges Bronchialkarzinom NCI-H69 kleinzelliges Bronchialkarzinom HeLa Zervixkarzinom U-2 Os Osteosarkom HaCaT humane Keratinozytenlinie Kulturgefäße 96 well-platte (Cellstar) Greiner Bio-One (Kremsmünster, A) Kryobox (Cryo Container) Nalgene (Rochester, USA) Kryoröhrchen 1,0mL, 2,0mL Corning (Acton, USA) Zellkulturflaschen 25, 75, 175cm² NUNC (Roskilde, DK) Zellkulturschalen 6 und 10cm Durchmesser Greiner Bio-One (Kremsmünster, A)

36 Material Nährmedien DMEM Kulturmedium RPMI1640 Kulturmedium Invitrogen (Carlsbad, USA) Invitrogen (Carlsbad, USA) Zytokine Flt3 CellGenix (Freiburg, D) Filgrastim (Neupogen) Amgen (Thousand Oaks, USA) GM-CSF CellGenix (Freiburg, D) IL-3 CellGenix (Freiburg, D) IL-6 CellGenix (Freiburg, D) Kit-Ligand CellGenix (Freiburg, D) TPO CellGenix (Freiburg, D) weitere Materialien und Reagenzien DMSO Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) Fetales Rinderserum (FCS) Biochrom AG (Berlin, D) L-Glutamin Invitrogen (Carlsbad, USA) Lymphozytenseparationsmedium PAA Laboratories (Pasching, A) Natriumpyruvat Invitrogen (Carlsbad, USA) Neubauer-Zählkammer Marienfeld (Lauda-Königshofen, D) Nocodazol Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) PBS-Lösung Invitrogen (Carlsbad, USA) Penicillin / Streptomycin Invitrogen (Carlsbad, USA) Thymidin Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) Trypanblau 0,4% Invitrogen (Carlsbad, USA) Trypsin-EDTA (1X) IN Invitrogen (Carlsbad, USA) 2.5 Weiteres Zubehör 6 well-platte (Cellstar) Greiner Bio-One (Kremsmünster, A) Deckgläschen Carl Roth GmbH (Karlsruhe, D) Eppendorf-Hütchen Sarstedt (Nümbrecht-R., D) Kunststoffpipettenaufsätze 2, 5, 10, 25mL Corning (Acton, USA)

37 Material FACS-Röhrchen BD (Franklin Lakes, USA) Nagellack Interco (Wiesbaden, D) Objektträger R. Langenbrinck (Teningen, D) Pipettenspitzen bis 20µL, bis 1000µL Sorenson (Salt Lake City, USA) Pipettenspitzen bis 200µL Corning (Acton, USA) Versuchsröhrchen 15mL Greiner Bio-One (Kremsmünster, A) Versuchsröhrchen 50mL Greiner Bio-One (Kremsmünster, A) 2.6 Software Adobe Photoshop CS Adobe Systems Inc. (San Jose, USA) AxioVision Carl Zeiss AG (Oberkochen, D) CellQuest 3.1 Becton Dickinson (Franklin Lakes, USA) Chromas Technelysium Pty Ltd (Helensvale, AUS) FlowJo Tree Star, Inc. (Ashland, USA) ModFit LT Verity Software House (Topsham, USA) Scan Wizard 5 Microtek (Willich, D) Vector NTI InforMax, Inc. (Frederick, USA) 2.7 Geräte Agarosegelelektrophoresekammer Hans-Thoma GmbH (Freiburg, D) Axioplan 2 Fluoreszenzmikroskop Carl Zeiss AG (Oberkochen, D) Blottingkammer Trans Blot Cell Bio-Rad Labortories (Hercules, USA) Brutschrank (Nuaire R Autoflow) Integra Biosciences (Chur, CH) Entwicklungskästchen Siemens (München, D) FACSCalibur BD (Franklin Lakes, USA) Filmentwickler (Optimax) Protec (Schwerin, D) Gelkammer Mini Protean 3 Dodeca Cell Bio-Rad Labortories (Hercules, USA) Handhomogenisator Nalgene (Rochester, USA) Heizblock VWR International (Fontenay, F) IKAMAG RCT Thermomagnetrührer IKA Labortechnik (Staufen, D) Lichtmikroskop CK2 Olympus (Hamburg, D) Photometer Ultrospec III Pfizer (New York, USA) ph-meter (ph330) WTW (Weilheim, D)

38 Material Pipetboy acu Integra Biosciences (Chur, CH) Pipetman P2, P20, P200, P1000 Gilson (Middleton, USA) Power Supply Pharmacia LKB GPS 200/400 Pfizer (New York, USA) Präzisionswaage (SBA41) Scaltec (Heiligenstadt, D) Schüttler (Mini-Rocker Shaker) PeqLab (Erlangen, D) Sterilbank (2F120-II GS) Integra Biosciences (Chur, CH) Thermocycler, GeneAmp PCR System 2400 Perkin Elmer (Wellesley, USA) Tischzentrifuge (Centrifuge 5415 D) Eppendorf (Hamburg, D) UV-Kammer mit Druckgerät (FASY RH-3) Herolab (Wiesloch, D) Vari Mag Elektrorührgerät Maxi HP1P Komet (Lemgo, D) Vortexer (REAX 2000) Heidolph (Schwabach, D) Wasserthermobad GFL (Großburgwedel, D) Zellzentrifuge (Minifuge T) Heraeus Sepatech (Osterode, D) 2.8 Lösungen Agarosegel Ladepuffer (10x) 100mL 250mg Bromphenolblau 250mg Xylencyanol 33mL 150mM Tris ph 7,6 60mL Glycerin 7mL Aqua dest Ampicillin-Stammlösung (50µg/µL) 500mg Ampicillin 10mL Aqua dest Annealing Buffer (10x) 1M Kaliumacetat 300mM HEPES (ph 7,4) 20mM Magnesiumacetat

39 Material APS-Lösung 10% (w/v) Ammoniumperoxodisulfat in Aqua dest Blasticidin-Stammlösung 5mg/mL Blasticidin in Aqua dest Sterilfiltration über 0,22µm-Filter nötig Blockpuffer für Immunfluoreszenzmikroskopie 1% (w/v) Albumin Fraktion V 10% (v/v) Normal donkey serum in PBS Blockpuffer für Western Blot-Membranen 3g Skim Milk Powder 3g Albumin Fraktion V 200mL PBS Bradford-Lösung 20% (v/v) Bradford-Solution (5x Konzentrat) in Aqua dest Calciumchloridlösung (2,5M) 277,47g Calciumchlorid mit Aqua dest ad 1L Sterilfiltration über 0,22µm-Filter nötig Chloroquinstammlösung 2,5µM in Aqua dest Sterilfiltration über 0,22µm-Filter nötig DTT-Lösung 1M Dithiothreitol in Aqua dest

40 Material Giemsa-Färbelösung (für 124,5mL) 60mL Puffer A (9,08g KH 2 PO 4 /L) 60mL Puffer B (11,88g Na 2 H 2 PO 4 /L) 4,5mL Giemsa Azur-Eosin-Methylenblaulösung Glukoselösung (1M) 180,16g Glukose mit Aqua dest ad 1L HBS-Puffer (2x), ph 7,05 50mM HEPES 10mM Kaliumchlorid 12mM Dextrose 280mM Natriumchlorid 1,5mM Na 2 HPO 4 Sterilfiltration über 0,22µm-Filter nötig Kaliumchloridlösung (1M) 74,55g Kaliumchlorid mit Aqua dest ad 1L LB-Medium für Bakterienkultur, ph 7,0 10g Bacto-Tryptone 5g Bacto-yeast-Extrakt 10g Natriumchlorid Einstellen des ph mit Natriumhydroxid (10M) Zugabe von Aqua dest ad 1L Lithiumchloridlösung (4M) 169,56g Lithiumchlorid mit Aqua dest ad 1L

41 Material Lysepuffer 420 mm NaCl 0,1mM Natriumvanadat 20mM HEPES (ph 7,9) 10mM KCl 1mM EDTA 1mM PMSF 1mM DTT in Aqua dest 20% (v/v) Glycerin Magnesiumchlorid (1M) 95,21g Magnesiumchlorid mit Aqua dest ad 1L Sterilfiltration mit 0,22µm-Filter nötig MG-132-Stammlösung 20mM MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al) in DMSO Mounting Medium für Immunfluoreszenzmikroskopie 89,9% (v/v) Glycerin 10% (v/v) PBS (10x) 0,1% (w/v) Propylgallat Natriumacetatlösung (3M) 246,09g Natriumacetat mit Aqua dest ad 1L Nocodazol-Stammlösung 400µg Nocodazol 1mL DMSO

42 Material PBS (10x) für Inkubation der Nitrozellulosemembranen 1L 80g Natriumchlorid 2g Kaliumchlorid 26,8g Na 2 HPO 4-7H 2 O 2,4g KH 2 PO 4 800mL Aqua dest Anpassen des ph auf 7,4 mittels Salzsäure 25% mit Aqua dest auf ein Endvolumen von 1L Permeabilisierungspuffer für Multiparameterimmunfluoreszenz 1% (v/v) fetales Rinderserum 0,25% (v/v) Triton X-100 in PBS PMSF-Lösung 0,2M PMSF in Ethanol Polylysin-Coatingbuffer 10% (v/v) Polylysin in Aqua dest Polybrene-Stammlösung 80mg Polybrene 10mL Aqua dest Propidiumiodid-Lösung 100mL 500µg Propidiumiodid 80mL PBS 0,1% (v/v) Triton X-100 mit PBS auf ein Endvolumen von 100mL Puffer für Polyacrylamidgelelektrophorese (5x) 48g Glycin 10g Trizma Base 5g Natriumdodecylsulfat mit Aqua dest auf ein Endvolumen von 1L

43 Material Puffer für Proteinblotting 3,03g Trizma Base 14,41g Glycin 200mL Methanol mit Aqua dest auf ein Endvolumen von 1L Puromycin-Stammlösung 25mg Puromycin 10mL Aqua dest SDS 10% (w/v) 1L 100g SDS 900mL Aqua dest SOC-Medium für Bakterienkultur, ph 7,0 20g Bacto-Tryptone 5g Bacto-yeast-Extrakt 0,5g Natriumchlorid 2,5mL Kaliumchlorid (1M) Einstellen des ph mit Natriumhydroxid (10M) Zugabe von Aqua dest ad 970mL Sterilisation durch Autoklavieren Zugabe von 10mL sterilem Magnesiumchlorid (1M) Zugabe von 20mL steriler Glukose (1M) TAE (Tris-Acetat-Puffer) (50x) 1L 242g Trizma base in 500mL Aqua dest 100mL 0,5M Na 2 EDTA (ph 8,0) 57,1mL Essigsäure mit Aqua dest auf ein Endvolumen von 1L Thymidin-Stammlösung 250mM Thymidin in Aqua dest Sterilfiltration mit 0,22µm-Filter nötig

44 Material Tris 1,87M ph 8,8 56,8g Trizma base 250mL Aqua dest Einstellen des ph mittels Natriumhydroxid 10% (v/v) Tris 1,26M ph 6,8 37,8g Trizma base 250mL Aqua dest Einstellen des ph mittels Salzsäure 25% (v/v) Waschlösung für Western Blot-Membranen 0,1% (v/v) Tween 20 in PBS Waschpuffer für Multiparameterimmunfluoreszenz 1% (v/v) fetales Rinderserum in PBS Western Blot Ladepuffer (4x) 50mL 3,2mL Tris 1,87M ph 8,8 4g SDS 20mL Glycerin 1,25mL β-mercaptoethanol 1mL 0,5% (w/v) Bromphenolblau mit Aqua dest auf ein Endvolumen von 50mL

45 Methoden 3 Methoden 3.1 Arbeiten mit Zellen Zellkultur Das Wachstum aller Zellen erfolgte im Brutschrank bei 37 C, 5% CO 2 und Wasserdampfsättigung. Das Nährmedium wurde in Abhängigkeit von den Wachstumseigenschaften der Zellinien zwei- bis dreimal pro Woche gewechselt. Zur asynchronen Analyse wurden die Zelllinien, die in Suspension vorlagen, auf eine Startdichte von 0,3 x 10 6 pro ml gebracht und anschließend für 48 Stunden inkubiert. HeLa-Zellen wurden nach Kontaktinhibition auf ein Zehntel, U-2 Os- und HaCaT-Zellen auf ein Fünftel der Ausgangsdichte gesplittet und nachfolgend für 48 Stunden in Kultur gehalten. NCI-H82- und NCI- H69-Zellen stellten insofern eine Besonderheit dar, als dass sie im Nährmedium Konglomerate bildeten und so nicht exakt quantifizierbar waren. Zur asynchronen Analyse wurde ein Viertel der Ausgangszellkonzentration eingesetzt und 48 Stunden inkubiert. Zellinie Kulturmedium HL-60, KG-1, K562, U698, Jurkat, PF382, DG-75, Raji, NCI-H82, NCI-H69 RPMI-Basisnährmedium (RPMI1640, 10% (v/v) FCS, 2mM Glutamin, 1mM Natriumpyruvat, 50units/mL Penicillin, 50µg/mL Streptomycin) SKNO-1 RPMI-Basisnährmedium (siehe oben), 10ng/mL GM-CSF Kasumi-1, Karpas422, MC116, BV173 RPMI-Basisnährmedium (siehe oben) jedoch mit 20% FCS HeLa, U-2 Os, HaCaT DMEM-Medium, 10% (v/v) FCS, 2mM Glutamin, 1mM Natriumpyruvat, 50units/mL Penicillin, 50µg/mL Streptomycin

