4.3.6 Bilirubin. Säuglinge: 1Tag: <8,7mg/dl 2Tage: <11,3mg/dl 3 5 Tage: < 12,7 mg/dl Kinder: < 1,0 mg/dl Erwachsene: < 1,1 mg/dl

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1 4.3 Photometrische Bestimmungen diagnostisch wichtiger Metabolite Bilirubin Bilirubin reagiert mit diazotierter p-aminobenzolsulfonsäure (Sulfanilsäure) unter Bildung eines Azofarbstoffs. Man unterscheidet konjugiertes Bilirubin, das mit Glucuronsäure konjugiert frei im Serum gelöst ist, und unkonjugiertes Bilirubin, das im Serum an Albumin gebunden ist. Das konjugierte Bilirubin reagiert sofort mit dem Diazoniumsalz, es wird deshalb auch direktes Bilirubin genannt. Das unkonjugierte Bilirubin dagegen muss erst aus der Albuminbindung freigesetzt werden, z. B. durch Zusatz von Coffein, damit es mit diazotierter Sulfanilsäure reagieren kann. Es heißt deshalb auch indirektes Bilirubin. Das Gesamtbilirubin wird unter Zusatz von Coffein bestimmt. Nach Zugabe von alkalischer Tartratlösung entsteht ein blauer Azofarbstoff, der bei 578 nm im Photometer gemessen wird. Aus einer Parallelprobe kann das konjugierte Bilirubin ohne Coffein- und Tartratzusatz bestimmt werden. Es bildet mit diazotierter Sulfanilsäure einen roten Azofarbstoff, dessen Extinktion bei 546 nm im Photometer gemessen wird. Zur Auswertung der Messergebnisse wird eine Kalibrationskurve mit einer Bilirubinstandardlösung erstellt. Das unkonjugierte Bilirubin wird als Differenz aus Gesamtbilirubin minus konjugiertes Bilirubin erhalten.! Fehlerquellen Ein wesentlicher Störfaktor ist die Lichteinwirkung. Sonnenlicht kann schon nach einer Stunde durch Photooxidation bis zu 50 % des Bilirubins zerstören. Deshalb müssen die Proben im Dunkeln verwahrt werden. Hämolytische Seren ergeben zu niedrige Bilirubinwerte. Verschiedene Antibiotika (Tetracyclin, Erythromycin) können mit diazotierter Sulfanilsäure zu unspezifischen Farbreaktionen führen, die die Bilirubinwerte verfälschen. Referenzbereich Gesamtbilirubin Säuglinge: 1Tag: <8,7mg/dl 2Tage: <11,3mg/dl 3 5 Tage: < 12,7 mg/dl Kinder: < 1,0 mg/dl Erwachsene: < 1,1 mg/dl Referenzbereich konjugiertes Bilirubin <0,1mg/dl % des Bilirubins entstehen aus Häm beim Abbau gealterter Erythrozyten hauptsächlich in der Milz, aber auch in der Leber. Der Rest stammt aus dem Abbau anderer Hämoproteinewiez.B.Myoglobin.DasanAlbumingebundeneBilirubinwirdinderLebermit zwei Molekülen Glucuronsäure konjugiert und gelangt über die Galle in den Dünndarm, wo es weiter abgebaut und schließlich mit dem Fäzes ausgeschieden wird. Die Unterscheidung von konjugiertem und unkonjugiertem Bilirubin hilft bei der Differenzialdiagnose der verschiedenen Ikterusformen. Beim prähepatischen, hämolytischen Ikterus entsteht Bilirubin, das nicht mehr komplett mit Glucuronsäure umgesetzt wird, sodass die Konzentration des indirekt reagierenden Bilirubins im Serum erhöht ist. Beim intrahepatischen Ikterus (Schädigung von Leberzellen, z. B. durch eine Hepatitis) findet sich im Serum überwiegend direkt reagierendes glukuronidiertes Bilirubin, das auch mit dem Harn ausgeschieden wird. Beim posthepatischen Ikterus (Verschlussikterus) tritt im Serum überwiegend direkt reagierendes Bilirubin auf, das über die Nieren ausgeschieden werden kann. Eine sehr wichtige Rolle spielt die Bilirubinbestimmung in der Neonatologie. Hier werden durch Hämolyse infolge von Blutgruppenunverträglichkeiten, aber auch durch den Abbau des fetalen Hämoglobins, insbesondere bei Frühgeborenen, mitunter toxische Bilirubinspiegel beobachtet.

