Resistente Keime von Tieren:

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1 Resistente Keime von Tieren: Verbreitung von Keimen oder Verbreitung von Resistenzgenen? Stefan Schwarz, Kristina Kadlec, Geovana Brenner Michael, Andrea T. Feßler und Anne-Kathrin Schink Institut für Nutztiergenetik, Friedrich-Loeffler-Institut (FLI), Neustadt-Mariensee

2 Grundlegende Vorbemerkungen Entstehung von Resistenzen: Erwerb einer Mutation; meist in einem chromosomal lokalisierten Gen, dessen Genprodukt die Zielstruktur für das betreffende Antibiotikum darstellt Erwerb eines Resistenzgens, das auf einem mobilen genetischen Element (Plasmid, Transposon, Genkassette, ICE, ) lokalisiert ist Vermehrtes Auftreten einer Resistenzeigenschaft: vertikale (klonale) Verbreitung resistenter Bakterien horizontale und vertikale Verbreitung von Resistenzgenen

3 Vertikale Ausbreitung resistent empfindlich resistenzvermittelnde Mutation im Bakteriengenom

4 Vertikale Verbreitung von Antibiotikaresistenzen Resistenz basiert auf Mutationen in Haushaltsgenen: Fluorchinolonresistenz Spectinomycinresistenz Rifampicinresistenz Mutation soll möglichst einen vernachlässigbaren Einfluss auf die Fitness der Bakterien haben. Unterschiedliche Bakterien können die gleichen Mutationen ausbilden.

5 Beispiel 1 Chromosomale resistenzvermittelnde Mutation

6 Rifampicinresistenz bei methicillinresistenten Staphylococcus pseudintermedius von Hunden Rifampicin ist ein Reserveantibiotikum für die Therapie von Infektionen durch multiresistente MRSP-Isolate Rifampicinresistenz entwickelt sich rasch unter der Therapie (keine Rifampicin-Monotherapie!!) Rifampicinresistenz basiert auf Mutationen im Gen rpob

7 Kadlec K., van Duijkeren E., Wagenaar J.A., Schwarz S JAC 66: Rifampicinresistenz bei MRSP kb Isolate no. Sampling date Resistance phenotype M Rifampicin rpob mutation MIC (mg/l) BLA-TET-ML-SXT-GEN-ENR BLA-TET-ML-SXT-GEN-ENR-RIF 2048 His526 Arg BLA-TET-ML-SXT-GEN-ENR-RIF 2048 His526 Arg BLA-TET-ML-SXT-GEN-ENR-RIF 2048 His526 Arg BLA-TET-ML-SXT-GEN-ENR-RIF His526 Arg526 Singulärer Basenaustausch CAC (His) CAG (Arg) Beginn der Rifampicintherapie Ende Jan 2008: Erster resistenter Stamm: Feb 2008 Persistenz für >7 Monate

8 Vertikale Ausbreitung von mobilen Resistenzgenen Plasmide spielen als Träger von Resistenzgenen eine wichtige Rolle bei der Ausbreitung von Resistenzen Plasmide liegen in unterschiedlichen Kopienzahlen vor: High-copy Plasmide ( Kopien pro Bakterienzelle) Low-copy Plasmide (1-2 Kopien pro Bakterienzelle) Plasmide werden bei der Zellteilung auf die Tochterzellen verteilt.

9 Horizontale Ausbreitung von mobilen Resistenzgenen Plasmide und andere mobile genetische Elemente können auch zwischen Bakterien der gleichen und unterschiedlicher Spezies und Genera ausgetauscht werden: Intraspezies-Transfer (S. aureus S. aureus) Interspezies-Transfer (S. aureus S. hyicus) Intergenus-Transfer (E. faecalis S. aureus)

10 Horizontale + vertikale Ausbreitung mobiler Resistenzgene Resistenzplasmid mit einem oder mehreren Resistenzgenen resistent empfindlich

11 Transformation Transduktion Wege der horizontalen Ausbreitung von Resistenzgenen: Transformation (nackte DNA) Transduktion (Beteiligung von Phagen) Konjugation - Mobilisierung Konjugation (inkl. Mobilisierung)

12 Beispiel 2 Kleines, nicht-konjugatives Plasmid mit singulärem Resistenzgen

13 Kehrenberg C., Salmon S.A., Watts, J.L., Schwarz S JAC 48: Horizontale Ausbreitung von mobilen Resistenzgenen Tetracyclin- Resistenzplasmid pmht1 Intergenus-Transfer Pasteurella multocida (diverse Isolate) Intraspezies-Transfer Mannheimia haemolytica Mannheimia varigena Interspezies-Transfer Mannheimia glucosida

14 SmaI-Pulsfeld-Gelelektrophoresemuster pmht1-tragender Isolate Spur 1: Spur 2: Spur 3: Spur 4: Spur 5: Spur 6: Spur M: P. multocida P. multocida P. multocida M. varigena M. haemolytica M. glucosida Längenstandard Kehrenberg C., Salmon S.A., Watts, J.L., Schwarz S JAC 48:

15 Beispiel 3 Größeres, nicht-konjugatives Plasmid mit fünf Resistenzgenen

16 Feßler A.T., Kadlec, K., Schwarz S AAC 55: Apramycin-Resistenzplasmide bei MRSA CC398 von Schweinen, Rindern und Geflügel Nachweis von Apramycinresistenz bei 7/107 MRSA CC398 unterschiedlicher tierartlicher und geographischer Herkunft Alle 7 Isolate verfügten über strukturell eng verwandte Plasmide von ca. 40 kb Apramycin-Resistenzplasmide EcoRI HindIII M BglII PvuI Komplettsequenzierung eines dieser Plasmide

17 Apramycin-Resistenzplasmide bei MRSA CC398 von Schweinen, Rindern und Geflügel aadd tet(l) dfrk erm(b) apma IS257 tnp Plasmid pafs11 verfügt über fünf Resistenzgene: aadd: Kanamycin/Neomycinresistenz tet(l): Tetracyclinresistenz dfrk: Trimethoprimresistenz erm(b): Makrolid-/Linkosamid-/Streptogramin B-Resistenz apma: Apramycinresistenz Co-Lokalisation Co-Selektion und Persistenz

18 Beispiel 4 Integratives konjugatives Element mit zwölf Resistenzgenen

19 Horizontale Ausbreitung von mobilen Resistenzgenen Weitere mobile genetische Elemente, die bei der horizontalen Ausbreitung von Resistenzen eine wichtige Rolle spielen: Transposons (können auch konjugativ sein) Genkassetten ICEs (= Integrative Conjugative Elements)

20 Michael G.B. et al JAC 67: ICEPmu1 GC content (%) Disrupted trna Leu conjugative transfer Disrupted trna Leu kb 82,214 bp DR - L GATTTTGAATCAA DR - R GATTTTGAATCAA

21 ICEPmu1 GC content (%) Resistenzgenregion 1 Resistenzgenregion kb Resistenzgenregion 1 Resistenzgenregion 2 ISApl1 apha1 stra ISCR21 flor ISCR2 ISApl1 strb sul2 ISCR2 lysr erm(42) tetr aada25 msr(e) tetr tet(h) bla OXA-2 mph(e) aadb IS26 IS26 ca kb ca. 9.8 kb Michael G.B. et al JAC 67: 84-90

22 ICEPmu1 ist ein aktives Element springt mit Transferfrequenzen von exprimiert seine Resistenzgene auch in fremden Wirten wie E. coli Strain ICEPmu1 transfer frequency MIC values (mg/l) a TET CHL FFC SUL STR KAN NEO GEN SPE AMP TUL TIL CLIN P. multocida donor P. multocida E Rif R recipient P. multocida E Rif R ::ICEPmu1 1.4 x M. haemolytica Rif R recipient M. haemolytica Rif R ::ICEPmu1 1.0 x E. coli HK225 Rif R recipient E. coli HK225 Rif R ::ICEPmu1 2.9 x Resistenzgene: Michael G.B. et al JAC 67: tet(h) flor sul2 stra strb aada25 apha1 aadb aada25 bla OXA-2 msr(e)- mph(e) erm(42)

23 Folgen des horizontalen Resistenzgen-Transfers Viele Plasmide, Transposons, ICEs etc. verfügen über mehr als nur ein einzelnes Resistenzgen. Mit dem Transfer eines solchen Elements werden auch alle Resistenzgene des mobilen Elements auf neue Wirtsbakterien übertragen. Der Selektionsdruck durch die Anwendung eines Antibiotikums reicht aus, damit Bakterien ein Multiresistenzplasmid, ~transposon oder ~ICE nicht verlieren. Kenntnisse zur Resistenzgenetik sind wichtig, um Persistenz und Co-Selektion zu verstehen.

24 Abschätzung des Ausbreitungspotenzials Kenntnisse über genetische Grundlagen, Lokalisation, Organisation und Verknüpfung ( Physical linkage ) von Resistenzeigenschaften Chromosomale Mutation oder Resistenzgen Wenn Resistenzgen: o auf mobilem genetischen Element lokalisiert? o mit anderen Resistenzgenen co-lokalisiert oder verknüpft? o konjugatives Element / nicht-konjugatives Element? o Wirtsspektrum des Elements? o Transferfrequenz?

25 Forschungsverbund MedVet- Staph: Staphylococcus aureus (MRSA and MSSA) as zoonotic pathogen Forschungsverbund RESET: ESBL and (fluoro)quinolone resistance in Enterobacteriaceae

26 Verbreitung von Keimen oder Verbreitung von Resistenzgenen? Beides Im Einzelfall ist jeweils mit geeigneten molekularen Typisierungsverfahren abzuklären, ob es sich um die Ausbreitung eines Klons (bspw. in einem Tierbestand, Krankenhaus) oder um die Verbreitung von mobilen Resistenzgenen handelt.

27 Besten Dank für Ihre Aufmerksamkeit

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