46 Methoden Kryokonservierung von humanen Zellen Es erfolgte die Zentrifugation von mindestens 10 x 10 6 Zellen pro ml. Der zellfreie Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 1mL DMSO (10%) in FCS resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in ein hierfür vorgesehenes Kryoröhrchen pipettiert und in einer mit Isopropanol befüllten Kryobox bei -80 C gelagert. Der Transfer der Kryoröhrchen in den Stickstofftank erfolgte frühestens am Folgetag. Kryokonserviertes Zellmaterial wurde im warmen Wasserbad bei 37 C zügig aufgetaut. Die Zellsuspension wurde in der Pipette aufgenommen und mit 10mL Nativmedium verdünnt. Die Zellsuspension wurde zentrifugiert und der zellfreie Überstand verworfen. Das Zellpellet wurde in der gewünschten Menge Nativmedium resuspendiert und die Zellen wurden im Brutschrank unter Kulturbedingungen inkubiert Separation von mononukleären Zellen aus peripherem Blut und Knochenmarkaspirat Nach der Methode von Böyum wurden mononukleäre Zellen durch den Ficollgradienten mittels Lymphozytenseparationsmedium aus EDTA-Blut gewonnen (Boyum, 1968). Hierzu wurde EDTA- Blut zu gleichen Teilen mit PBS verdünnt. Die Vollblutverdünnung wurde in einem 50 ml Versuchsröhrchen auf 15mL Lymphozytenseparationsmedium geschichtet. Die Zentrifugation ohne Bremse führte zur Ausbildung eines Konzentrationshorizontes aus welchem die mononukleären Zellen mit der Pipette abgesammelt werden konnten. Es folgten mehrere Waschschritte mit PBS In vitro Stimulation von primären AML-Zellen Das Wachstum der mononukleären Zellen erfolgte in RPMI-Medium mit 20% FCS, 1mM Natriumpyruvat, 50units/ml penicillin, 50µg/ml streptomycin, 100ng/mL Kit-Ligand, 20ng/mL IL-3 und 20ng/mL GM-CSF. Die Zellen wurden bei einer Startdichte von 0,8 x 10 6 pro ml in Suspension gebracht und für 72 Stunden inkubiert. Für eine intensivierte Stimulation wurde folgende Nährmedium verwendet: RPMI-Medium mit 20% FCS, 1mM Natriumpyruvat, 50units/ml penicillin, 50µg/ml streptomycin, 100ng/mL Kit-Ligand, 50ng/mL Flt3, 40ng/mL TPO, 50ng/mL IL- 3, 20ng/mL IL-6 und 100ng/mL G-CSF. Die Zellen wurden in diesem Nährmedium in einer Startdichte 2 x 10 5 Zellen pro ml in Suspension gebracht und für 4 Tage in Kultur gehalten.

47 Methoden Einfach-Thymidin-Synchronisation Die Thymidin-Synchronisation dient der Synchonisation einer asynchronen Zellpopulation in der frühen S-Phase und soll die Untersuchung einer synchronisierten Zellpopulation erlauben. Die Zellkonzentration wurde auf 0,3 x 10 6 Zellen pro ml eingestellt. Es erfolgte eine Inkubation unter Kulturbedingungen für 48 Stunden. Die Zellsuspension wurde zentrifugiert und der zellfreie Überstand verworfen. Die Zellpellets wurden in Nährmedium mit 2mM Thymidin resuspendiert. Die Thymidinexposition erfolgte für 18 Stunden. Die Zellen wurden anschließend in PBS gewaschen und in nativem Nährmedium resuspendiert, um ein synchrones Wachstum zu ermöglichen Doppel-Thymidin-Synchronisation Das Wachstum von 1,15x10 6 Zellen pro ml erfolgte bei einer Thymidinkonzentration von 2mM für eine Dauer von 14 Stunden. Es folgte eine Zentrifugation der Zellen und ein nachfolgend komplettes Verwerfen des zellfreien Überstandes. Die Zellen wurden in PBS gewaschen. Durch Resuspension in 20ml Nährmedium und Inkubation für zehn Stunden wurde der Eintritt der Zellen in den Zellzyklus ermöglicht. Nachfolgend erneutes Wachstum bei 2mM Thymidin für 14 Stunden mit beendendem Waschschritt in PBS. Die Zellzyklusanalyse erfolgte zu verschiedenen Zeitpunkten nach Ersatz des thymidinhaltigen gegen natives Nährmedium Hervorrufen eines Mitosespindeldefektes Die Zugabe des mikrotubulidepolimerisierenden Agens Nocodazol (200ng/mL) verhinderte nach Zugabe in das Kulturmedium in der Zelle die Ausbildung einer Mitosespindel. Dies führt in intakten Zellen zu einer Verzögerung der Zellteilung, da hierbei die exakte Auftrennung des genetischen Materials auf die Tochterzellen nicht mehr gewährleistet ist Proteasominhibition in Zellinien Asynchron wachsende Zellen wurden nach einer Einfach-Thymidin-Synchronisation in den folgenden Zellzyklus entlassen. Nach einer synchronen fünfstündigen Progression wurde MG-132 zugegeben (Endkonzentration im Medium 10µM). Die Zugabe erfolgte zu einem relativ späten Zeitpunkt, um Zellzyklusverzögerungen infolge von Stabilisierungen bestimmter Regulatorproteine zu reduzieren und dadurch eine bestmögliche Progression in Mitose zu ermöglichen. Die Zellernte erfolgte vier Stunden nach Zugabe von MG-132. In HeLa-Zellen nach BubR1-

48 Methoden Knockdown wurde die Proteasominhibition an asynchron wachsenden Zellen für eine Dauer von 24 Stunden vorgenommen Immunfluoreszenzmikroskopie Anheftung der Suspensionszellen auf dem Deckgläschen Die Zellen wurden durch Resuspension des Zellpellets in 400µl PBS unter Hinzugabe von 5ml Paraformaldehyd (4%) fixiert. Es folgte ein Inkubationsschritt bei 4 C über Nacht. Die Beschichtung von mikroskopischen Deckgläschen erfolgte in einer 6-well-Platte. Die Deckgläschen wurden mit Polylysin (10%) in Aqua dest beschichtet und für fünf Minuten inkubiert. Es erfolgte ein zweifacher Waschschritt in PBS. Nach dem Trocknen der Deckgläschen folgte das Aufpipettieren der Zellsuspension. Die Zellen wurden innerhalb von fünf Minuten auf dem Deckgläschen adhärent Immunfluoreszenzfärbung Es folgte eine Spülung der Deckgläschen mit PBS. Die Zellen wurden mittels Triton X-100 (0,5%) in PBS für 20 Minuten bei Raumtemperatur permeabilisiert. Zur Reduktion des unspezifischen Hintergrundes erfolgte ein Blocken in BSA (1%), Donkey-Serum (10%) in PBS für zehn bis 20 Minuten. Die Zellen wurden mit dem Primärantikörper gegen alpha-tubulin (Verdünnung 1:20000) für zwei Stunden bei 37 C inkubiert und in PBS gew aschen. Es folgte die Inkubation mit dem Sekundärantikörper (Cy3, Verdünnung 1:200) für zwei Stunden bei 37 C. Waschen in PBS. Inkubation in 1µM Hoechst für fünf Minuten mit folgendem Waschschritt in PBS Mikroskopie der gefärbten Zellen Die Zellen wurden nach Auftropfen von Mounting Medium durch umgekehrtes Aufsetzen der Deckgläschen auf einen Objektträger in eine spezielle Matrix eingebettet. Es folgte die Fixation des Deckgläschens durch Nagellack. Die mikroskopische Auswertung wurde an einem Zeiss Axioplan 2 Fluoreszenzmikroskop vorgenommen.

49 Methoden Analyse der Schwesterchromatidtrennung von Metaphasechromosomen Präparation der Objektträger AML- und Burkittlymphom-Zelllinien wurden bei einer Dichte von 0,5 Mio/mL in Gegenwart von 200ng/mL oder 400ng/mL Nocodazol für 24 und 48 Stunden in Kultur genommen. Die Zellen wurden in PBS-Puffer gewaschen und in 37 C warmer 0,52%iger KCl-Lösung resuspendiert und für 10 Minuten bei 37 C inkubiert. Anschließend er folgte die Resuspension der Zellen und die tropfenweise Zugabe von eiskalter Fixativlösung mit nachfolgender einstündiger Inkubation bei 4 C. Die Zellen wurden erneut in Fixativlösung res uspendiert, auf einen eiskalten Objektträger aufgebracht und anschließend luftgetrocknet Färbung der Metaphasechromosomen (Giemsa-Färbung) Die mit den Zellen beschichteten Objektträger wurden in 0,9% NaCl-Lösung gewaschen und für 1,5 Minuten bei 37 C in 0,02% Trypsin / 0,9% NaCl- Lösung inkubiert. Die Objketträger wurden zweimal mit 0,9% NaCl-Lösung gewaschen. Die Objektträger wurden für fünf Minuten in Giemsa- Färbelösung inkubiert und im Anschluss zweimal mit Aqua dest gespült Auswertung der Metaphasechromosomen-Spreads Der Spindelcheckpoint verhindert in normalen Zellen eine Trennung der Schwesterchromatiden bei Schädigung der Mitosespindel. Die Überprüfung der Sisterchromatid-Cohesion stellt damit einen wichtigen Ansatz dar, um diesen Mechanismus zu überprüfen. Dabei wurden mikroskopisch pro Zelllinie 100 Metaphase-Spreads begutachtet und auf das Vorliegen von Einzelchromatiden überprüft. Hierbei wurde sowohl eine überdurchschnittliche Distanzierung der Chromatiden als auch deren singuläres Vorliegen als Normabweichung gewertet. Eine aberrante Metaphase wurde durch das Vorliegen eines der genannten Merkmale definiert. Die Erhebung der Prozentsätze an aberranten Metaphasen wurde in zwei unabhängigen Experimenten vorgenommen Durchflusszytometrische Zellzyklusanalyse Die Zellen wurden in Ethanol (75%) in PBS für mindestens zwei Stunden bei vier Grad Celsius fixiert. Die DNA wurde mit 5µg/mL Propidiumiodid, 0,1% Triton X-100 in PBS angefärbt. Um verbleibende RNA zu eliminieren, wurde RNase A (100µg/mL) zugesetzt. Die Zellen wurden für

50 Methoden 30 Minuten bei 37 C inkubiert. Die Zellzyklusverte ilung wurde an einem FACS Calibur analysiert. Die Zellzyklusquantifizierungen anhand der Zellzyklushistogramme erfolgten mit Modfit LT Bestimmung des Mitoseindex Der Mitoseindex bezeichnet definitionsgemäß jene Zellpopulation, die kondensierte Chromosomen aufweist. Die Bestimmung des Mitoseindex erfolgte sowohl immunfluoreszenzmikroskopisch als auch durchflusszytometrisch Immunfluoreszenzmikroskopische Bestimmung Bei der ersten Bestimmungsmethode wurde der Anteil der Zellen, die kondensierte Chromosomen aufwiesen, am Immunfluoreszenzmikroskop ausgezählt und zur Gesamtzellzahl in Relation gesetzt. Pro Ansatz wurden mindestens 200 Zellen ausgezählt. Abbildung 8: Mitosestadien. Während der Auftrennung der Chromosomen auf die beiden Tochterzellen kommt es zum stadienhaften Durchlaufen der Prophase, Metaphase, Anaphase und schließlich Telophase. In Gegenwart des Spindelgiftes Nocodazole kommt es zu einer Depolymerisation von Spindelmikrotubuli. Als Konsequenz lässt sich immunfluoreszenzmikroskopisch keine Mitosespindel nachweisen, so dass eine Auftrennung der Chromosomen Durchflusszytometrische Bestimmung Bei der zweiten Methode wurde durchflusszytometrisch der Anteil der mitotischen Zellfraktion quantifiziert. Diese zeichnet sich durch die Expression eines Proteins aus, das eine hohe Assoziation mit kondensierten Chromosomen aufweist. Bei dem Protein handelt es sich um Phospho-HistonH3 (phh3). Die Quantifizierung erfolgte durch Multiparameter- Immunfluoreszenzzytometrie. Die gleichzeitige Propidiumiodid-Färbung erlaubte anhand des replizierten DNA-Gehaltes die selektive Darstellung der Mitosefraktion.

51 Methoden Densitometrische Bestimmung Die Expression von phh3 wurde per Western Blot bestimmt und durch Densitometrie quantifiziert (siehe Abschnitt ). Die Expression dieses Proteins beschreibt, wieviele Zellen der untersuchten Zellpopulation sich in Mitose befinden. Die densitometrisch ermittelten Werte wurden anhand der Actin-Expression normalisiert. Die errechneten phh3-expressionswerte wurden auf das maximal gemessene Expressionsniveau bezogen und prozentual angegeben. 3.2 Proteinanalyse Zellzyklusabhängige Proteinquantifizierung am Durchflusszytometer Hintergrund Bei der Quantifizierung zellzyklusabhängig regulierter Proteine mittels Western Blot (siehe Abschnitt 3.2.2) ergibt sich das Problem, dass ein Vergleich zweier Zellpopulationen nur sinnvoll ist, wenn beide ein vergleichbares Zellzyklusverteilungsmuster aufweisen. Da diese Vorbedingung aufgrund der Diversität biologischer Systeme nur immer grob erreicht werden kann, ergeben sich zwangsläufig Schwierigkeiten bei der Interpretation von Proteinquantifizierungen. Um unsere Western Blot-Ergebnisse mittels einer anderen Methodik zu reproduzieren, wählten wir die durchflusszytometrische Messung der Immunfluoreszenzintensität. Hierbei misst man sowohl den DNA-Gehalt der Einzelzelle, der Aufschluss über das gegenwärtige Zellzyklusstadium gibt, als auch den Proteingehalt, der mit der Fluoreszenzintensität korreliert mittels sogenannter Multiparameter-Immunfluoreszenz (MPIF). Der DNA-Gehalt lässt sich durch Anfärbung mit Propidiumiodid (PI) feststellen. Der Proteingehalt wird mittels Bindung durch hochspezifische Antikörper, die sich durch einen fluoreszierenden Sekundärantikörper darstellen lassen, bestimmt. Probleme können sich durch die unspezifische Bindung des Antikörpers ergeben. Das Ausmaß dieses Fluoreszenzhintergrundes lässt sich durch eine sogenannte Isotypenkontrolle abschätzen. Dabei wird die Zelle mit einem Antikörper (MOPC-21) inkubiert, der innerhalb der humanen Zelle kein spezifisches Epitop findet. Der Kontrollantikörper muss hierbei in derselben Konzentration vorliegen, wie der entsprechende spezifische Antikörper. Indem man die Fluoreszenz dieses unspezifischen Antikörpers mit der des spezifischen vergleicht, gelingt es, eine spezifische Bindung von einem unspezifischen Hintergrund abzugrenzen.