2 102 4 Diagnostischer Einsatz klinisch-chemischer Methoden Diese können therapeutische Maßnahmen wie Phototherapie (Zerstörung des Bilirubins durch Licht) oder Blutaustausch erforderlich machen Serumeisen Das Eisen findet sich im menschlichen Organismuszuca.70%imHämoglobin,zuca. 25 % in den Speicherproteinen Ferritin und Hämosiderin, zu 4 % im Myoglobin sowie zu ca. 1 % in eisenhaltigen Enzymen. Lediglich etwa 0,1 % des Eisens zirkuliert im Plasma und ist hier in dreiwertiger Form an das Transportprotein Transferrin gebunden. Zur Bestimmung der Eisenkonzentration im Serum wird das dreiwertige Eisen durch ein Reduktionsmittel (z.b. Ascorbinsäure) in zweiwertiges umgewandelt, das dann mit einem geeigneten Chelatbildner wie Bathophenanthrolindisulfonat oder FerroZine zu einem Farbkomplex reagiert. Die Bestimmung kann ohne Enteiweißung erfolgen, da die Affinität der Chelatbildner zu zweiwertigem Eisen größer ist als diejenige des Transportproteins Transferrin. Aus der Messung der Extinktion bei 546 nm (mit Bathophenanthrolindisulfonat) bzw. bei 578 nm (mit FerroZine ) kann mit Hilfe der entsprechenden Extinktionskoeffizienten die Eisenkonzentration der Probe berechnet werden. Referenzbereich für Eisen mit FerroZine Erwachsene: Männer: μg/dl Frauen: μg/dl In der Literatur finden sich große Unterschiede bei den Angaben der Referenzbereiche. Dies ist auf die große biologische Streubreite und insbesondere auf die starken zirkadianen Schwankungen des Serumeisens zurückzuführen. Die Bestimmung des Serumeisens ermöglicht nur eine grobe Beurteilung des Eisenstoffwechsels. Das Serumeisen gibt keinen Aufschluss über die Eisenvorräte im Organismus. Hier liefert die Bestimmung des Serumferritins, das im Gleichgewicht mit dem Ferritin in den Geweben steht, die gewünschte Information: Damit lassen sich die Eisenvorräte im Körper abschätzen. Um den Eisentransport zu beurteilen, ist zusätzlich die Bestimmung des Transferrins notwendig (Eisensättigung des Transferrins). Erhöhte Serumeisenspiegel können bei Lebererkrankungen beobachtet werden, da Eisen aus den geschädigten Leberzellen ins Blut abgegeben wird. Bei Proteinverlusten (nephrotisches Syndrom, exsudative Gastroenteropathie) kann es zur Ausscheidung von Transferrin und damit auch von Eisen mit konsekutiver Verminderung der Serumeisenspiegel kommen. Ein erhöhter Eisenspiegel im Serum kann auch Folge einer Überladung des Organismus mit Eisen sein (Hämochromatose, Hämosiderose). Die Interpretation der Serumeisenspiegel sollte nur im Zusammenhang mit der Hämoglobinkonzentration im Vollblut und dem Ferritinspiegel im Serum sowie der klinischen Diagnose erfolgen Phosphat im Serum Anorganisches Phosphat liegt im Serum hauptsächlich als sekundäres Phosphat vor. Seine Konzentration hängt von der Phosphatzufuhr in der Nahrung, der Resorptionsleistung des Darms, der Nierenfunktion und vom Parathormon ab. Anorganisches Phosphat reagiert mit Ammoniummolybdat zu Ammoniumphosphomo-

