Nukleinsäuren (Prof. Stradal)

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1 Nukleinsäuren (Prof. Stradal) 1

2 Laborbiologie: Biomoleküle Versuchswoche DNA Lernziele sind die Kenntnis: des molekularen Aufbaus und der wichtigsten Eigenschaften der Nukleinsäurebasen, Nukleoside, Nukleotide, DNA und RNA, des Prinzips der Basenpaarung und der semikonservativen Replikation von DNA, des Einflusses verschiedener Faktoren auf die DNA-Struktur, des Prinzips der Reinheitsüberprüfung einer DNA-Probe, der Spektralanalyse von Nukleinsäuren und Proteinen, der enzymatischen Spaltung von DNA und RNA. Fragen zur Theorie: Skizzieren Sie die Struktur der vier DNA-Basen auf. Aus welchen Bausteinen ist DNA aufgebaut? Skizzieren Sie die Struktur eines doppelsträngigen Oligonukleotids aus vier Nukleotiden. Wie kommt die Ladung der DNA-Moleküle zustande und welche Gruppen sind dabei bestimmend? Worauf beruht die Fällbarkeit von Nukleinsäuren? Was sind die Unterschiede zwischen DNA und RNA? Worauf beruhen die Absorptionseigenschaften von Nukleinsäuren und Proteinen? Wie kann man den Reinheitsgrad einer DNA-Probe ermitteln? Auf welchen Prinzipien beruht die Denaturierung von DNA durch - erhöhte Temperatur - ph Erhöhung? Sie isolieren DNA von 2 verschiedenen Organismen O1: 18% AT O2: 30% AT Einer von beiden lebt in heißen Quellen. Was vermuten Sie welcher es ist? Definieren Sie im Zusammenhang mit Nucleinsäuren die Begriffe Denaturierung, Renaturierung und Hybridisierung. Definieren Sie die Begriffe komplementär und antiparallel, wenn man sich auf die beiden Stränge der DNA bezieht. Literatur zur Theorie: Literatur zur Praxis: Nelson, D.L. & Cox, M.M. Lehninger: Principles of Biochemistry, W.H. Freeman an Co, New York, Kapitel 8 Gangolf Schrimpf, Gentechnische Methoden, Spektrum Verlag Heidelberg

3 Sicherheitshinweise: Protokoll: HCl und NaOH sind ätzend (Schutzbrille, Säure/Lauge-Behälter); Isopropanol und Ethanol sind organische Lösungsmittel. Vervollständigen Sie den Protokollvordruck Geräte und Material Spektralphotometer Tischzentrifuge Vibrationsschüttler (Vortex) 2,0 ml Plastik-Reaktionsgefäße 15 u. 50 ml Plastik-Zentrifugen-Gefäße (Falcon) Eisbehälter Pipettenspitzen und Mikroliterpipetten Reagenzien: aqua dest. autoklaviert 70% Ethanol Isopropanol Lysepuffer: 15 mm Tris-HCl, ph 8,0, 10 mm EDTA, 100 µg/ml RNAse 0,2 M NaOH, 1% SDS-Lösung Fällungs-Puffer: 3M Kaliumacetat, ph 5,5 DNA-Lösung (OD 260 = 0.2) Rinderalbumin-Lösung (0.5mg/ml) Rinderleber 3