52 Methoden Vorbereitung der Zellproben Pro Messung wurde eine Zellzahl von 2,5 x10 6 Zellen eingeplant, die bei -20 C über einen Zeitraum von mindestens zwölf Stunden fixiert wurden. Die Zellen wurden in der Fixierlösung in 30mL Waschpuffer resuspendiert und anschließend abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 5mL Permeabilisierungspuffer resuspendiert. Es folgte eine fünfminütige Inkubation bei vier Grad Celsius. Die Zellsuspension wurde mit 30mL Waschpuffer verdünnt und zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen Immunfluoreszenzfärbung der Zellen Das Zellpellet wurde in einem entsprechenden Volumen an Waschpuffer resuspendiert, so dass in 100µL Zellsuspension eine Zellzahl von 2,5 x 10 6 enthalten war. Das Zellsuspensionsvolumen wurde dann pro Messansatz auf einzelne FACS-Röhrchen verteilt und mit dem entsprechenden Primärantikörper inkubiert. Die Ansätze wurden vorsichtig geschüttelt, um eine möglichst gute Durchmischung zu erreichen und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgte die Verdünnung der Inkubationslösung mit 4mL Waschpuffer mit anschließender Zentrifugation. Der Überstande wurde verworfen und das Pellet in 4mL Waschpuffer resuspendiert. Es folgte eine Zentrifugation. Das Zellpellet wurde in 100µL Waschpuffer resuspendiert und die entsprechende Menge an Sekundärantikörper zugesetzt. Vorsichtiges Schütteln sorgte für eine gute Durchmischung. Der Ansatz wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter vollständiger Lichtabschirmung inkubiert. Der Inkubationsansatz wurde mit 4mL Waschpuffer verdünnt und anschließend zentrifugiert. Der zellfreie Überstand wurde komplett verworfen. Das Zellpellet wurde in 4mL Waschpuffer resuspendiert. Der Überstand wurde nach erneuter Zentrifugation verworfen und das Zellpellet in 5µg/mL Propidiumiodid, 0,1% Triton X-100 in PBS resuspendiert und für 20 Minuten bei 4 C inkubiert Probenanalyse Die Messung wurde an einem FACSCalibur vorgenommen. Die gewonnenen Daten wurden mit den Programmen CellQuest und FlowJo ausgewertet. Hierbei wurden die mittleren G2/Mspezifischen Fluoreszenzintensitäten der BubR1-Färbung und der Isotypenkontrolle bestimmt. Das Expressionsniveau von BubR1 ließ sich anhand der Ratio der mittleren BubR1- gegenüber Isotypen-Fluoreszenzintensität in G2/M errechnen.

53 Methoden Isotypenkontrolle BubR1 Ausschluss von Dubletten und Definition der vitalen Zellfraktion Histogram Blot der Zellzyklusverteilung Dot Blot: Zellzyklusabhängige BubR1- Fluoreszenzintensität G2/M-spezifische BubR1- Fluoreszenzintensität (grün) gegenüber Isotypenkontrolle (rot) Berechnung der Proteinkonzentration Die Messung der Proteinkonzentration erfolgte photometrisch in 1:800- und 1:1600facher- Verdünnung in Bradford-Lösung. Extinktionswerte zwischen 0,1 und 1,0 wurden anhand einer Eichkurve zur Errechnung der Proteinkonzentration herangezogen. Abbildung 9: Mit Hilfe der MPIF lässt sich in einer spezifischen Zellpopulation die Expression eines bestimmten Proteins bestimmen. Die korrekte Auswahl der entsprechenden Zellpopulation ist hierbei von grundlegender Bedeutung: Anhand der PI-Fluoreszenz erfolgte zunächst die Definition der vitalen Zellpopulation unter Ausschluss von Zelldupletten. Innerhalb dieser vitalen Population ließen sich die Zellen nun hinsichtlich der PI-Fluoreszenz einem spezifischen Zellzyklusstadium zuordnen. Ferner erlaubte das Ausmaß der Fluoreszeinfluoreszenz eine Abschätzung der BubR1-Expression in den einzelnen Zellen. Diese ließ sich gegenüber dem unspezifischen Fluoreszenzhintergund (Isotypenkontrolle) in einem Histogramm graphisch darstellen Western Blot Proteingewinnung Die Zellen wurden mit Nährmedium in einer Pipette aufgenommen und nachfolgend in einem Falcon-Röhrchen zentrifugiert. Das sedimentierte Zellpellet wurde nach Verwerfen des Überstandes in 30-50µl Lysepuffer resuspendiert und in einem 1,5ml Reagenzgefäß (Eppendorf) mit Hilfe eines Pelletshakers aufgeschlossen. Es folgte eine fünfminütige Inkubation auf Eis und eine Zentrifugation der Lösung bei x G bei 4 C.

54 Methoden Proteinprobenaufbereitung Entsprechend der Proteinkonzentration wurde eine Proteinmenge von 50µg auf einem Polyacrylamidgel mit 10 Beladetaschen augetrennt. Auf einem Gel, bestehend aus 15 Beladetaschen, wurde eine Proteinmenge von 15µg aufgetrennt. Das Ladegemisch setzte sich aus Ladepuffer, der Proteinlösung und Aqua dest zusammen. Für eine Proteinmenge von 50µg wurde ein Ladevolumen von 10µl vorgesehen. Vor der Elektrophorese erfolgte die Denaturierung der Sekundär- und Tertiärstruktur durch Erhitzen auf 100 C für sieben bis zehn Minuten Proteinelektrophorese Die Proteinauftrennung wurde mittels Elektrophorese auf einem 10%igen Polyacrylamidgel vorgenommen. In einem vorgeschalteten Sammelgel (ph 6,8), kam es zu einer Konzentration der Proteinbanden. In einem nachgeschalteten Separationsgel (ph 8,8), erfolgte die Auftrennung des Proteingemischs entsprechend der Molekülgröße bei einer Elektrophoresespannung von 120V über eine Dauer von etwa zwei Stunden Proteinblotting Für den Blottingvorgang wurden Nitrozellulosemembranen für 30 Sekunden in Methanol inkubiert und nachfolgend für zwei Minuten gewässert. Die Membranen wurden bis zum Gebrauch in Blottingpuffer inkubiert. Nach Abschluss der Gelelektrophorese wurden die Proteingele mit den im Sandwichverfahren aufgeschichteten Nitrozellulosemembranen in die Blottingkammer überführt. Der Proteintransfer erfolgte bei einer Stromstärke vom 350mA bei einer Dauer von zwei Stunden. Zur Kontrolle des erfolgreichen Proteinstransfers konnte eine Visualisierung der Proteinbanden auf der Membran mittels PonceauS-Lösung vorgenommen werden. Die Membranen wurden für mindestens zwei Stunden in Blockingpuffer inkubiert, um unspezifische Antikörperbindungen zu reduzieren Immundetektion der Zielproteine Die Inkubation der Membranen mit dem Primärantikörper gegen das entsprechend gewünschte Protein erfolgte in Blockingpuffer über einen Zeitraum von zwei Stunden. Nach mehreren Waschgängen konnte der Primärantikörper mit dem peroxidasegekoppelten Sekundärantikörper detektiert werden. Der Proteingehalt konnte anhand der Peroxidaseaktivität des Sekundärantikörpers mittels Chemilumineszenz in speziellen ECL-Lösungen sichtbar gemacht

55 Methoden werden. Die ECL-Filme wurden entsprechend der Chemilumineszenzintensität unterschiedlich lange entwickelt Quantifizierung der Western Blot-Banden mittels Scanner Um objektive Daten zur Proteinexpression zu erhalten, sollte die Schwärzung des ECL-Films im Bereich der Proteinbanden quantifiziert werden. Die ECL-Filme wurden eingescannt und die Proteinbanden mit Scan Wizard 5 densitometrisch quantifiziert. Für die relative Expression eines spezifischen Proteins konnte der densitometrisch erhobene Wert auf den jeweils zugehörigen Actin-Wert bezogen werden. Dies ließ sich durch Bildung des Quotienten aus spezifischem Protein und Actin erreichen. 3.3 Nukleinsäureanalyse RNA-Isolation Abtrennung der RNA-haltigen Fraktion Das Zellpellet von mindestens 50x10 6 Zellen wurde in 250µL Aqua dest resuspendiert. Es wurden 750µL Trizol-Lösung zugegeben und der Ansatz bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 200µL Chloroform wurde die Lösung kräftig geschüttelt, um eine komplette Durchmischung zu erreichen. Nach erneuter Inkubation wurde die wässrige RNA-haltige Phase durch Zentrifugation in einem Phasentrennungshütchen (Phase-log Gel) separiert. Bei einer Beschleunigung von 14000G kam es zur Phasentrennung an einer lipophilen Gelschicht, so dass nach fünfminütiger Zentrifugation nur noch die wässrige, RNA-haltige Phase über der lipophilen Trennschicht stand, während es unter Einwirkung der Beschleunigungskraft zum Durchtritt der lipophilen Phase unter die Trennschicht kam Aufreinigung der RNA durch Fällung Zum Fällen der RNA wurde die wässrige Phase mit 500µL Isopropanol gemischt und nach zehnminütiger Zentrifugation für zehn Minuten inkubiert. Der Überstand wurde abgenommen und in 1mL hundertprozentigem Ethanol resuspendiert. Die Proben wurden auf dem Vortexer gemischt und für fünf Minuten inkubiert. Der Überstandes wurde abgenommen und die gefällte RNA an der Luft getrocknet.

56 Methoden Aufreinigung der RNA durch Elutionssäulen Zur weiteren Aufreinigung in einer Elutionssäule (RNeasy Mini Kit, Qiagen Inc.) wurde die getrocknete RNA in 100µL RNasefreiem Aqua dest, 350µL Spezialpuffer (RLT) mit 10µL beta- Mercaptoethanol und 100µL absolutem Ethanol resuspendiert. Dieses Gemisch wurde zweimal auf eine Säule gegeben und bei einer Beschleunigung vom 8000G zentrifugiert, um eine möglichst große Adsorbtion der gelösten RNA zu erreichen. Die Säule wurde zweimal mit einem weiteren Spezialpuffer (RPE) gespült, um den Gehalt an unspezifischer Adsorbtion zu minimieren. Schließlich Elution der adsorbierten RNA in 30µL RNase-freiem Aqua dest Entfernung verbliebener DNA-Kontamination Eventuell verbliebene DNA-Bestandteile wurden durch Zugabe einer DNase und eines speziellen Puffers (DNaseI-Puffer) während einer Inkubation bei 37 C für 25 Minuten verdaut. Nach zweiminütiger Inaktivierung der DNase durch Inactivation Reagent folgte ein Zentrifugationsschritt für 2 Minuten bei 4 C. Der klare RNA-haltige Übers tandes wurde abgenommen Quantifizierung des RNA-Gehalts Der RNA-Gehalt wurde durch photometrische Messung bei 50facher Verdünnung in Aqua dest bestimmt. OD-Werte zwischen 0,1 und 1 bei einer Wellenlänge von 260nm führten zu zuverlässigen Ergebnissen. Die Berechnung des RNA-Gehalts erfolgte entsprechend folgender Formel: ssrna [µg/ml] = A 260 x 40µg/ml x Verdünnungsfaktor Reverse Transkription Die Umschreibung der gewonnenen RNA in cdna erfolgte mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase. Hierbei wurden zunächst zwei Ausgangslösungen hergestellt: Erstens die sogenannte Ausgangslösung, die neben dem Nukleotidgemisch* und den Oligo-dT-Primern* 5µg RNA enthielt. Zweitens die Reaktionslösung, die sich aus einer speziellen Pufferlösung*, MgCl 2 *, DTT* und einem RNase-Inhibitor* zusammensetzte. Die mit (*) gekennzeichneten Agenzien waren im RT-Kit des Herstellers Qiagen Inc. enthalten. Die Ansätze wurden in tiefgekühlten Metalllochplatten pipettiert, um etwaige Enzymaktivitäten zu reduzieren. Die nachfolgenden Schritte wurden in der PCR-Maschine ausgeführt: Fünfminütiges Erhitzen der Ausgangslösung bei 65 C. Zugabe der Reaktionslösun g und kurzes Abzentrifugieren. Zweiminütige Inkubation bei 42 C mit nachfolgender Zugabe von 1µL reverser Transkriptase (SS

57 Methoden II RT). Fünfzigminütige Inkubation bei 42 C mit an schließendem Temperatursprung auf 70 C für 15 Minuten und nachfolgender Lagerung auf Eis. Nach kurzer Zentrifugation Zugabe von 1µL RNase H, um die verbliebenen RNA-Einzelstränge während einer zwanzigminütigen Inkubation bei 37 C zu hydrolysieren. Die so gewonnene cdna konnte nun durch PCR amplifiziert werden Quantitative PCR Prinzip Ausgehend von der cdna erfolgte die vergleichende Quantifizierung des Genproduktes durch Amplifikation, wobei das Referenzgen GAPDH als Standard verwendet wurde Durchführung Es wurden sowohl ein Ausgangsmix, der sich aus den beiden Primerpaaren (Primerkonzentration jeweils 0,3µM), dem Nukleotidmix, der eingesetzten cdna-menge und Aqua dest zusammensetzte, und ein Reaktionsmix, bestehend aus 10x PCR-Puffer (5µL), Aqua dest und Taq-DNA-Polymerase (1µL), getrennt pipettiert. Je 25µL der jeweiligen Ansätze wurden zusammengegeben und bildeten das Endvolumen des PCR-Ansatzes von 50µL. In der Regel wurde für alle beschriebenen PCR-Reaktionen ein Volumen von 1µL cdna-lösung eingesetzt. Die Anzahl der nötigen PCR-Zyklen variierte entsprechend des zu amplifizierenden Genproduktes (siehe Abschnitt ). Für Cdh1 war eine Zyklenzahl von 35 notwendig, um gut beurteilbare Banden zu erhalten. Der Reaktionsansatz wurde deshalb doppelt pipettiert, um in einem der beiden Ansätze nach 25 Zyklen den Standard beurteilen zu können, da GAPDH nach 35 Zyklen nicht mehr quantitativ beurteilbar war. Nach Abschluss der PCR-Reaktion wurden die Reaktionsprodukte durch Agarosegelelektrophorese entsprechend der Sequenzlänge aufgetrennt PCR-Programme Initiale Denaturierung Zyklen (GAPDH: 25fach, Cdh1: 35fach) Finale Elongation 94 C für 5min 94 C für 1min, 57 C für 1min, 72 C für 1min 72 C für 10min

