Warum will man Gene in Zellen einbringen? Gentransfer in eukaryotische Zellen

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1 Warum will man Gene in Zellen einbringen? Gentransfer in eukaryotische Zellen die Zelle soll Eigenschaften bekommen, die sie normalerweise nicht hat die Zelle soll Eigenschaften bekommen, die sie normalerweise haben sollte, d.h. ein Gendefekt soll korrigiert werden Beispiel 1: Untersuchung von Promotoren und anderen regulatorischen Elementen Fusion des Elementes mit Reportergen Transfektion des Fusionsgens Analyse der Expression des Reportergenproduktes ggf. Untersuchung des Einflusses bestimmter Substanzen auf die Expression Beispiel 2: Produktion von Viren um diese wiederum als Vektor einzusetzen um ein Modell zu schaffen für die weitere Untersuchung des Viruses (z. B. durch Einbringen von Reportergenen)

2 Beispiel 3: Gentherapie Therapie von monogenen Erbkrankheiten (z. B. Hämophilie A + B) Krebstherapie (Ersatz defekter zellulärer Tumorsuppressorgene, Verstärkung immunologischer Antwort auf Krebs) Therapie von Infektionskrankheiten (z. B. HIV-Infektion) Beispiel 4: Mutationsanalyse Mutagenese eines Gens Transfektion Analyse der Funktion des Genproduktes: Besser, schlechter, gleich? Beispiel 5: Protein-Produktion Klonierung des Gens für das Protein in einen eukaryotischen Expressionsvektor Transfektion des Vektors in die eukaryotischen Zellen Reinigung des Proteins z. B. aus dem Zellkulturüberstand, falls das Protein sekretiert wird Transiente und stabile Transfektion transient: DNA integriert nicht ins Genom der Zielzelle, starke Expression, aber nur für kurze Zeit stabil: DNA integriert ins Genom der Zielzelle oder bleibt als Episom erhalten

3 Endozytose rezeptorvermittelte Endocytose Phagozytose ( Essen ) Pinozytose ( Trinken ) rezeptorvermittelte Endozytose Methoden DEAE-Dextran Calcium-Phosphat Elektroporation Cationische Liposomen Virus-vermittelter Gentransfer Genegun Mikroinjektion Aktivierte Dendrimere nicht-liposomale Lipide DEAE-Dextran positiv geladenes DEAE-Dextran Molekül interagiert mit negativ geladenem Phosphat- Rückgrat der DNA DNA-DEAE-Dextran-Komplex adsorbiert an Zelloberfläche Aufnahme des Komplexes durch Endozytose hohe Reproduzierbarkeit, cytotoxisch

4 Calcium Phosphat Mischen von DNA in Phosphat-Puffer mit Calcium-Chlorid Calcium-Phosphat-DNA-Komplexe haften an Zellmembran Aufnahme durch Endozytose geringe Reproduzierbarkeit, nicht für alle Zelltypen geeignet Elektroporation Zellen werden Hochspannungs-Puls ausgesetzt Membranpotential der Zelle bricht zusammen, Poren bilden sich für alle Zelltypen geeignet, viel DNA und viele Zellen müssen eingesetzt werden, Optimierung notwendig Kationische Liposomen Phospholipid Mischung aus kationischen und Neutralen Lipiden, bilden Lipid-Bilayer-Struktur aus positiv geladene Liposomen interagieren mit negativ geladenen Phosphat-Gruppen der DNA, Aufnahme durch Endozytose hohe Transfektionseffizienz und Reproduzierbarkeit, Serum stört Quelle: Molecular Biology of the Cell. 3rd ed. Alberts, Bruce; Bray, Dennis; Lewis, Julian; Raff, Martin; Roberts, Keith; Watson, James D. New York and London: Garland Publishing; c1994.

5 Lipid-Bilayer Virus-vermittelter Gentransfer Quelle: das zu transferierende Gen wird ins Virusgenom eingebracht das Virus übernimmt die Aufgabe, die genetische Information in die Ziel-Zelle einzubringen es unterstützt auch darauf folgende Vorgänge und Prozesse, die auf dem Weg zur Expression erforderlich sind Ablauf der Virusinfektion Adsorption: Virusproteine wechselwirken mit Rezeptoren auf Ziel-Zell-Membran Penetration: Viruspartikel gelangt durch rezeptorvermittelte Endozytose oder durch Membranfusion ins Zell-Innere Uncoating: RNA/DNA wird aus dem Capsid freigesetzt, DNA wird ggf. in den Kern transportiert Beispiele für virale Vektoren Retroviren, Lentiviren Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren Herpes-Simplex-Viren Baculovirus (Protein-Produktion in Insektenzellen)

6 Abbildungen (Viren) Genegun Retrovirus Quelle: Retroviruses. Coffin, John M. et al. Plainview (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; c1997. Adenovirus Quelle: ts/web/2001/virology/ Herpes simplex V. Quelle: s/177_05_020902/dwy10631_fm.html DNA wird auf mikroskopisch kleine Goldpartikel präzipitiert Partikel werden in eine Patrone geladen Partikel werden direkt in die Zellen geschossen Mikroinjektion Dendrimere Quelle: Zelle wird unter dem Mikroskop mit Kapillare angesogen mit Mikromanipulator wird feine Spitze eingeführt DNA wird direkt in den Kern injiziert Dendrimere sind hochverzweigte, sphärische Moleküle Verzweigungen enden mit geladenen Aminogruppen werden kontrolliert chemisch synthetisiert haben definierte Größe und Form

7 Aktivierte Dendrimere Dendrimer Strukturen einige Verzweigungen werden aufgebrochen Molekül dadurch flexibler positiv geladene Aminogruppen wechselwirken mit negativ geladenen Phosphatgruppen der DNA Dendrimer-DNA-Komplex ist positiv geladen Wechselwirkung mit negativ geladener Zellmembran Aufnahme des Komplexes durch Endozytose Quelle: The Qiagen Transfection Resource Book Second edition nicht-liposomale Lipide bilden Mizellen-Struktur aus positiv geladene Mizellen-Oberfläche interagiert mit negativ geladenen Phosphatgruppen der DNA Lipid-DNA-Komplex ist leicht positiv geladen, interagiert mit negativ geladener Zell-Membran Aufnahme durch Endozytose