Aufbau eines Assays zur Optimierung einer Polymerase für die Generierung hochgradig fluoreszenz-markierter DNA

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1 Aufbau eines Assays zur Optimierung einer Polymerase für die Generierung hochgradig fluoreszenz-markierter DNA Von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation von Petra Runzheimer aus Kassel

2 Inhaltsverzeichnis 1 INHALTSVERZEICHNIS 2 VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN 1 3 EINLEITUNG 3 4 THEORETISCHE GRUNDLAGEN MOLEKULARBIOLOGISCHE ASPEKTE DIE ROLLE DER POLYMERASEN ALS REPLIKATIONSENZYME ALLGEMEINE PRINZIPIEN DNA-ABHÄNGIGER DNA-POLYMERASEN PHYLOGENETISCHE UND STRUKTURELLE GEMEINSAMKEITEN UNTERSCHIEDLICHSTER POLYMERASEN POLYMERASE- UND EXONUKLEASE-MECHANISMUS DIE DNA-POLYMERASEI UND IHRE FUNKTION IN VIVO DAS KLENOW-FRAGMENT '^>5'-EXONUKLEASE -MECHANISMUS POLYMERASE-MECHANISMUS REGULATION DER GENEXPRESSION BEI PROKARYOTEN DIE STRUKTUR DER DNA INKORPORATION FLUORESZENZ-MARKIERTER NUKLEOTIDE IN DNA Die chemische Kopplung von Fluorophoren an DNA Die enzymatische Inkorporation modifizierter Nukleotide Die Wahl des Farbstoffs Die Möglichkeiten der Kopplung des Fluorophors Die Wahl der Polymerase 30

3 II Inhaltsverzeichnis 4.2 MEßTECHNISCHE ASPEKTE MEßPRINZIP UND -ANORDNUNG FLUORESZENZLÖSCHUNG 37 5 ZIEL DER ARBEIT 38 6 MATERIALIEN UND METHODEN MATERIALIEN GERÄTE KUNSTOFFMATERIALIEN CHEMIKALIEN UND BIOCHEMIKALIEN VERWENDETE KOMPLETTSYSTEME ENZYME Polymerasen Restriktionsendonukleasen LÄNGENSTANDARDS BAKTERIENSTÄMME VEKTOREN Rekombinante Vektoren VERWENDETE MATRIZEN FÜR DAS ASSAY VERWENDETE PRIMER ALLGEMEINE METHODEN AGAROSE-GELELEKTROPHORESE DNA-Elution aus Agarose-Gelen POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (PAGE) DNA-Elution aus PA-Gelen QUANTIFIZIERUNG DER DNA AUFREINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN DNA-PRÄZIPITATION MIT ETHANOL DNA-SPALTUNG MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 51

4 Inhaltsverzeichnis III POLYMERASE-KETTEN-REAKTION FEHLERHAFTE PCR ZUR ZUFÄLLIGEN EINFÜHRUNG VON PUNKTMUTATIONEN PCR ZUR GEZIELTEN EINFÜHRUNG VON PUNKTMUTATIONEN PCR AUF KOLONIEN LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN SYNTHESE UND AUFARBEITUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN SEQUENZIERUNG DNA-FRAGMENTANALYSE MIT GENESCAN PROTEINCHEMISCHE METHODEN SDS-PAGE PROTEINBESTIMMUNG MIT BICHINONIN-SÄURE (BCA) PROTEINAUFREINIGUNG MIT HILFE EINES HISTIDIN-ANKERS Reinigung der exprimierten Polymerase Bestimmung des überproduzierten Polymerase-Anteils am Gesamtproteingehalt der Zelle ARBEITEN MIT ORGANISMEN ANZUCHT IN FLÜSSIGKULTUR ANZUCHT AUF AGARPLATTEN ANLEGEN VON STAMMKULTUREN MESSUNG DER OPTISCHEN DICHTE ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E. coli TRANSFORMATION VON E. coli MIT PLASMID-DNA Kompetente Zellen nach HANAHAN Kompetente Zellen durch Elektroporation ABLAUF DES ASSAYS: KULTIVIERUNG UND ÜBEREXPRESSION DER KLENOW- POLYMERASE IM MLKROTITERPLATTEN-FORMAT VORKULTUR UND HAUPTKULTUR INDUKTION KONTROLLE DER GENEXPRESSION LYSE DER ZELLEN 70

5 IV Inhaltsverzeichnis LOKALISATION DER KLENOW-POLYMERASE IN DER ZELLE IMMOBILISIERUNG DER KLENOW-POLYMERASE POLYMERISATIONSREAKTION Immobilisierung mit streptavidin-ummantelten Beads Immobilisierung mit streptavidin-ummantelten Mikrotiterplatten REINIGUNG UND DENATURIERUNG DES DNA-PRODUKTES Reinigung und Denaturierung mit an Beads gekoppelte DNA Reinigung und Denaturierung der an streptavidin-beschichtete Mikrotiterplatten immobilisierten DNA ANALYSE DES POLYMERISATIONSPRODUKTES MIT GENESCAN ANALYSE DES POLYMERISATIONSPRODUKTES MIT FCS Spezifikation der Meßanordnung FCS-Messung und -Auswertung 79 7 EXPERIMENTE UND ERGEBNISSE GRUNDSÄTZLICHES ZUM AUFBAU DES SCREENING-VERFAHRENS DER GENOTYP: DAS KLENOW-FRAGMENT HERSTELLUNG DER KONSTRUKTE DIE ENTFERNUNG DER 3'->5'-EXONUKLEASE DES KLENOW-FRAGMENTES DER PHÄNOTYP: DIE KLENOW-POLYMERASE KONTROLLE DER GENEXPRESSION LOKALISATION DER KLENOW-POLYMERASE IN DER ZELLE KONTROLLE DER FREIEN BEWEGLICHKEIT DES HISTIDIN-ANKERS OPTIMIERUNG DER EXPRESSION BESTIMMUNG DES ÜBEREXPRIMIERTEN PROTEINANTEILS AM GESAMT PROTEIN DER ZELLE IMMOBILISIERUNG DER POLYMERASE 89

6 Inhaltsverzeichnis 7.4 DAS POLYMERISATIONSPRODUKT DIE OPTIMIERUNG DER TMR-4-CIUTP-KONZENTRATION IM REAKTIONSANSATZ ' DIE IMMOBILISIERUNG DES POLYMERISATIONSPRODUKTES Immobilisierung des Polymerisationsproduktes mit Beads Die Immobilisierung an streptavidin-ummantelte Mikrotiterplatten EINFLUß DER MATRIZENLÄNGE ZUSAMMENFASSUNG DER WICHTIGSTEN ERGEBNISSE DER VOLLSTÄNDIGE ASSAY-ABLAUF PARALLELE PROBENBEARBEITUNG IM 96ER-MIKROTITERPLATTEN- FORMAT DIE INKORPORATIONSEFFIZIENZ DES WILDTYP-ENZYMS DIE GENERIERUNG DER MUTANTENBANK FCS-MESSUNG EINFLUß UNTERSCHIEDLICHER TMR-4-DUTP-KONZENTRATIONEN IM POLYMERISATIONSANSATZ AUF DIE DIFFUSIONSZEIT DISKUSSION DIE WAHL DES PROTEINDESIGNS DAS ASSAY-VERFAHREN DIE EIGENSCHAFTEN DES WILDTYP-ENZYMS MEßTECHNISCHE ASPEKTE 118

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