58 Methoden DNA-Elektrophorese Zur Herstellung des 1,5%igen Agarosegels wurden 1,5g Agarose in 100mL TAE-Puffer aufgekocht. Während des Abkühlens wurden 50µg Ethidiumbomid zugegeben. Die Nukleinsäurelösungen wurden in einem Zehntel des Endvolumens an Agarosegelladepuffer (10x) resuspendiert. 10µL des Nukleinsäuregemischs wurden auf das Agarosegel aufgetragen. Die Auftrennung nach der Größe erfolgte bei einer Spannung von 130V. Die Bandenmuster ließen sich in der UV-Kammer aufgrund der Ethidiumbromideinlagerung in die Doppelhelixstruktur der DNA-Stränge darstellen Sequenzierung von DNA Prinzip der Kettenabbruchmethode Nach dem Verfahren von Sanger kommt es ähnlich der PCR nach Hybridisierung mit der zu sequenzierenden DNA zur Polymerase-abhängigen Verlängerung des zugegebenen Einzelprimers. Ferner unterscheidet sich dieser Ansatz von einer PCR durch das zugegebene Gemisch an Nukleotiden. Neben den üblichen 4 verschiedenen 2 -Desoxynukleotiden sind zu einem gewissen Prozentsatz markierte 2,3 -Didesoxynukleotide zugesetzt. Der Einbau entweder von Desoxy- oder Didesoxynukleotiden erfolgt nach den Gesetzen der Statistik. Der Einbau von Didesoxynukleotiden führt aufgrund des Fehlens der entsprechenden Hydroxylgruppe dazu, dass keine weitere Base mehr angefügt werden kann und die Verlängerungsreaktion damit an verschiedenen Stellen zum Erliegen kommt. Die Kettenabbruchreaktion liefert daher verschieden lange Sequenzen, an deren Ende sich ein markiertes Didesoxynukleotid befindet. Die gelelektrophoretische Korrelation der entsprechenden Didesoxynukleotidmarkierung mit der Sequenzlänge lässt auf die Basenabfolge des untersuchten DNA-Abschnitts schließen Durchführung Es wurde eine RT-PCR durchgeführt, um die gewünschte cdna zu erhalten. Dabei wurde zunächst mittels reverser Transkription RNA in cdna umgeschrieben (siehe Abschnitt 3.3.2). Diese konnte mittels PCR (siehe Abschnitt 3.3.3) amplifiziert werden. Die cdna wurde zur Qualitätsüberprüfung auf ein Agarosegel aufgetragen. Entsprechend der Fluoreszenzintensität der DNA-Banden musste das vorliegende PCR-Produkt nochmals amplifiziert werden. Die PCR

59 Methoden wurde bei einer Primerkonzentration von 0,3µM unter Zusatz von 10% Glycerin (nur bei den Cdc20-Primern) durchgeführt PCR-Amplifikation der entsprechenden Sequenz Für die Amplifikation der Cdc20-Sequenz wurden folgende PCR-Bedingungen gewählt: Initiale Denaturierung Zyklen (entsprechend der eingesetzten cdna- Menge wurden Zyklen benötigt) Finale Elongation 94 C für 5min 94 C für 45sec, 58 C für 30sec, 72 C für 1min 72 C für 10min Kettenabbruchreaktion Die Aufreinigung der PCR-Produkte erfolgte mittels PCR Purification Kit. Die Kettenabbruchreaktion wurde in der folgenden Weise pipettiert: Die Konzentration der entsprechenden Sense-Primer betrug 0,5µM. Die Menge des eingesetzten ET-Reaktions-Mix betrug 4µl. Glycerin nahm 10% des Endvolumens ein. Es wurde eine cdna- Menge von zehn bis maximal 40ng eingesetzt und mit Aqua dest auf ein Endvolumen von zehn-, bei höherem cdna-einsatz, auf 20µl gebracht. Thermocyclerprogramm zur Durchführung der Kettenabbruchreaktion: Zyklen (35fach) 95 C für 20sec, 50 C für 15sec, 60 C für 60sec Sequenzanalyse Nach Abschluss der Reaktion wurden die Proben auf Eis gelagert und an die Core Facility der Universitätsklinik Freiburg zur Kapillarelektrophorese und Sequenzbestimmung übergeben. Die Sequenzanalyse erfolgte durch das Programm Chromas. Hierzu wurde sowohl Vergleich von Kasumi-1 zu DG-75 als auch Vergleich zur Referenzsequenz des NCBI angestellt.

60 Methoden RNA-Interferenz (RNAi) Einführung Diese Methode beruht auf einem konservierten biologischen Mechanismus und stellt für die Zelle eine Möglichkeit dar, sowohl endogenen Parasiten also auch fremden schädlichen Nukleinsäuren unschädlich zu machen (Hannon, 2002). Small-interfering RNAs (sirna), kurze doppelsträngige RNA-Moleküle, machen sich diesen Mechanismus zunutze. Sie sind in der Lage, bestimmte Gene in ihrer Expression hochspezifisch zu supprimieren und finden deshalb in der Zellforschung immer breitere Anwendung. Diese Moleküle weisen jedoch zwei wesentliche Limitierungen auf: Zum einen konnten sie nur einen transienten Effekt nach ihrem Transfer in die Zielzelle bewirken, zum anderen stellten die Synthese und der aufwendige Umgang mit RNA-Molekülen hohe Anforderungen an den Anwender. Diesbezüglich stellt die Möglichkeit der konstitutiven Expression interferierender RNA-Sequenzen von Plasmiden einen beträchtlichen Fortschritt dar (Brummelkamp et al., 2003). Dadurch wird es möglich, einen stabilen Repressionseffekt auf einzelne Gene zu erzielen. Durch Klonierung der Interferenzsequenz hinter den humanen H1- Promotor kommt es zu einer RNA-Polymerase III-abhängigen Transkription des RNA- Konstruktes. Die RNA-Polymerase III ist im Gegensatz zu der mrna-synthetisierenden RNA- Polymerase II für die Synthese von kürzeren RNA-Molekülen verantwortlich. Das Konstrukt beinhaltet die sirna, eine spezifische Loop-Sequenz, das komplementäre Gegenstück der sirna, einen Transkriptionsstop und auf beiden Seiten die jeweiligen Schnittstellen.Es kommt somit innerhalb der RNA-Sequenz unter Ausbildung einer Haarnadelstrukur zu einer komplementären Rückfaltung mit Ausbildung einer Doppelstrang-RNA-Sequenz. Der sogenannte Dicer-Komplex führt unter Entfernung der Loop-Sequenz der Haarnadelstruktur zur Ausbildung von Doppelstrang-RNA-Sequenzen (Tuschl, 2002). Dieser Prozessierungsschritt liefert die eigentlichen sirna-moleküle, die für die spezifische Proteinsuppression verantwortlich sind. Ihre Wirkung entfalten die sirna-moleküle in Verbindung mit einem speziellen Effektor-Nuklease- Komplex, dem RISC (RNA-induced silencing complex). Von funktioneller Bedeutung sind die Zwei-Nukleotid-Überhänge am 3 -Ende und die Phosphat-Gruppe am 5 -Ende der sirna, welche für die Verbindung mit dem RISC eine zentrale Rolle spielen. Der kritische Schritt in der Aktivierung des RISC stellt die Entwindung der doppelsträngigen sirna dar, da speziell die einzelsträngige sirna die hochspezifischen Suppressioneffekte steuert. Der aktive RISC ist somit in der Lage in Abhängigkeit von der inkorporierten sirna seine Ziel-mRNA zu binden und zu zerstören (Hannon, 2002).

61 Methoden Assoziation der shrnamit dem Dicerführt zur Entstehung von Doppelstrang-RNA Lentiviralvermittelter Transfer der Silencingsequenzen in die Zielzelle Integration der Silencingsequenzins Genom + dsrna/sirna RNA-Synthese mit Ausbildung einer Haarnadelstruktur (shrna) Entwindungder dsrna/sirna am RISC Assoziation von aktiviertem RISC und der Ziel-mRNA Gezielte Zerstörung der Ziel-mRNAnach Anlagerung an den RISC Abbildung 10: Lentiviral vermittelte RNA-Interferenz in humanen Zellen. Die humanen Zielzellen werden durch die plasmidtragenden Lentiviren mit hoher Effizienz infiziert und integrieren die entsprechende Sequenz stabil in ihr Genom. Von hier aus kommt es sowohl zur Expression der Silencingsequenz als auch der spezifischen Resistenzgene für die folgende Selektion. Die entstehenden Silencingsequenzen bilden aufgrund von komplementären Sequenzabschnitten Haarnadelstrukturen (shrna) aus. Die so entstandene doppelsträngige RNA (dsrna) wird durch den sogenannten Dicer-Enzymkomplex zu kurzen dsrna-molekülen weiterprozessiert, welche nun keine Haarnadelschleife mehr aufweisen. Diese Moleküle sind identisch mit short-interfering RNA-Molekülen (sirna). SiRNA-Moleküle können in Verbindung mit dem RNA-induced silencing complex (RISC) aufgrund spezifischer Sequenzkomplementaritäten bestimmte mrna-moleküle binden, zerstören und dadurch die Translation einzelner Proteine hochselektiv reduzieren Phosphorylierung und Annealing der RNAi-Oligonukleotidsequenzen Über im World Wide Web frei zugängliche Algorithmen (den Stealth-Algorithmus der Firma Invitrogen und die sirna-designfunktion der Firma Dharmacon) wurden sirna-sequenzen

62 Methoden konstruiert, welche die Voraussetzungen für einen erfolgreichen Knockdown-Effekt besaßen. Hierbei mussten besonders etwaige Interferenzen mit der Loop-Sequenz beachtet werden. Zum anderen musste durch entsprechende Sequenzwahl eine möglichst effektive Transkription durch die RNA-Polymerase III sichergestellt werden. Deshalb wurden bevorzugt Oligonukleotide verwendet, welche sich durch ein Guanosin an erster Stelle, das Fehlen von vier bis fünffachen Wiederholungen von Thymidin und Adenosin und das Fehlen von zwei- bis dreifachen Thymidinnukleotidwiederholungen am Ende der Sequenz auszeichneten. Zusätzlich wurden die Sequenzen auf das Nichtvorhandensein von Restriktionsschnittstellen überprüft, die im Verlaufe der Klonierung beziehungsweise für Kontrollverdaus verwendet wurden (BamHI, BglII, BsrGI, NotI, SalI, XbaI und XhoI). Diese Einzelstrang-Oligonukleotide wurden zunächst an den Enden phosphoryliert. Hierzu wurden 400pmol Oligonukleotide in 1/25 des Endvolumens an Polynukleotid-Kinase und 1/10 des Endvolumens an Ligase-Puffer über einen Zeitraum von 60 Minuten bei 37 C inkubiert. Die phosphorylierten E inzelstrangsequenzen wurden durch Zugabe von 1/10 des Ausgangsvolumens an Natruimacetat und dem dreifachen des Ausgangsvolumens an absolutem Ethanol über einen Zeitraum von 30 Minuten einer Temperatur von 80 C ausgesetzt. Der Ansatz wurde anschließend in einer Tischzentrifuge bei x G zehn Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das DNA-Präzipitat in 70%igem Ethanol resuspendiert. Die Suspension wurde für 10 Minuten bei x G zentrifugiert, der Überstand abgenommen und die verbleibende Flüssigkeit durch fünf- bis zehnminütige Inkubation im Heizblock bei 50 C verdampft. Um aus den beiden Einzelstrangnukleotiden eine Doppelstrangsequenz herzustellen, wurde ein Annealingprozess vorgenommen, bei dem es entsprechend der Basenfolge zu einer komplementären Aneinanderlagerung der beiden Einzelstränge kam. Die Präzipitate der oben liegenden Sequenz und der unten liegenden Sequenz wurden in jeweils 20µl Annealing-Puffer aufgenommen und zusammenpipettiert. Das Gemisch wurde auf 95 C erhitzt und nahm nach Ausschalten des Heizblocks in einem langsamen Abkühlungsprozess wieder Raumtemperatur an. Hierdurch konnte die zuverlässige Zusammenlagerung der beiden Einzelstränge erreicht werden. Durch entsprechende Einzelstrangüberhänge an den Enden der annealten Oligonukleotide entstanden eine BamHI- und eine HindIII-Schnittstelle, die nun in das entsprechende psuper- Vektorkonstrukt ligiert werden konnten.

63 Methoden Amp BamHI psuper 3175 bp H1 BglII (929) HindIII (937) HindIII Abbildung 11: Ligation der annealten 64mer-Oligonukleotide in psuper unter Verwendung der BglII- und HindIII-Schnittstelle. Amp psuper 3234 bp NotI (671) XbaI (678) SpeI (684) BamHI (690) SmaI (698) EcoRI (708) H1 BglII (929) shrna-oligonukleotid HindIII (996) ClaI (1003) SalI (1011) XhoI (1017) Ligation der RNAi-Doppelstrangsequenz in psuper Zur Vorbereitung des Vektorgrundgerüsts wurden 15µg psuper-vektor-dna mit der Restriktionsendonuklease HindIII verdaut. Der geschnittene Vektor wurde anschließend mittels Ethanolfällung unter Zugabe von Natriumacetat aufgereinigt und erneut durch das Restriktionsenzym BglII geschnitten. Im Anschluss an die Ethanolfällung wurden die Phosphatgruppen an den Doppelstrangenden durch einen Inkubationsschritt mit alkalischer Phosphatase (CIAP; calf intestinal alkaline phosphatase) beseitigt, um eine Religation der beiden entstandenen Enden zu vermeiden. Hierzu wurde der DNA-Resuspension 1/25 des Endvolumens an CIAP und 1/10 des Endvolumens an CIAP-Puffer zugegeben. Der genannte Ansatz wurde eine Stunde bei 37 C inkubiert. Das geschnittene und dephosphorylierte Vektorgrundgerüst wurde auf ein 1%iges Agarosegel geladen und die gewünschte Bande entsprechend der errechneten Größe aus dem Gel ausgeschnitten. Zur Aufreinigung der Bande wurde das MinElute Gel Extraction Kit von Qiagen verwendet. Das nun aufgereinigte Vektorgrundgerüst und die RNAi-Doppelstrangsequenz wurden in einem auf 16 C eingestellten Wasserbad über Nacht ligier t. Hierbei wurde die RNAi- Doppelstrangsequenz im dreifachen Überschuss gegenüber dem Vektorgrundgerüst eingesetzt.