4 Versuch 1: Präparation von DNA aus Leberzellen Nukleinsäuren lassen sich aufgrund ihrer im Vergleich zu Proteinen unterschiedlichen Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln und Salzlösungen relativ leicht aus einem Gewebehomogenat oder aus einem Zelllysat reinigen. Dabei muss allerdings strikt sauber gearbeitet werden, weil die Präparation ansonsten durch DNA- und RNA-spaltende Enzyme sehr rasch zerstört werden kann. Sämtliche Pipettenspitzen, Gefäße, Lösungen und Puffer müssen keimfrei autoklaviert sein. Versuchsdurchführung: Suspendieren Sie 0,2 g Schweine- oder Rinderleber mit 0.5 ml Lysepuffer im ausgegebenen befäß. Zerkleinern sie das Stück durch hacken mit der Pipettenspitze Überführen die Suspension in einem 15 ml Zentrifugen-Gefäß mit 1,5 ml Lysepuffer und suspendieren durch Auf- und Abpipettieren. Geben Sie zu der Suspension 2 ml NaOH-SDS-Lösung. Inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur (ca. 20 C). Verteilen Sie den Überstand des Zentrifugen-Gefäßes auf vier beschriftete 2 ml Reaktionsgefäße (900µl je Gefäß). Dabei sollen die festen Bestandteile verworfen werden. Geben Sie je Reaktionsgefäß 0,5 ml Kaliumacetat-Lösung hinzu. Dadurch werden die Proteine ausgefällt, die DNA bleibt in Lösung. Inkubieren Sie für 10 min auf Eis. Zentrifugieren Sie diese 5 min bei 4 C in der Tischzentrifuge ( x g oder rpm). ACHTUNG: Austarieren! Nehmen Sie vorsichtig die klaren Überstände ab und überführen Sie diese in ein neues, beschriftetes 15 ml Falcon-Gefäß. Überschichten Sie die wässrige Phase vorsichtig mit 5 ml Isopropanol. Durch das Isopropanol wird die DNA gefällt. An der Grenzschicht wird die gefällte DNA als farbloser Niederschlag sichtbar. Mischen Sie gut und stellen Sie das Gefäß für 10 min auf Eis, um die Fällung zu komplettieren. Verteilen sie die Lösung wieder auf 2 ml Reaktionsgefäße und zentrifugieren Sie 5 min bei 4 C bei x g. Nehmen Sie die Überstände vorsichtig ab und überschichten Sie die Niederschläge mit je 1 ml 70 %-igem Ethanol. Zentrifugieren Sie 5 min bei 4 C bei x g in der Tischzentrifuge. Nehmen Sie das Ethanol ab, lassen Sie das Pellet 10 min lufttrocknen, und lösen Sie die Niederschläge in insgesamt 1 ml (1000 µl) Wasser. Bewahren Sie die DNA-Probe für die weiteren Versuche eisgekühlt auf. 4

5 Laborbiologie: Biomoleküle - DNA WWU Münster Institut für Zoophysiologie Molekulare Physiologie Versuch 2: Reinheitsüberprüfung von DNA Proteine und Nukleinsäuren haben signifikant unterschiedliche Spektren im Wellenlängenbereich zwischen 230 nm bis 320 nm. Diesen Umstand macht man sich bei der Reinheitsüberprüfung von DNA-Präparationen zunutze. Im folgenden Versuchsteil werden Sie zunächst die Spektren einer reinen DNA und eines reinen Proteins (Rinderalbumin) aufzeichnen und vergleichen. Vor diesem Hintergrund werden Sie anschließend Ihre soeben isolierte DNA Probe analysieren. Versuchsdurchführung: Füllen Sie eine Photometer-Küvette mit der vorbereiteten reinen DNA-Lösung (700µl) (erhalten sie vom Kursassistenten). Füllen Sie eine zweite Küvette mit 700µl Wasser. Diese Referenz-Küvette heben Sie bitte bis zum Ende des Kurstages auf. Nehmen Sie nun ein Spektrum im Bereich zwischen 230 nm und 320 nm auf. Dazu gehen Sie folgendermaßen vor: o Platzieren Sie zunächst die mit Wasser gefüllte Referenzküvette mit dem Adapter im Küvettenhalter des Photometers. Auf korrekte Orientierung achten! o Überprüfen Sie jetzt, ob Photometer und Rechner angeschaltet sind. Starten Sie dann das Programm SWIFT - Wavescan. Falls Sie aufgefordert werden, ein angeschlossenes Photometer anzugeben, wählen Sie Ultrospec 3000, III oder 2100pro (je nach Photometer Typ). In der Kommandozeile wählen Sie nun File New. Anschließend müssen Sie unter Parameters die Parameter (Title, Operator, Comments, Filename, Wavelength step=1, start=230nm, end=320nm) Ihrer Messung festlegen. Füllen Sie bitte alle Felder aus und wählen Sie einen sinnvollen Filenamen, der Ihnen erlaubt, Ihre Daten eindeutig zu identifizieren. Bestätigen Sie mit OK. Über Run Standard können Sie nun Ihre Messung starten. Sollten während der Bedienung Fehler oder Unklarheiten auftreten, wenden Sie sich bitte an Ihren Kursassistenten. o Stellen Sie jetzt die Küvette mit Ihrer DNA-Probe in den Strahlengang und nehmen Sie das Proben-('sample')-Spektrum auf. -> Spektrum 1 o Entnehmen Sie die DNA - Probe der Küvette und heben Sie diese eisgekühlt für Versuch 3 auf. Messen Sie jetzt auf die gleiche Weise das Spektrum des Proteins Albumin vom Rind (BSA = bovine serum a (erhalten Sie vom Kursassistenten). -> Spektrum 2 Nehmen Sie nun nach dem gleichen Verfahren ein Spektrum der von Ihnen isolierten Leber-DNA auf. -> Spektrum 3 Schreiben Sie die Werte in eine Tabelle und zeichnen Sie einen Graphen Bestimmen Sie die Konzentration der von Ihnen isolierten DNA OD 260 = 1 entspricht 50µg/ml dsdna 5

