Analytische Methoden zum Nachweis der Reinheit von Enantiomeren und Diastereomeren :

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1 Analytische Methoden zum Nachweis der Reinheit von Enantiomeren und Diastereomeren : durch Polarimetrie durch NMR-Spektroskopie - NMR-Spektroskopie mit chiralen shift-reagenzien - NMR-Spektroskopie diastereomerer Derivate durch Gaschromatographie (GC) - GC an chiralen Phasen - GC diastereomerer Derivate durch Hochdruckflüssigchromatographie - HPLC an chiralen Phasen - HPLC diastereomerer Derivate durch Kapillarelektrophorese (CE) 299

2 Enantiomerenüberschuß: Die Reinheit chiraler Verbindungen und die Selektivität asymmetrischer Synthesen wird durch die Angabe des Enantiomerneüberschuß (% ee) charakterisiert. % ee = [E 1 - E 2 ] [E 1 + E 2 ] x 100 % ee = Enantiomerenüberschuß in % E 1 > E 2 E 1 = Enantiomer 1 E 2 = Enantiomer 2 % ee = 0% Racemat % ee = 100% reines Enantiomer E1 300

3 Nachweis der Enantiomerenreinheit durch Polarimetrie Definition: Polarimetrie nennt man die Messung der Drehung der Polarisationsebene des linear polarisierten Lichts durch optisch aktive Substanzen. Unter optischer Aktivität versteht man die Eigenschaft verschiedener Stoffe, bei Durchstrahlung mit linear polarisiertes Licht, dessen Ebene um einen gewissen Winkel α zu drehen. circular polarisiertes Licht linear polarisiertes Licht 301

4 Herstellung von polarisiertem Licht: Zur Herstellung von polarisiertem Licht wird ein Nicol sche Prisma verwendet. Das Nicol sche Prisma kann aber ebenso als Analysator zur Untersuchung von polarisiertem Licht verwendet werden, da es nur Licht einer bestimmten Polarisationsrichtung durchläßt. Nicol'sches Prisma Calciumcarbonat (= Kalkspat) circular polarisiertes Licht 68 Canada-Balsam linear polarisiertes Licht 302

5 Aufbau eines Polarimeters: 303

6 Meßergebnis: Auf diese Weise kann man nicht nur ermitteln, daß eine Substanz optisch aktiv ist und in welche Richtung die Drehung erfolgt, sondern man kann auch den Drehwinkel messen. Diese entspricht einfach der Gradzahl um den man den Analysator drehen muß, damit er wieder mit der Schwingungsebene korreliert. 20 [α] = D α l. d Drehwert von Flüssigkeiten (d = Dichte in g/ml) 20 [α] = D α l. c Drehwert von Lösungen (c Konzentration in g/ml) 304

7 Anwendung der Polarimetrie: zur Gehaltsbestimmung von Verbindungen mit bekannter spezifischer Drehung zur Identitäts und Reinheitsprüfung zur Bestimmung der optischen Reinheit eines Enantiomerengemisches zur Bestimmung der Absolutkonfiguration (Vorzeichen des Drehwertes) Nachteile der Methode: hoher Probenbedarf spezifische Drehung (= Drehwert) mancher chiraler Stoffe sehr gering Meßgenauigkeit hängt von vielen Faktoren an (Temperatur, Lösungsmittel, ph, Verunreinigungen,... ) 305

8 Enantiomerenüberschußbestimmung durch Polarimetrie: Bei enantiomer angereicherten Proben wird der Drehwinkel vom Enantiomerenüberschuß bestimmt und zum Drehwinkel einer enenatiomerenreinen Probe in Beziehung gesetzt. % ee = [α] x 100 [α] max % ee = Enantiomerenüberschuß in % Beispiel: 99% ee bedeutet 99.0% (R) + 1.0% (R+S) = 99,5% (R) + 0,5% (S) 306

9 Präzision von polarimetrischen Messungen: Die Einfachheit der Messung täuscht eine hohe Präzision vor (" man kann da doch nichts falsch machen") Beispiel: 1-Phenyl-ethan-1,2-diol 20 [α] = -52,2 (c=0,77 in Me) D Ablesung am Polarimeter: α = ( α = 0.005) Zelllänge: l = 1 dm ( l = dm) Einwaage: m = 0,0770 g ( m = g) Volumen des Lösungsmittels: V = ml ( V = 0.10 ml) Fehler: [α] = -52,2 ± 0,84 (c= 0.77 in Me) 20 D Fehler: 1.6%! daher ee-angaben aufgrund der Drehwertmesung in diesem Beispiel nur bis Maximal 97% ee sinnvoll! 307