64 Methoden Der DNA wurden 1/10 des Endvolumens an T4-Ligase-Puffer und ein 1/15 an T4-Ligase zugegeben. Im Anschluss an die Ligation erfolgte eine Ethanolfällung unter Zugabe von Lithiumchlorid, um die ligierte DNA von Salzverunreinigungen zu befreien. Hierbei wurden der Ligationslösung (15µl) 100µl absolutes Ethanol und 2µl 4M Lithiumchlorid zugegeben. Es folgte eine 30minütige Inkubation bei 80 C. Die Lösung w urde für zehn Minuten bei x G in einer Tischzentrifuge zentrifugiert und das Präzipitat nach Verwerfen des Überstandes in 100µl 70%igem Ethanol resuspendiert. Die Lösung wurde wiederum für 10 Minuten bei x G zentrifugiert. Das Vektorpräzipitat wurde nach Verwerfen des Überstandes bei 50 C in einem Heizblock getrocknet und schließlich in 12µl DNase freien Aqua dest in Lösung gebracht Transformation elektrokompetenter Escherichia coli (E. coli) Ein Ansatz elektrisch kompetenter, bei 80 C gelag erter E. coli wurde auf Eis aufgetaut. Nach dem Auftauen wurden 4µl Vektor-DNA-Lösung auf die Bakteriensuspension pipettiert und durch leichtes Abschnippen des 1,5mL-Reaktionsgefäßes (Eppendorff) eine Durchmischung der Bakterien und der DNA erreicht. Direkt vor der Elektrotransformation wurde SOC-Medium bereitgestellt, um die Bakterien nach dem Elektroschock in Suspension zu nehmen. Das Bakterien-Vektor-DNA-Gemisch wurde in eine spezielle Elektrotransformationskammer überführt und bei 2,5kV elektroporiert. Nach Aufnahme der elektroporierten Bakterien in SOC-Medium wurden diese in einem 15ml-Reaktionsgefäß für eine Stunde bei 37 C geschüttelt um ein erfolgreiches Anwachsen zu gewährleisten. Nach Ablauf der Stunde wurden verschiedene Volumina der Bakterienlösung auf einer ampicillinhaltigen Agarplatte ausgestrichen und über Nacht im Brutschrank bei 37 C inkubiert Transformation chemisch kompetenter E. coli Die bei 80 C gelagerten Bakterienklone wurden auf Eis aufgetaut. Die entsprechende Menge Vektor-DNA wurde hinzugegeben und die Lösung durch leichtes Schütteln vermischt. Dieser Ansatz wurde für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Bakterien wurden für 90 Sekunden in ein auf 42 C vorgeheiztes Wasserbad gegeben und danach für eine Minute auf Eis gelagert. Im Anschluss konnten die Bakterien auf den bereitgehaltenen vorgewärmten Agarplatten ausgestrichen werden und wurden über Nacht bei 37 C inkubiert.

65 Methoden Selektion und Anzüchten der Bakterienklone Nach 16-20stündiger Inkubation der Bakteriensuspension auf ampicillinhaltigen Agarplatten waren nach erfolgreicher Transformation eines funktionellen Vektors multiple Einzelkolonien nachweisbar. Diese Einzelkolonien wurden mittels einer 50µl Pipettenspitze in 4ml ampicillinhaltiges LB-Medium überführt. Die Inkubation dieser angeimpften Klone erfolgte unter ständiger Rotation, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung der Bakterien sicherzustellen. Nach stündiger Inkubation bei 37 C konnte ei ne deutliche Trübung infolge des Bakterenwachstums beobachtet werden Isolation der Plasmid-DNA Die Plasmid-DNA wurde mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen aus den expandierten Bakterien isoliert. Die so gewonnene Plasmid-DNA wurde einem Kontrollverdau unterzogen, um sicherzustellen, dass es sich um das gewünschte Plasmid handelt. Hierbei wurde das Plasmid in einem Doppelverdau mit den beiden Restriktionsenzymen BamHI und SalI prozessiert. Ein mitprozessiertes Positiv- und Negativkontrollplasmid sollte eine Aussage darüber erlauben, ob die RNAi-Sequenz in den psuper-vektor integriert wurde. Zusätzlich wurde ein BglII- Kontrollverdau durchgeführt. Im Falle einer Integration des RNAi-Fragments in psuper kommt es zu einer Zerstörung der BglII-Schnittstelle in psuper. Somit kommt es nach BglII-Verddau durch den Verlust der BglII-Schnittstelle zum Auftreten unverdauter Plasmid-DNA Anlegen von Glycerolstöcken Klone, die das gewünschte Plasmid enthielten, konnten durch Hinzumischen von 30% Glycerin (85%) bei 80 C über längere Zeit gelagert werden. Ablösen kleinster Bestandteile des Glycerolstocks erlaubt eine rasche Inkulturnahme der entsprechenden Bakterien Ausschneiden der RNAi-Sequenz und des zugehörigen H1-Promotors Aus psuper-rnai wurde das Knockdown-vermittelnde Sequenzmotiv, das sich aus dem H1- Promotor und der nachfolgenden shrna(short-hairpin-rna)-kodierenden Sequenz zusammensetzte, mit einem XbaI/SalI-Doppelverdau ausgeschnitten. Dieser Sequenzabschnitt wurde durch Gelelektrophorese mit anschließendem Bandprep der gewünschten Sequenz isoliert.

66 Methoden Ligation der RNAi-Sequenz und des H1-Promotors in pll3.7 Amp psuperh1-shrna 3234 bp XbaI (678) H1 shrna-oligonukleotid shrna-oligonu SalI (1011) Abbildung 12: Umklonieren des shrna-konstruktes mit dem vorgeschalteten H1-Promotor in GFP-tragenden Zielvektor plentilox3.7 (pll3.7) unter Verwendung der angegebenen Schnittstellen. AmpR CMV promoter/enhancer 5' LTR puc 3' SIN-LTR plentilox bp Psi FLAP XbaI (2617) WRE U6 promoter LoxP XhoI (2951) GFP LoxP CMV promoter Um ein pll-basiertes Vektorgrundgerüst zu generieren, in welches die shrna-tragende Sequenz hineinligiert werden konnte, wurde ein XbaI/XhoI-Doppelverdau von pll3.7 vorgenommen (siehe Abbildung 12). Nachfolgend wurde eine CIAP-Dephosphorylierung vorgenommen und die Sequenz anschließend durch eine Ethanolfällung unter Zugabe von Natriumacetat aufgereinigt. Das gewünschte Vektorgrundgerüst konnte durch einen Bandprep isoliert werden. AmpR CMV promoter/enhancer 5' LTR puc 3' SIN-LTR WRE LoxP GFP pll-shrna 7646 bp Psi FLAP H1-Promotor shrna-oligonukleotid LoxP CMV promoter Abbildung 13: pll-shrna erlaubte anhand der GFP- Expression Rückschlüsse auf die Transduktionseffizienz und bei entsprechend hoher Transduktion eine vorläufige Beurteilung des Silencing- Effektes der unterschiedlichen Interferenz-Sequenzen.

67 Methoden Kontrollverdau von pll-shrna Um zu klären, bei welchem Plasmid es sich um das gewünschte handelt, wurde je ein Einfachverdau mit XhoI und ein Doppelverdau mit XbaI/XhoI durchgeführt. Im Falle einer erfolgreichen Ligation des H1-RNAi-Fragments wurde unprozessierte DNA im XhoI-Verdau in Form von sogenannten DNA-Supercoils beobachtet. Im XbaI/XhoI-Doppelverdau zeigte sich eine Linearisierung der gewünschten Plasmide Ersetzen des GFP-Gens durch das Puromycin- und Blasticidin- Resistenzgen in pll Das Puromycin-Resistenzgen wurde mit einem NotI/Acc65I-Doppelverdau aus pbabe-puro, das Blasticidin-Resistenzgen aus plenti6/ubc/v5-gw ausgeschnitten. Die geschnittene DNA wurde auf ein Agarosegel geladen und aufgetrennt. Die Puromycin-/Blasticidinbande wurde ausgeschnitten und aufgereinigt. Aus dem GFP-exprimierenden pll-vektor, der den gewünschten Knockdown-Effekt erbrachte, wurde das GFP-Gen mit einem NotI/BsrGI- Doppelverdau herausgeschnitten. Die geschnittene Vektor-DNA wurde anschließend gefällt. Das Vektorgrundgerüst wurde durch CIAP dephosphoryliert und das Vektorgrundgerüst durch einen Bandprep isoliert. Das aufgereinigte Puromycin- bzw. Blasticidinfragment und das gewünschte Vektorgrundgerüst konnten nun ligiert werden. Die Auswahl der entsprechenden Klone erfolgte anhand eines EcoRI-Kontrollverdaus Transfektion der virusproduzierenden Zellen Für die Transduktion von DG-75- und HeLa-Zellen ist ein vorgeschalteter Syntheseschritt für die Viruspartikel in 293T-Zellen notwendig. Hierzu wurden die 293T-Zellen (1,8x10 6 ) Stunden vor der Transfektion auf einer 60mm Kulturplatte in 4ml DMEM-Medium ausplattiert. Ziel war es, zum Zeitpunkt der Transfektion eine 80-90%ige Konfluenz zu erreichen. Vor der Tranfektion wurde ein steriler Transfektionscocktail hergestellt. Dieser bestand aus 8µg Vektor-DNA, jeweils 4µg der Verpackungsvektoren (pmdlg/prre, prsv-rev und pmd2g [VSV]), 50µl 2,5M CaCl 2 und wurde mit Aqua dest auf ein Endvolumen von 500µl gebracht. Unter konstantem Einblasen von Luft unter Zuhilfenahme der elektrischen Pipettierunghilfe wurden tröpfchenweise 500µl HBS in zweifacher Konzentration zugegeben. Das Nährmedium auf den 293T-Zellen wurde durch vorgewärmtes Nährmedium mit 25µM Chloroquin ersetzt. Danach konnte der

68 Methoden Transfektionscocktail tröpchenweise dem chloroquinhaltigen Nährmedium auf den 293T-Zellen zugegeben werden. Die Zellen wurden anschließend für zehn Stunden bei 37 C im Inkubator gehalten. Das chloroquinhaltige Medium wurde durch Normalmedium (DMEM) ersetzt. Nach 24 Stunden wurde das nun virusenthaltende Nährmedium über den 293T-Zellen abgenommen und durch frisches Nährmedium ersetzt. Das virusenthaltende Medium konnte für die Transduktion der Zielzellen verwendet werden Transduktion von HeLa-Zellen Die zu transduzierenden HeLa-Zellen wurden Stunden vor Transduktionsbeginn auf einer 6-well-Platte ausgesät. Pro well wurden dabei 2x10 5 Zellen in 6ml Nährmedium ausplattiert. Vor der Transduktion wurde das Nährmedium komplett abgenommen. Das virushaltige Nährmedium auf den 293T-Zellen, insgesamt 4ml, wurde mit einer 5ml-Spritze aufgenommen und über einen Sterilfilter (Porenbreite 0,45µm) auf die HeLa-Zellen gegeben. Es wurden 2ml frisches Nährmedium zugesetzt. Um die Transduktionseffizienz zu steigern, wurde Polybren in einer Konzentration von 5µg/ml zugegeben. Der Transduktionsschritt wurde nach 20 Stunden mit dem neuerdings von den 293T-Zellen abgenommenen virushaltigen Nährmedium wiederholt. Nach weiteren 24 Stunden wurden die HeLa-Zellen in Kulturflaschen überführt und in Normalmedium ausplattiert Transduktion von DG-75-Zellen Direkt vor der Transduktion wurden 1,8x10 6 Zellen pro Transduktionsansatz abzentrifugiert. Im Endvolumen des Transduktionsansatzes von 6ml sollte eine Zelldichte von 0,3x10 6 pro ml vorliegen. Diese wurden in 2ml Nährmedium resuspendiert und in eine Kulturflasche überführt. Der virushaltige Überstand des Nährmediums auf den 293T-Zellen, insgesamt 4ml, wurde in einer 5ml-Spritze aufgenommen und über einen Sterilfilter (Porenbreite 0,45µm) der DG-75- Zellsuspension zugegeben. Die Polybrenkonzentration im Zellansatz wurde auf 5µg/ml eingestellt. Vier Tage nach Abschluss der Transduktion wurde durchflusszytometrisch die Transduktionseffizienz bestimmt. Hierbei wurde der Prozentsatz der GFP (green fluorescent protein)-exprimierenden Zellen erfasst. Bei Transduktionseffizienzen von % konnten die Zellen nach Überprüfung des spezifischen Knockdown-Effektes per Western Blot direkt für Versuche verwendet werden. Im Folgenden konnte als Ersatz für das GFP-Gen ein Puromycin-

69 Methoden oder Blasticidin-Resistenzgen in den pll-vektor eingefügt werden (siehe Abschnitt ) anhand dessen selektiert werden konnte Selektion mittels Puromycin Nach Abschluss der Transduktion konnte bei Verwendung von Vektoren, welche für ein Puromycinresistenzgen kodierten, eine Puromycinselektion vorgenommen werden. Nicht transduzierte Zellen konnten in puromycinhaltigem Medium nur begrenzt überleben. Für die Selektion von HeLa-Zellen wurde eine Puromycinkonzentration von 2,5µg/ml gewählt, für DG-75- Zellen 3,75µg/ml. Die Inkubation in puromycinhaltigem Medium erfolgte über einen Zeitraum von drei bis vier Tagen Selektion mittels Blasticidin HeLa-Zellen wurden bei einer Blasticidinkonzentration von 10µg/mL im Kulturmedium selektioniert. Die Inkubation im Selektionsmedium erfolgte über einen Zeitraum von drei bis vier Tagen. Entscheidendes Kriterium für die Beendigung der Selektionierung war der Nachweis von lediglich avitalem Zellmaterial im Kontrollselektionsansatz, der mit nichttransduzierten und daher nichtresistenten Zellen durchgeführt wurde Durchführung eines Doppel-Knockdown Hierbei wurden die Zellen jeweils mit zwei verschiedenen Vektoren transduziert, welche neben den entsprechenden Knockdownsequenzen für jeweils unterschiedliche Resistenzgene (gegen Puromycin und Blasticidin) kodierten. Dadurch konnte durch Exposition gegenüber Puromycin/Blasticidin spezifisch auf Doppeltransfektanten selektioniert werden. Als Negativkontrolle diente ein Knockdownvektor, der gegen GFP (green fluorescent protein) gerichtet war und damit innerhalb der Zelle gegen keine spezifische Zielstruktur gerichtet war, sondern nur zu unspezifischer Interferenz mit dem Zellsystem führen sollte.