6 Versuch 3: Thermochromer Effekt - 'Schmelzen' von doppelsträngiger DNA Doppelsträngige DNA kann durch Erhitzen oder durch Behandlung mit Salzlösungen in die Einzelstränge zerlegt werden. Man nennt diesen Vorgang 'Schmelzen'. Das Schmelzen der DNA ist die Voraussetzung für die Amplifikation durch die Polymerasekettenreaktion, die heute zu den unverzichtbaren Standardmethoden in der Biologie zählt. Das Schmelzen der DNA kann im Photometer beobachtet werden. Versuchsdurchführung: Temperieren Sie das Wasserbad auf 90 C. Nehmen Sie Ihre aus Versuch 2 stammende reine DNA-Lösung. Verschließen Sie das Reaktionsgefäß besonders dicht, indem Sie den Deckel zusätzlich mit Parafilm umwickeln (Das zeigt Ihnen der Kursassistent). Erhitzen Sie das Gefäß 20 min lang bei 90 C im Wasserbad. Legen Sie das Reagenzgefäß sofort auf Eis. Nehmen Sie dann von der erhitzten Probe ein Spektrum auf und vergleichen Sie das Spektrum mit dem aus Versuch 2. -> Spektrum 4 6

7 Laborbiologie: Biomoleküle - DNA WWU Münster Institut für Zoophysiologie Molekulare Physiologie Datum Name Matrikelnummer Protokollvordruck Versuchswoche DNA Versuch 1: Präparation von DNA aus Leberzellen Diskussion: Warum enthält der Lyse-Puffer RNase und welchen Einfluss würde das Weglassen vermutlich auf das Spektrum haben? Warum verändert Zugabe von Kalium-Acetat die Farbe der Lösung? Was bewirkt Zugabe von SDS im Lysepuffer? Worauf beruht die Fällbarkeit von Proteinen? Worauf beruht die Fällbarkeit von DNA? Warum enthält der DNA-Puffer EDTA? 7

8 Versuch 2: Reinheitsüberprüfung von DNA Ergebnisse. Bitte beachten Sie, dass die Achsen der Graphen mit Größe und Einheit beschriftet werden müssen: Spektrum von reiner DNA-Lösung (-> Spektrum 1) l Wert OD 260 = OD 260 / OD 280 = Wellenlänge [nm] Spektrum von BSA-Lösung (-> Spektrum 2) l Wert OD 280 = Wellenlänge [nm] Angenommen Ihre BSA Lösung hat 1 mg/ml dann wäre der der Extinktionskoeffizient also: OD 280 =1 bei mg/ml 8

9 Laborbiologie: Biomoleküle - DNA WWU Münster Institut für Zoophysiologie Molekulare Physiologie Warum lässt sich die Konzentration von Proteinen durch Messung der optischen Dichte bei 280nm nur abschätzen aber nicht genau bestimmen? Spektrum der isolierten Leber-DNA (-> Spektrum 3) l Wert OD 260 / OD 280 = c(dna) = Wellenlänge [nm] Diskussion: Erklären Sie, wie man aufgrund des Spektrums einer DNA-Lösung auf Verunreinigung mit RNA oder Proteinen schließen kann. Was lässt sich über Verunreinigung in der von Ihnen isolierten Leber-DNA sagen? 9

10 Versuch 3: Schmelzen von doppelsträngiger DNA Ergebnisse: Spektrum der nicht-erhitzten und erhitzten DNA (-> Spektrum 1 & 4) l 20 C 90 C Wellenlänge [nm] OD 260 (90 C)= OD 260 (90 C)/OD 260 (20 C)= Diskussion: Welche Schlussfolgerung lässt dieser Wert zu? Unterschrift des Betreuers 10

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