10 Einfluß deswassergehalt des Lösungsmittels: 308

11 Einfluß von Gleichgewichtsreaktionen: HO D H HO O H D L HO HO H O H D α-d-glucopyranose 20 [α] = D Kristalle aus Wasser β-d-glucopyranose 20 [α] = + 19 D Kristalle aus Me Mutarotationsgleichgewichtsmischung: 36% α + 64% β 20 [α] = + 52,5 D Offenkettige Form: 0,0026% = 26 ppm! 309

12 Nachweis der Enantiomerenreinheit durch NMR Enantiomere unterscheiden sich prinzipiell NMR-spektroskopisch nicht! Lediglich Diastereomere können unterscheidbare NMR-Signale liefern! Daher ist der Zusatz von enantiomerenreine Hilfsstoffen erforderlich. Methoden: - Lösungsmittel oder Lösungsmitteladditiv ist chiral und enantiomerenrein; es bilden sich diastereomere Komplexe - vor der Messung erfolgt die Synthese von diastereomeren Derivaten mit einem enatiomerenreinen Hilfsstoff Voraussetzungen für die Anwendbarkeit der Methode: - das NMR-Spektrum des Analyten sollte möglichst viele differenzierte NMR-Signale liefern - die getrennt detektierten Signale sollten keine Kopplungen aufweisen - das signal/noise-verhältnis erlaubt eine quantitative Auswertung 310

13 ee-bestimmung mit chiralen shift-reagenzien Als Lösungsmitteladditive werden Komplexe von Lanthaniden (Eu, Pr, Yb,) mit chiralen Komplexbildnern (meist Campher-Derivate) verwendet - Europium(II), MG = 152, Z = 63 - Praseodym(III), MG = 141, Z = 59 - Ytterbium(III), MG = 173, Z = 70 Diese Schwermetalle liefern große shift-effekte ohne große Linienverbreiterung Der Effekt der kommt über die Bindungen und durch Dipolwirkung zustande und ist abhängig vom Abstand zum Schwermetall - Eu, Yb: liefert Tieffeldverschiebung - Pr: ergibt Hochfeldverschiebung Als chirale Komplexbildner werden fluorierte Diketone verwendet, die aus chiral-pool-bausteinen (z.b.campher) hergestellt werden können 311

14 Chirale shift-reagentien (1) 312

15 Chirale shift-reagentien (2) 313

16 Beispiel: Cl O O H O Eu/ 3 O C 3 F 7 (S)-Methyl-2-Chlor-propanoat Europium(III) tris[3-(heptafluorobutanoyl)- (1R)-camphorat = Eu(hfc) 3 314

17 Anwendungsbereich: Diese Methode ist für Arzneistoffe geeignet, die einen Komplex mit dem chiralen shift-reagens bilden können Amine, Aminosäureester, Alkohole, Hydroxysäureester,Thiole, Oxirane, Aziridine, Aldehyde, Ketone, Ester, Sulfoxide,... Präzission der Methode: stark abhängig von Signalform, Signaltrennung und somit der Feldstärke für das Beispiel (S)-Methyl-2-Chlor-propanoat / Eu(hfc) 3 gilt laut Literaturangaben: 99.8 ± 1% ee bei 400 MHz 315

18 ee-bestimmung nach Derivatisierung zu Diastereomeren Die Derivatisierung von Enantiomerenmischungen mit chiralen Reagentien führt zu diastereomeren Produkten; diese haben unterschiedliche NMR-Spektren Detektierbare Kerne: 1 H, 13 C, 19 F, 31 P,.. Kern natürliche Spin Larmor- Verschiebungsbereich Häufigkeit Frequenz δ(ppm) in % (MHz) 1 H 99,989 1/2 500, bis -1 13C 1,070 1/2 125, bis N 0,358 1/2 50, bis F 100 1/2 470, bis P 100 1/2 202, bis

19 Voraussetzungen für die Anwendbarkeit der Methode: a) chirales Reagens muß verfügbar sein (möglichst beide Antipoden) b) chirales Reagens muß klar getrennte, scharfe Signale liefert (z.b. CH 3, OCH 3, CF 3, tbu,...) c) Derivatisierungsreaktion muß quantitativ verlaufen (keine kinetische Racematspaltung!) d) während der Derivatisierung darf keine Racemisierung des Analyten, des Reagenzes oder der Produkte auftreten e) es darf kein Reinigungsschritt vor der NMR-Messung stattfinden, da die Gefahr der Anreicherung eines Diastereomers besteht f) das NMR-Spektrum des Analyten sollte möglichst viele differenzierte NMR-Signale liefern g) Die optische Reinheit des Reagenzes ist limitierend für die Bestimmung geringer Antipodenkonzentrationen h) 13 C-NMR-Signale werden durch unterschiedliche NOE-Effekte unterschiedlich groß - aber gleichartige Kohlenstoffsignale können verglichen werden 317