70 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 G1-Regulation in AML-Zellen Cdh1-Expression in Tumorzellinien In Hefezellen konnte gezeigt werden, dass eine unzureichende Reduktion mitotischer Cycline infolge einer verminderten Aktivität von APC Cdh1 während der G1-Phase vermutlich zu Störungen der DNA-Replikation und genetischer Instabilität führt (Wäsch et al., 2002). Vermutlich führt eine verminderte Expression von Cdh1 durch einen vergleichbaren Mechanismus auch in humanen und murinen Zellen zu ähnlichen Konsequenzen, da die Repression beziehungsweise der Verlust von Cdh1 genetische Instabilität verursacht (Engelbert et al., 2008, Garci-Higuera et al., 2008). Im Mausmodell konnte gezeigt werden, dass der Verlust eines Cdh1-Allels zur vermehrten Entstehung verschiedener Tumoren beiträgt (Garci-Higuera et al., 2008). Ferner ist Cdh1 zumindest in bestimmten Zelltypen an einer Reihe von Differenzierungsprozessen beteiligt. Damit ist eine Funktion von Cdh1 als Tumorsuppressor auch in humanen Zellen sehr wahrscheinlich (siehe Abschnitt 1.4.). Wir haben die Expression von Cdh1 an verschiedenen Tumorzelllinien untersucht. Cdh1 Actin 2N 4N 2N 4N Abbildung 14: Cdh1-Expression in Tumorzelllinien. In den untersuchten Tumorzelllinien finden sich weitgehend vergleichbare Zellzyklusverteilungen. Eine Ausnahme bilden die beiden kleinzelligen Bronchialkarzinom- Zelllinien NCI-H82 und NCI-H69. Mittels Western Blot wurde die Cdh1- Expression der einzelnen Tumorzelllinien untersucht. Die Tumorzelllinien wiesen große Unterschiede in der Expression von Cdh1 auf (Engelbert et al., 2008). Die entsprechenden Proteinlysate wurden aus asynchron wachsenden Tumorzelllinien hergestellt und mittels Western Blot analysiert. Es zeigte sich, dass Unterschiede in der Cdh1-Expression nicht nur im Vergleich verschiedener Tumoren, sondern auch innerhalb einer bestimmten Entität

71 Ergebnisse zu finden waren (Abbildung 14). Als Beispiel dafür, dass innerhalb spezifischer Erkrankungsentitäten eine unterschiedliche Cdh1-Expression vorliegt, können die beiden kleinzelligen Bronchialkarzinom-Zellinien NCl-H82 und NCl-H69 als auch die AML-Zellinien HL- 60, Kasumi-1, SKNO-1 und KG-1 genannt werden (Engelbert et al., 2008). Kasumi-1, SKNO-1, MC-116, BV-173, U698, Raji, PF-382, NCI-H82, Hacat und HeLa zeigen gegenüber HL60, KG-1, K-562, DG-75, Jurkat, NCI-H69 und U2OS eine geringere Cdh1-Expression (Abbildung 14) Cdh1-Expression in AML-Zellinien in Korrelation zu AML1-ETO Die Cdh1-Expression wurde in den asynchron wachsenden Zelllinien HL-60, Kasumi-1, SKNO-1 und KG-1 untersucht. Kasumi-1 und SKNO-1 wiesen eine deutlich geringere Cdh1-Expression auf als HL-60 und KG-1 (siehe Abbildung 15). Sowohl Kasumi-1- als auch SKNO-1-Zellen sind durch das Vorhandensein der t(8;21)-translokation gekennzeichnet. Diese Translokation führt zur Expression des AML1-MTG8- oder AML1-ETO-Fusionsproteins, das als transkriptioneller Repressor einer Reihe von Genen bekannt ist. HL-60 Kasumi SKNO-1 KG-1 2N 4N 2N 4N 2N 4N 2N 4N Cdh1 Actin Abbildung 15: Untersuchung der Expression von Cdh1 in akuter myeloischer Leukämie. Während die dargestellten Zellzyklushistogramme eine vergleichbare Zellzyklusverteilung aufweisen, zeigt der Western Blot ein deutlich vermindertes Cdh1- Signal für die beiden AML1-ETOpositiven AML-Zelllinien Kasumi-1 und SKNO Cdh1-Expression in primären AML-Zellen Aufgrund der Beobachtung in Abbildung 15 wurde untersucht, ob sich eine Repression von Cdh1 auch in primären AML-Zellen nachweisen lässt, die das AML1-ETO-Translokationsprotein exprimieren. Hierbei erfolgte ein Vergleich primärer Blastenpopulationen, die per Ficollgradient aus dem peripheren Blut der Patienten isoliert wurden (siehe Abbildung 16). Zwei der untersuchten Patienten waren an einer AML1-ETO-negativen AML erkrankt (Patient 2 und 3), einer litt an einer AML1-ETO-positiven Form dieser Erkrankung (Patient 1) (siehe Tabelle 2). Um

72 Ergebnisse eine entsprechende Vergleichbarkeit der primären malignen Zellen zu gewährleisten, wurde auf einen vergleichbar hohen Blastenanteil im peripheren Blut der Patienten geachtet (siehe Tabelle 2). Der direkte Vergleich zeigt, dass auch in vivo eine Korrelation zwischen dem Vorhandensein von AML1-ETO und einer verminderten Expression von Cdh1 besteht (Abbildung 16). Patient Nr. Diagnose Blastenanteil [%] AML M2; t(8;21) AML, Normalkaryotyp AML M3 84% 90% 78% Tabelle 2: Primäre AML-Zellen mit entsprechendem Blastenanteil im peripheren Blut Cdh1 Actin Abbildung 16: Verminderte Expression von Cdh1 in primären AML1-ETO-positiven AML- Zellen. Der durchgeführte Western Blot zeigt im Falle der AML1-ETO-positiven Zellpopulation eine vergleichbar deutliche Verminderung des Cdh1-Signals, wie sie bereits in den AML- Zelllinien beobachtet wurde Transkriptionelle Repression von Cdh1 in AML1-ETO-positiven AML-Zelllinien HL-60 Kasumi SKNO1 KG-1 HL-60 HL cycles Kasumi 25 cycles Kasumi SKNO-1 SKNO-1 KG-1 KG-1 35 Zyklen Cdh1 GAPDH 25 Zyklen GAPDH Abbildung 17: Verminderte Transkription von Cdh1 in AML1-ETO-positiven AML-Zelllinien. Die anhand der Zellzyklushistogramme ersichtlichen Zellzyklusverteilungen erlauben eine exakte Vergleichbarkeit der untersuchten Zelllinien bezüglich der Cdh1-Transkription. Die RT-PCR amplifiziert cdna nach reverser Transkription der vorhandenen mrna. Anhand der gleichzeitig durchgeführten Amplifikation eines Referenzgens (GAPDH) kann auf die relative Transkriptionsrate des entsprechenden Proteins geschlossen werden. Dabei weisen die AML1-ETOpositiven AML-Zelllinien schwächere Signale auf, als die Vergleichszelllinien. Um zu untersuchen, ob die verminderte Expression von Cdh1 transkriptioneller oder posttranskriptioneller Natur ist, wurde eine semiquantitative RT-PCR durchgeführt.

73 Ergebnisse Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) fand als Referenzgen Verwendung. Diese Untersuchung ergab, dass die Cdh1-mRNA-Menge in den beiden AML1-ETO-positiven AML- Zellinien Kasumi-1 und SKNO1 im Vergleich zu den beiden AML1-ETO-negativen AML-Zellinien HL-60 und KG-1 erniedrigt ist (Abbildung 17). Um bei der vergleichenden Amplifikation von GAPDH als auch von Cdh1 die bestmögliche Sensitivität zu erreichen, wurden doppelte Ansätze pipettiert und nach 25 und 35 Zyklen Analysen vorgenommen Expressionsniveau verschiedener Proteine während eines Mitosedurchlaufs Zellzyklusabhängig regulierte Proteine zeigen während einer bestimmten Phase des Zellzyklus ein Maximum, um danach wieder auf einen Minimalwert abzufallen. Durch Synchronisation mittels Thymidinblock in der frühen S-Phase gelang es, die per Western Blot analysierten Proteinlevels der untersuchten AML- Zellen, HL-60 und Kasumi-1, zu vergleichbaren Zeiten während des Mitosedurchlaufs darzustellen und zu korrelieren. HL-60 Kasumi-1 Abbildung 18: Verminderte Cdh1-Expression in Kasumi-1 während eines synchronisierten Mitosedurchlaufs. 2N 4N Cyclin B Cdh1 Actin HL-60 2N 4N Kasumi-1 Das Zellzyklushistogramm zeigt zunächst die Zellpopulation während des Thymidinblocks. Die folgenden Histogramme spiegeln die verschiedenen Messzeitpunkte nach Thymidinrelease zu verschiedenen Zeitpunkten während G2/M auf dem Western Blot wider. Der Western Blot zeigt, dass die maximale Expression von Cdh1 im Verlauf deutlich niedriger ist, als jene zu vergleichbaren Zeitpunkten in HL-60-Zellen. Während des Thymidinblocks kommt es zum Arrest der Zellpopulation in der frühen S-Phase. Dies ist im Zellzyklushistogramm anhand der prominenten 2N- und geringen 4N-Population erkennbar (Abbildung 18). Die sogenannte 2N-Population umfasst jene Zellen, die ihre DNA noch nicht repliziert haben und sich daher entweder in der G1-oder G0-Phase befinden. Zellen der 4N- Population haben ihre DNA bereits repliziert und befinden sich entweder in der G2-Phase oder in der Mitose. Einen Sonderfall stellen tetraploide G1-Zellen (4N-G1-Zellen) dar. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach Aufheben des Thymidinblocks kann man zuerst eine Zunahme und nach

74 Ergebnisse erfolgter Zellteilung eine Abnahme der 4N-Population beobachten (Abbildung 18). Im Western Blot zeigt sich, dass die Cdh1-Expression in Kasumi-1 während der G2-Phase, während der Mitose und in der frühen G1-Phase unter der von HL-60 liegt (Abbildung 18). Im direkten Vergleich findet sich zu späteren Zeitpunkten in Kasumi-1 noch ein geringfügig höherer Anteil mitotischer Zellen. Dies könnte sowohl auf einen langsameren als auch auf einen asynchroneren Mitosedurchlauf in Kasumi-1 hinweisen (Abbildung 18). Möglicherweise könnte dies aber auch mit einem Zytokinesedefekt zusammenhängen, wie für humane Cdh1-Knockdown- und murine Cdh1- Knockout-Zellen vermutet (Engelbert et al., 2008, Garci-Higuera et al., 2008). Weiterführende, auf diesen Vorarbeiten aufbauende Experimente sollen klären, ob eine verminderte Cdh1-Expression Differenzierungsprozessen, die sich in myeloischen Zellen durch verschiedene Substanzen induzieren lassen, entgegenwirkt und ob eine verminderte Cdh1- Expression zu verstärkter genetischer Instabilität führt. 4.2 Mitoseregulation in AML-Zellen Geringe G2/M-Fraktion und verstärkte Apoptose in AML-Zelllinien Um die Funktion des SCP in den AML-Zellinien HL-60, Kasumi-1, SKNO-1 und KG-1 zu untersuchen, wurden diese mit vier SCP-kompetenten Burkitt-Lymphomzellinien verglichen. Den Nährmedien wurde nach asynchronem Wachstum der Zelllinien die spindeldepolymerisierende Substanz Nocodazol zugesetzt. A 2N 4N Asynchron B 2N 4N Nocodazol Abbildung 19: Verminderte Akkumulation von AML-Zelllinien nach 18-stündiger Nocodazolexposition. A. Die untersuchten Burkitt- Lymphomzelllinien und AML- Zelllinien zeigen hinsichtlich ihrer asynchronen Zellzyklusverteilung keine wesentlichen Unterschiede. B. In Gegenwart von Nocodazol zeigt sich allerdings, dass AML- Zelllinien nur in begrenztem Maße in der Lage sind, eine G2/M- Akkumulation zu induzieren. Im Zellzyklushistogramm zeigte sich, dass die untersuchten AML-Zellinien keinen stabilen G2/M- Arrest induzieren konnten, wie es bei den untersuchten Burkitt-Lymphomzellinien der Fall war (Abbildung 19). Weiterhin zeigten sich bei den untersuchten AML-Zellinien verstärkt apoptotische

75 Ergebnisse Zellen (Abbildung 19), die im Zellzyklushistogramm unterhalb der 2N-Population erscheinen und die deshalb als sogenannte Sub-G1-Fraktion bezeichnet werden G2/M-Verlust und gleichzeitige Apoptosezunahme in Abhängigkeit von der Dauer des Spindelschadens in Kasumi-1-Zellen Um die Dynamik der Mitoseverzögerung und die Zunahme apoptotischer Zellen zuordnen zu können, wurde ein Vergleich zwischen DG-75-Zellen und Kasumi-1-Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten während Nocodazolexposition vorgenommen. Dabei zeigte sich, dass Kasumi-1- Zellen in der Lage sind, einen kurzfristigen Mitosearrest zu induzieren, der sich durch eine Zellpopulation mit einem 4N-DNA-Gehalt auszeichnet. Diese Zellfraktion kann allerdings im Gegensatz zu DG-75-Zellen nicht konstant gehalten werden. Mit zunehmender Dauer des G2/M- Arrests kommt es zu einer immer weiteren Abnahme der 4N-DNA-Population (Abbildung 20). In gleichem Maße kommt es bei Kasumi-1 zu einer Zunahme von apoptotischen Zellen (Abbildung 20). Im Gegensatz dazu bleibt bei DG-75-Zellen während der gleichen Zeitpunkte die 4N-DNA- Population vergleichsweise konstant und der G2/M-Arrest wird stabil aufrecht erhalten. 2N 4N DG-75 2N 4N Kasumi-1 Abbildung 20: Abnahme der G2/M- Population und vermehrte Apoptose mit zunehmender Dauer der Nocodazolexposition. Kasumi-1-Zellen zeigen eine Verminderung der G2/M-Population und eine gleichzeitige Zunahme apoptotischer Zellen bei Schädigung der Mitosespindel. Burkitt-Lymphomzellen sind in der Lage, einen Mitosearrest aufrecht zu erhalten Abnahme der Cyclin B- und Securin-Spiegel nach Spindelschaden Der Ablauf der Chromosomentrennung und der Austritt aus Mitose werden durch den sequentiellen Abbau wichtiger Schlüsselproteine gesteuert. Sowohl Cyclin B als auch Securin müssen degradiert werden, bevor die Trennung der Chromosomen ablaufen kann (Sudakin et al., 1995, Zur et al., 2001, Hagting et al., 2002). Ein funktioneller SCP stabilisiert bei Spindelschädigung beide Proteine und führt zu einem Metaphasearrest. Um zu untersuchen, ob Kasumi-1-Zellen nach einer transienten Mitoseverzögerung aus Mitose austreten, wurde die Expression von Cyclin B und Securin untersucht. Die Zellen wurden durch einen Thymidinblock in der S-Phase synchronisiert. Nach Aufhebung des Thymidinblocks wurden die Zellen

76 Ergebnisse unterschiedlich lang gegenüber Nocodazol exponiert. Sowohl die Menge an Cyclin B als auch an Securin nahm nach einem initialen Anstieg und einem Maximum nach achtstündiger Nocodazolexposition deutlich ab (Abbildung 21). Der Zeitpunkt des Cyclin B- und Securin-Abfalls entspricht in etwa dem Zeitpunkt des Mitoseaustritts in synchronisierten Kasumi-1-Zellen ohne Spindelschaden (siehe Abbildung 18). Die phh3-expression beschreibt das Vorliegen mitotischer Zellen. Die Expression dieses Proteins bildete die Grundlage für die Errechnung des Mitoseindex (siehe Abbildung 22). A DG75 C Cyclin B DG-75 Kasumi-1 2N 4N Nocodazol Securin phh3 Actin B Kasumi-1 2N 4N Nocodazol D Prozent der maximalen relativen Expression h 8h 10h 12h DG-75 Securin DG-75 Cyclin B Kasumi-1 Securin Kasumi-1 Cyclin B Abbildung 21: Abnahme der Mitoseregulatoren Cyclin B und Securin bei Spindelschaden. Die Zellzyklushistogramme zeigen beide Zelllinien sowohl während des Thymidinblocks als auch während der Nocodazolexposition (A, B). Die Proteinanalysen während eines Mitosedurchlaufs synchronisierter Zellen zeigen, dass DG75-Zellen in der Lage sind, Cyclin B und Securin in Gegenwart von Nocodazol zu stabilisieren. In Kasumi-1-Zellen beobachtet man schon zu frühen Zeitpunkten einen Abfall beider Proteinlevels. phh3 dient als Mitosemarker (C). Die Quantifizierung beschreibt die relative Expression von Cyclin B und Securin in DG-75 und Kasumi- 1. Für die relative Expression wurden die Intensitäten der Proteinbanden densitometrisch bestimmt und auf die zugehörigen Actinbanden bezogen (D) Verminderter Anstieg des densitometrisch berechneten Mitoseindex in Kasumi-1- Zellen In der G2/M-Fraktion des Zellzyklushistogramms befinden sich Zellen mit einem replizierten DNA- Gehalt. Damit umfasst diese Population sowohl G2-Zellen als auch mitotische und tetraploide G1- Zellen. Mitotische Zellen zeichnen sich durch die Expression eines spezifischen Mitosechromatins, des Phospho-Histon-H3 (phh3), aus. Durch den Vergleich der phh3-

77 Ergebnisse Expression lässt sich der sogenannte Mitoseindex bestimmen, der beschreibt, wie viele Zellen sich in Mitose befinden. Um den Mitoseindex von DG-75- und Kasumi-1-Zellen in Gegenwart von Nocodazol zu vergleichbaren Zeitpunkten zu erfassen, wurden beide Zelllinien in der frühen S- Phase durch einen Thymidinblock synchronisiert. Der Mitoseindex wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach Beenden des Thymidinblocks bestimmt. Zu diesem Zweck wurde die mittels Western Blot ermittelte phh3-expression anhand der Signalstärke der Actinbande normalisiert und auf den höchsten errechneten Mitoseindex bezogen. Prozent des maximal erreichten Mitoseindex h 8h 10h 12h DG-75 Kasumi-1 Abbildung 22: Verminderter Anstieg und Sättigungskinetik des densitometrisch bestimmten Mitoseindex in Kasumi-1-Zellen. Anhand der phh3-expression (aus Abb. 22) wurde der Mitoseindex densitometrisch errechnet. Dabei zeigen Kasumi-1-Zellen eher eine Sättigungskinetik, während der Mitoseindex von DG-75-Zellen auch zwölf Stunden nach Thymidinsynchronisation einen steilen Anstieg zeigt. Dabei zeigte der Verlauf des Mitoseindex in Kasumi-1-Zellen eine Sättigungskinetik, während der Mitoseindex in DG-75-Zellen einen fortwährenden Anstieg zeigte und damit eine zunehmende Akkumulation mitotischer Zellen (Abbildung 22) Proteasominhibition führt zur Stabilisation von Cyclin B und Securin in Kasumi-1 DG-75 Noc 2N 4N Kasumi-1 Noc 2N 4N DG-75 MG-132 2N 4N Kasumi-1 MG-132 2N 4N Nocodazol MG-132 Cyclin B Securin (mitotisch) Actin DG Kasumi Abbildung 23: Stabilisierung der Cyclin B- und Securin-Expression in Kasumi-1-Zellen durch Proteasominhibition. Nocodazol und der Proteasomhemmer MG-132 führen in DG-75- Zellen zu einer Stabilisierung von APC-Zielproteinen und einer Akkumulation in G2/M. Spindelschädigung durch Nocodazol führt in Kasumi-1 zu keiner Stabilisierung der APC-Zielproteine Cyclin B und Securin. (Mitotisches Securin weist aufgrund von Phosphorylierungen ein höheres Molekulargewicht auf.) Die oben dargestellte Abnahme von Cyclin B und Securin führt zu der Hypothese, dass beide Proteine infolge eines SCP-Defektes und einer nicht inhibierten Proteolyse degradiert werden.

78 Ergebnisse Der Proteasomhemmer MG-132 bedingt eine Stabilisation beider Proteine und führt daher in einem großen Teil der Zellen zu einem Mitosearrest. Die Proteinniveaus von Nocodazolexponierten und MG-132-behandelten DG-75-Zellen waren weitgehend vergleichbar. Kasumi-1- Zellen zeigten bei Proteasominhibition eine vergleichbare Cyclin B- und Securin-Expression, wie DG-75-Zellen unter Nocodazol-Exposition und Proteasominhibition (Abbildung 23). Die gleichzeitige Behandlung mit Nocodazol und MG-132 führte, insbesondere in Kasumi-1, zu einer hohen Toxizität und lieferte daher keine aussagekräftigen Ergebnisse Schwesterchromatidtrennung in AML-Zelllinien trotz Spindelschaden DG75 Daudi Raji Ramos HL-60 Kasumi-1 SKNO-1 KG-1 Aberrante Metaphasen [%] [%] Abbildung 24: Schwesterchromatid-Trennung in AML-Zelllinien bei Nocodazolexposition. Die Schwesterchromatiden der Metaphasechromosomen sind bis zu Beginn der Anaphase im Bereich des Zentromers durch sogenannte Cohesine verbunden. Unter dem Einfluss der APC-abhängigen Proteolyse kommt es zur Spaltung der Cohesin-Brücken durch das Enzym Separase. In den untersuchten AML-Zelllinien zeigt sich, dass es auch in Gegenwart des Spindelgiftes Nocodazol (24-stündige Exposition) teilweise zu einer Trennung der Schwesterchromatiden kommen kann und dass diese dann teilweise als Einzelchromatiden vorliegen (blaue Pfeile), während die Chromatiden in den untersuchten Burkitt-Lymphomzelllinien in der Zentromerregion verbunden bleiben. Dies führt zu der Annahme, dass die Inhibition der APC-abhängigen Proteolyse bei Mitosestörungen in AML-Zellen nicht ausreicht, um einen stabilen Metaphasearrest zu gewährleisten.

79 Ergebnisse Um zu überprüfen, ob die Degradation insbesondere von Securin, aber auch von Cyclin B mit einer verfrühten Trennung der Schwesterchromatiden einhergeht, erfolgte eine mikroskopische Untersuchung von Metaphasechromosomen in Burkitt- und AML-Zelllinien. Beide Zelllinien befanden sich zuvor über einen Zeitraum von 24 Stunden in Nocodazol-haltigen Nährmedium. Hierbei konnte in den vier von uns untersuchten AML-Zelllinien eine deutlich höhere Rate an aberranten Metaphasen (d.h. Metaphasen mit bereits getrennten Schwesterchromatiden) beobachtet werden, als in den Burkitt-Lymphomzelllinien (Abbildung 24). In Kasumi-1 und SKNO- 1 war die Beurteilung durch das Vorliegen von hyperkondensierten Chromosomen allerdings erschwert. Der direkte Vergleich mit Metaphasen, in denen sämtliche Schwesterchromatiden eine enge Verbindung zeigten, ließ aber auch in diesen Zelllinien eine Abgrenzung auffälliger Metaphasen zu. Die Ergebnisse für Kasumi-1- und SKNO-1-Zellen erscheinen plausibel, da bekannt ist, dass die Expression des Fusionsproteins AML1-ETO per se in der Lage ist, eine aberrante Schwesterchromatid-Separation zu induzieren (Boyapati et al., 2007). Die Interpretation der Metaphase-Morphologien wurden abschließend mit einem Zytogenetiker diskutiert und die Korrektheit bestätigt Sequenzanalyse des für die Mad2-bindende Proteindomäne kodierenden Genabschnitts von Cdc20 Um eine fehlende Inhibierbarkeit von Cdc20 infolge einer Mutation innerhalb der Mad2- Bindungsdomäne zu untersuchen, wurde der entsprechende Genabschnitt sowohl in Kasumi-1 als auch in DG-75 sequenziert. Die Ergebnisse der Sequenzierungsreaktion von Kasumi-1 wurden mit denen von DG-75 als auch mit der Cdc20-Sequenz des NCBI verglichen. Dabei konnten keine Mutationen in diesen Sequenzabschnitten in Kasumi-1 festgestellt werden Verminderter BubR1- und Bub1-Gehalt in asynchron wachsenden AML-Zelllinien Bei der Expressionsanalyse der verschiedenen Proteine ist zu erkennen, dass die SCP-Proteine BubR1 und Bub1 in drei von vier untersuchten AML-Zelllinien vermindert exprimiert wurden (Abbildung 25). Die drei AML-Zelllinien Kasumi-1, SKNO-1 und KG-1 weisen im Vergleich zu den Burkitt-Lymphomzelllinien einen geringeren Gehalt an Bub1 und BubR1 auf, während die Expression in den Burkitt-Lymphomzelllinien und in HeLa vergleichbar ist. Die Tatsache, dass die BubR1-Expression in HL-60-Zellen vergleichsweise hoch ist, führt zu dem Schluss, dass noch weitere Mechanismen an der Entstehung des SCP-Insuffizienz-Phänotyps beteiligt sein müssen.

80 Ergebnisse Bub1 BubR1 Bub3 Mad2 Actin Abbildung 25: Expression von SCP-Proteinen in unterschiedlichen Zelllinien. Untersuchung der Expression verschiedener SCP-Proteine in AML-Zelllinien, Burkittlymphom- Zelllinien und HeLa. BubR1 und Bub1 wird in Kasumi-1, SKNO-1 und KG1 vermindert exprimiert Bub1- und BubR1-Knockdown in Zelllinien mittels lentiviral vermittelter RNA- Interferenz Um festzustellen, ob sich durch Verminderung der Bub1- und/oder BubR1-Konzentration innerhalb einer Zelle ein SCP-Defekt wie in den AML-Zelllinien generieren lässt, wurde der Gehalt an Bub1 und/oder BubR1 durch RNA-Interferenz reduziert. Hierbei konnte die Proteinexpression auf ein Niveau gebracht werden, welches mit dem der AML-Zelllinien vergleichbar ist. Da eine Expressionsreduktion trotz hoher Transduktionsrate durch die shrna-exprimierenden Plasmide in der Burkitt-Lymphomzelllinie DG-75 nicht gelang, mussten HeLa-Zellen verwendet werden. Eine mögliche Erklärung für den fehlenden Knockdown-Effekt in DG-75-Zellen wäre eine verminderte Expression von Dicer-Komponenten, wie sie in Bronchialkarzinomen beschrieben wurde (Karube et al., 2005). Darüber hinaus wurde anhand von Mausmodellen gezeigt, dass der Verlust von Dicer-Komponenten zu einem verstärkten Tumorwachstum führt (Kumar et al., 2007) und daher möglicherweise in einer Vielzahl von Tumoren gefunden werden kann Validierung der gegen Bub1 gerichteten Knockdown-Sequenzen Die für den Knockdown von Bub1 konstruierten Vektoren wurden an HeLa-Zellen auf ihre Funktionalität und Knockdowneffizienz überprüft (Abbildung 26). Für die weiterführenden Experimente wurde der Bub1 3 -Vektor verwendet, der den stärksten Knockdown-Effekt zeigte. In diesem Vektor wurde das GFP-Gen gegen das Puromycin-Resistenzgen ausgetauscht, das die Selektion von Bub1-Knockdown-Zellen in Puromycin-haltigem Nährmedium ermöglichte.