20 Beispiel: 318

21 Nachweis der Enantiomerenreinheit durch GC Voraussetzungen für die Anwendbarkeit der Methode: - ausreichende Löslichkeit - ausreichende Flüchtigkeit (eventuell erst nach Derivatisierung) - ausreichende thermische Stabilität (Racemisierungsgefahr!) Vorteile der Methode: - hohe Geschwindigkeit - hohe Empfindlichkeit - hohe Auflösung - hohe Präzision - gute Reproduzierbarkeit Nachteile der Methode: - Enantiomere lassen sich durch GC nur an chiralen stationären Phasen trennen! - An achiralen GC-Phasen kann der Nachweis der Enantiomerenreinheit erst nach einer Synthese von diastereomeren Derivaten erfolgen! 319

22 Nachweis der Enantiomerenreinheit durch GC 320

23 Präzision von gaschromatographischen Analysen: sehr hoch, da meist geringes Grundrauschen! 0.1-1% des "minor" Antipoden noch detektierbar Fehlerquellen: Zersetzung der Probe auf der Säule; bei großen Trennfaktoren bleibt ein Enantiomer länger auf der Säule (Minusfehler!) co-ellution von Verunreinigungen (Plusfehler!) "minor" Antipode verschwindet bei der Derivatisierung Racemisierung von konfigurativ labilen Verbindungen im Einspritz-Port oder auf der Säule Detektorlinearität nich gegeben 0.1% ee bedeutet Linearität über 3 Zehnerpotenzen! 321

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28 Nachweis der Enantiomerenreinheit durch HPLC HPLC-Trennung der Oxacepam-Enantiomere an einer chiralen stationärer Phase HPLC-Trennung von α-aminosäuren nach Derivatisierung 326

29 HPLC-Trennung der Oxacepam-Enantiomere an einer chiralen stationärer Phase: 327

30 Trennung von Trennung von α-aminosäuren nach Derivatisierung: 328

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32 Chromatogramm des Racemates: 330

33 Analyse des Racemates: O H N H CO O H N H CO (L) (L) S S H CO H CO N (L) N (D) Standard (Racemat) Area (L) in % Area (D) in % 49,18 50,82 49,25 50,75 49,00 51,00 49,18 50,82 49,50 50,50 49,50 50,50 Mittelwert 49,27 50,73 Korrekturfaktor 1,015 0,

34 Chromatogramme der Proben: 332

35 Analyse der Probe: O H N H CO O H N H CO (L) (L) S S H CO H CO N (L) N (D) Korrekturfaktor für L-Valin = 1,015 Korrekturfaktor für D-Valin = 0,986 Area (L) Area (L) MW (L) Area korr.(l) Area (D) Area (D) MW (D) Area korr.(d) ee(gef.) main enantiomer ,86 L ,15 D % ee = [E 1 - E 2 ] [E 1 + E 2 ] x

36 Nachweis der Enantiomerenreinheit durch Kapillarelektrophorese Monosaccharid-Anakytik nach Derivatisierung mit (S)-Phenylethylamin Anakytik von chiralen Aminen nach Derivatisierung mit (D)-Glucuronsäure Kapillare UV Kappilarelektrophorese (Blockschema) 30 kv 334

37 Monosaccharid-Anakytik nach Derivatisierung mit (S)-Phenylethylamin: HO H O Ph NH 2 HO N Ph D-Glucose NaBH 3 CN B. Lachmann 2000 HO H N Ph 335

38 Elektropherogramm der (S)-Phenylethylamin-Derivate: time [min] 336 mau D,L-glycerinaldehyde D-,L-ery D-,L-lyx D-,L-threo L-,D-gul L-,D-xyl L-,D-rib D-,L-tal D-,L-ara L-,D-glc D-,L-man L-,D-all D-,L-alt L-,D-gal

39 (S)-O-Methyltyrosinol nach Derivatisierung mit (D)-Glucuronsäure: O NH 2 O H N O MeO MeO (L)-O-Methyl-tyrosinol NaBH 3 CN H O N MeO B. Lachmann

40 Elektropherogramme der (D)-Glucuronsäure-Derivate: 60 4,9 mau (R)-Derivat (S)-Derivat mau 4,7 4,5 4,3 (R)-Dericat (S)-Derivat 4,1 20 3,9 10 3, , , , , time (min) 3,5 10, , , ,5 time (min) Diastereomerenmischung 1,1% (R)- neben 98,9% (S)- 338