81 Ergebnisse Bub1 Actin Abbildung 26: Bub1-Repression durch die verschiedenen shrna-konstrukte. Die vier verwendeten Knockdown- Sequenzen führen in unterschiedlichem Maße zur Reduktion der Bub1- Expression Validierung der gegen BubR1 gerichteten Knockdown-Sequenzen In gleicher Weise wie bei den Bub1-Knockdownsequenzen wurde auch für BubR1 verfahren. Hierbei zeigten drei Sequenzen unterschiedlich starke Knockdowneffekte (Abbildung 27), so dass in diesen Vektoren das GFP-Gen gegen das Blasticidin-Resistenzgen ausgetauscht wurde. Anhand der Blasticidinresistenz konnte nun eine Selektion der transduzierten Zellen vorgenommen und so eine stabile Zelllinie etabliert werden. Soweit nicht anders vermerkt, wurden für die folgenden Versuche die BubR1 1 - und BubR1 4 -Sequenzen verwendet. Ein Knockdown durch die BubR1 3 -Sequenz führte, vermutlich aufgrund einer sehr starken BubR1-Depletion, zu einem Phänotyp mit sehr hoher Letalität. BubR1 Actin Abbildung 27: BubR1-Repressionseffekt durch die verschiedenen shrna-konstrukte. Drei von sechs verwendeten Knockdown-Sequenzen führen zu unterschiedlich starken Knockdown- Effekten Effekte eines Bub1-BubR1-Doppelknockdowns auf HeLa-Zellen Um die Auswirkungen eines verminderten Expressionsniveaus von Bub1 und BubR1 als auch die gleichzeitige Repression beider Proteine zu untersuchen, wurden Einzel- und Doppelknockdown- Experimente durchgeführt (siehe Abschnitt ). Zu diesem Zweck konnten in Puromycinund Blasticidin-haltigem Nährmedium Zellen mit gleichzeitigem Knockdowneffekt gegen Bub1 und BubR1 selektioniert werden. Hierdurch ließ sich eine Zelllinie mit gleichzeitigem Knockdowneffekt

82 Ergebnisse gegen beide Proteine etablieren. In den asynchron wachsenden HeLa-Zellen wurde neben den gewünschten spezifischen Knockdowneffekten ein vergleichbares Ausgangsniveau sowohl von Cyclin B als auch von Securin festgestellt (Abbildung 28). In Gegenwart von Nocodazol ließ sich in der Negativkontrollzelllinie und in der Bub1-Knockdown-Zellinien eine deutliche Stabilisierung von Cyclin B als auch von Securin beobachten. BubR1 Bub1 Cyclin B Securin phh3 Actin Asynchron Nocodazol 24h Abbildung 28: Verminderte Akkumulation von Cyclin B und Securin bei Spindelschaden in BubR1-Knockdown-Zellen. Die asynchron wachsenden Zellen zeigen den Grad des Knockdowns gegen Bub1 und BubR1. Die Bub1 3 - und die BubR1 4 -Sequenz wurden in diesem Experiment verwendet. Cyclin B und Securin werden auf vergleichbarem Niveau exprimiert. Bei Nocodazolexposition kommt es in BubR1- und BubR1-/Bub1-Knockdown- Zellen zu keiner Akkumulation von Cyclin B und Securin. Bei Nocodazolexposition kam es in BubR1- und in Bub1-BubR1-Doppelknockdown-Zellen im Gegensatz zu asynchron wachsenden Zellen zu keiner Akkumulation von Cyclin B oder Securin. Dies legt nahe, dass die APC Cdc20 -abhängige Proteolyse bei Spindelschaden in diesen Zellen nicht inhibiert wird, da BubR1 hierfür erforderlich ist (Abbildung 28) Die verminderte Stabilisierung von Cyclin B bei Spindelschaden korreliert mit dem Grad des BubR1-Knockdowns BubR1 Cyclin B Actin Abbildung 29: Abhängigkeit der Cyclin B- Stabilisation bei Spindelschaden vom Grad des BubR1-Knockdowns. Bei Nocodazolexposition kann Cyclin B umso weniger stabilisiert werden, je stärker der Knockdowneffekt gegen BubR1 ausfällt.

83 Ergebnisse Zellen mit unterschiedlich starkem BubR1-Knockdown-Effekt stabilisieren Cyclin B bei einem Spindelschaden umso schlechter, je niedriger BubR1 exprimiert wird (Abbildung 29). In Zellen, in denen BubR1 nur noch sehr schwach nachweisbar war, konnten nach Nocodazolexposition nur noch Spuren von Cyclin B nachgewiesen werden Der Knockdown von BubR1 führt zu proteasomabhängiger Proteolyse in Gegenwart von Spindeldefekten Um zu untersuchen, ob es sich bei der Degradation von Cyclin B und Securin um eine aberrante Proteasom-abhängige Proteolyse handelt, wurde eine Inhibition des Proteasoms mittels MG-132 vorgenommen. In BubR1-Knockdown-Zellen, vermittelt durch die BubR1 4 -Sequenz, konnte weder Cyclin B noch Securin nach Spindelschädigung durch Nocodazol stabilisiert werden, während in den Kontrollzellen eine deutliche Akkumulation beider Proteine beobachtet werden konnte. Beide Proteine ließen sich jedoch durch Proteasominhibition bei Spindelschaden in den BubR1- Knockdown-Zellen stabilisieren (Abbildung 30). Daher scheint in den BubR1-Knockdown-Zellen eine gestörte Inhibition der Proteasom-abhängigen Proteolyse vorzuliegen. Nocodazol MG-132 BubR1 Cyclin B Securin Actin - - GFP-Kontrolle BubR1-Knockdown Abbildung 30: Stabilisierung der Cyclin B- und Securin-Expression durch Proteasominhibition. Die entsprechenden Zellen wurden über einen Zeitraum von 24 Stunden gegenüber Nocodazol und/oder MG-132 exponiert. Die verminderte Cyclin B-Stabilisierung bei Spindelschaden in BubR1-Knockdown- Zellen lässt sich durch gestörte Proteolyseinhibition erklären. Exposition gegenüber MG-132 und /oder Nocodazol führt sowohl zu einer Stabilisierung von Cyclin B als auch von Securin Zytokinstimulation von primären AML-Zellen mit einer einfachen Zytokinkombination Eine durchflusszytometrische Expressionsbestimmung ist nur bei ausreichendem Vorhandensein mitotischer Zellen möglich. Die Proliferationsrate und damit die Mitosefraktion nativer Blastenpopulationen ist meist sehr gering (Abbildung 31). Eine Erhöhung der Mitosefraktion konnte durch Zytokinstimulation (entsprechend Abschnitt 3.1.4: Kit-Ligand, IL-3, GM-CSF) von myeloischen Blasten aus Patientenblut oder Knochenmarkaspirat erreicht werden.

84 Ergebnisse Nach Separation aus peripherem Blut Nach Zytokin- Stimulation Pat. 1 Pat. 2 Pat. 3 Pat. 4 Abbildung 31: Zytokinstimulation primärer AML-Zellen. SAC-Proteine werden nur während der späten G2-Phase und Mitose exprimiert. Daher sind native Blastenpopulationen, die sich fast ausschließlich in G1/G0 befinden, für die Analyse dieser Proteine nicht geeignet. Nach Stimulation von AML- Blasten durch Zytokine kommt zu einem verstärkten Zellzykluseintritt und einem wachsenden G2/M-Anteil. Pat. 5 CD-34+ Zellzyklusstadium nach Stimulation G1/G0 S G2/M Patient 1 85,8% 7,4% 6,8% Patient 2 88% 8,1% 4% Patient 3 74,8% 19,5% 5,7% Patient 4 57,3% 36% 6,7% Patient 5 59,8% 27,9% 12,3% CD34+ 72,4% 23,4% 4,2% Tabelle 3: Stimulationseffekt nach Zytokinexposition. Die primären Zellen zeigten ein individuell etwas variables Ansprechen auf Zytokinstimulation. Hiermit ließ sich eine Steigerung der G2/M-Fraktion erreichen, die allerdings patientenabhängig etwas variierte (Abbildung 31, Tabelle 3). Ein besserer Effekt wurde bei Zellpopulationen beobachtet, die schon vor Stimulation eine erkennbare Mitosefraktion aufwiesen. Als Kontrollpopulation dienten CD34 + -Knochenmark-Stammzellen eines gesunden Spenders Untersuchung der Expression von BubR1 in primären Zellen nach intensivierter Zytokinstimulation Um eine möglicherweise verminderte BubR1-Expression in AML-Blastenpopulationen zu untersuchen, wurden AML-Blasten aus Knochenmarkaspiraten isoliert. Dabei wurden bevorzugt Knochenmarkaspirate verwendet, die primär einen hohen Blastenanteil aufwiesen (Tabelle 4). Die Zellen wurden durch intensivierte Zytokinstimulation (siehe Abschnitt 3.1.4: Kit-Ligand, Flt3, TPO,

85 Ergebnisse IL-3, IL-6, G-CSF) in den Zellzyklus mobilisiert. Um ein Kontrollexpressionmuster sowohl von Zellen mit regelrechter BubR1-Expression, als auch von Zellen mit verminderter BubR1- Expression in das Experiment zu integrieren, wurde auf das RNAi-Knockdownmodell zurückgegriffen. Der direkte Vergleich der BubR1-Expression von CD34 + -Knochenmark- Stammzellen eines gesunden Spenders und der BubR1-Expression von AML- Blastenpopulationen ist aufgrund der unterschiedlichen Wachstumseigenschaften nur eingeschränkt durchführbar. Während CD34+-Zellen erst nach einigen Tagen ihre maximale Teilungsaktivität zeigen, erreicht die Teilungsrate von AML-Blasten nach kurzer Zeit ihr Maximum und nimmt dann kontinuierlich ab (Engelhardt et al., 2000). Weitere Schwierigkeiten stellen sich bei der Wahl der Zelldichte, da AML-Zellen erst bei höheren Zelldichten gute Stimulationseffekte zeigen. Aufgrund der längeren Stimulationszeiten muss die anfängliche Zelldichte bei CD34+- Zellen sehr viel niedriger gewählt werden. Nachdem sich bei sämtlichen primären AML- Populationen nach Zytokinstimulation eine Zunahme der Mitosefraktion nachweisen ließ, konnte durch Multiparameter-Immunfluoreszenz die BubR1-Expression errechnet werden. Um eine objektive Bewertung der BubR1-Expression zu gewährleisten, erfolgte die Bestimmung der mittleren Fluoreszenzintensität der G2/M-Fraktion der zytokinstimulierten primären AML-Zellen entsprechend Abschnitt Aus den mittleren Fluoreszenzintensitäten des BubR1-Signals und der Isotypenkontrolle ließ sich ein BubR1-Expressionswert errechnen. Die meisten AML- Blastenpopulationen (Patienten 2, 3, 4, 5, 6, 7 und 8) wiesen dabei geringere BubR1- Expressionswerte in G2/M als in den HeLa-Knockdown- und Kasumi-1-Zellen auf. Lediglich die AML-Blastenpopulation von Patient 1 wies etwas höhere BubR1-Expressionswerte als die HeLa- Knockdown-Zellen auf. Patient Nr. Diagnose Zytogenetik Blastenanteil [%] 1 AML +8 84% 2 AML aus MDS Komplexer Karyotyp Verdrängende Infiltr. 3 AML Komplexer Karyotyp 62% 4 AML M2; t(8;21) t(8;21), -Y 92% 5 AML M4eo inv16 Verdrängende Infiltr. 6 AML t(3;14) 89% 7 AML -Y, +8 Verdrängende Infiltr. 8 AML M4eo inv16, +22 Verdrängende Infiltr. Tabelle 4: Primäre AML-Zellen mit hohem Blastenanteil im Knochenmark

86 Ergebnisse A HeLa wt HeLa BubR1 kd DG-75 Kasumi-1 Pat 1 Pat 2 Pat 8 Pat 3 Pat 4 Pat 7 Pat 6 Pat 5 B 4 Fluoreszenzintensität 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Abbildung 32: Durchflusszytometrische Bestimmung der BubR1-Expression in primären Zellen und Zelllinien. Die Histogramme zeigen die Fluoreszenzintensitäten nach BubR1-Färbung und die Fluoreszenzintensitäten der Isotypenkontrollen (A). Die Ratio aus G2/M-spezifischer BubR1- und Isotypenfluoreszenz stellt ein objektives Maß für die BubR1-Expression in der G2-Phase und in der Mitose dar (B). Im Vergleich zu normalen HeLa-Zellen (HeLa wt) und HeLa-Zellen nach BubR1-Knockdown (HeLa BubR1 kd) weisen fast alle der untersuchten primären AML-Zellen ein BubR1-Expressionsniveau auf, das entweder mit dem Expressionsniveau in den HeLa-Knockdown- oder Kasumi-1-Zellen vergleichbar ist oder darunter liegt. Als weitere Kontrolle wurden DG-75-Zellen, als Beispiel für eine Zelllinie mit hoher BubR1-Expression, und Kasumi-1-Zellen, als Beispiel für eine Zelllinie mit niedriger BubR1-Expression, in die Analyse miteinbezogen.