3 4.4 Molekulargenetische Diagnostik 103 lybdat, das mit einem Reduktionsmittel (z. B. Ascorbat) weiter zu Molybdänblau umgesetzt wird. Aus der bei 578 nm gemessenen Extinktion wird anhand eines mitgeführten Phosphatstandards die Konzentration des anorganischen Phosphats in der Probe berechnet. Referenzbereich Kinder: 1 30Tage:3,9 7,7mg/dl ab 1 Jahr: 3,0 6,0 mg/dl Erwachsene: 2,7 4,5 mg/dl! Fehlerquellen Hämolytische Seren dürfen nicht verarbeitet werden, da aus den Erythrozyten freigesetzte Phosphatester durch die Serumphosphatasen gespalten werden und zu falsch hohen Werten führen. Erhöhte Serumphosphatkonzentrationen finden sich im Wachstumsalter, bei Hypoparathyreoidismus, bei chronischer Niereninsuffizienz, bei therapeutischer Vitamin-D-Intoxikation, ggf. bei Knochenmetastasen oder multiplem Myelom. Erniedrigte Phosphatspiegel werden beim primären Hyperparathyreoidismus, bei der Malabsorption, beim Vitamin-D-Mangel (Rachitis, Osteomalazie) sowie beim Phosphatdiabetes (Vitamin-D-resistente Rachitis) beobachtet Cholesterin Das Cholesterin liegt als wasserunlösliches MolekülimSerumnichtinfreierFormvor, sondern ist gemeinsam mit anderen Lipiden im apolaren Innern der verschiedenen Lipoproteine»verpackt«. In diesen kommt es als freies Molekül oder mit Fettsäuren verestert (Cholesterinester) vor. Cholesterin ist Bestandteil von Zellmembranen, aber auch Ausgangssubstanz zur Synthese der Steroidhormone, von Gallensäuren und von Vitamin D 3.Cholesterin wird mit der Nahrung aufgenommen, aber auch endogen synthetisiert, und zwar zu 85%inderLeberundzu12%imDarm.Die Ausscheidung erfolgt über die Haut sowie durch die Galle in den Darm, wobei eine Rückresorption möglich ist (enterohepatischer Kreislauf). Ausführliche Darstellung von Bestimmungsmethoden, Referenzbereichen und Bewertungen siehe Kapitel (S. 230f.) Triglyzeride Triglyzeride sind Ester des dreiwertigen Alkohols Glycerin mit drei langkettigen Fettsäuren. Da sie keine elektrische Ladung tragen, werden sie auch als Neutralfette bezeichnet. Wie das Cholesterin kommen die apolaren Trigyzeridmoleküle im Serum nicht in freier Form vor, sondern sind Bestandteil der Lipoproteine. Die Bestimmung der Triglyzeride kann nach dem klassischen enzymatischen UV-Test oder mit Hilfe des heute stärker verbreiteten enzymatischen Farbtests durchgeführt werden. Ausführliche Darstellung von Bestimmungsmethoden, Referenzbereichen und Bewertungen siehe Kapitel (S. 232f.). 4.4 Molekulargenetische Diagnostik H. Schäfer, S. Schreiber In diesem Beitrag werden Grundlagen und einige Applikationen der molekulargenetischen Diagnostik vorgestellt. In Anbetracht des enormen Umfangs dieses Gebiets und der Vielzahl von Techniken, können nur wesentliche Aspekte behandelt werden. Detailliertere Infor-

4 104 4 Diagnostischer Einsatz klinisch-chemischer Methoden mation sind der entsprechenden Fachliteratur zu entnehmen oder über das Internet zu erlangen Grundlagen Die Molekulargenetik hat sich in den vergangenen15jahrenzueinemunverzichtbarenbestandteil der Labordiagnostik entwickelt. Wesentlicher Ausgangspunkt dieser rasanten Entwicklung war die Etablierung fundamentaler molekulargenetischer Techniken und Entwicklungen, vor allem der Polymerasekettenreaktion (PCR) durch Kary Mullis und Kollegen 1985 (Saiki et al. 1985) sowie daraus resultierender Errungenschaften. Hier sind z. B. die vollständige Entschlüsselung des humanen Genoms, die Identifikation immer neuer genetischer Marker und Determinanten von Erkrankungen sowie die Etablierung hochsensitiver Verfahren zur spezifischen Detektion von Nukleinsäuren zu nennen. Entsprechend widmet sich dieser Abschnitt vornehmlich solchen PCR-basierten Verfahren. Der entscheidende Fortschritt durch die molekulargenetische Diagnostik resultiert aus der Erschließung von Nukleinsäuren als vielen pathologischen Vorgängen zugrunde liegender Entität. Der Nachweis von Nukleinsäuren (DNA, RNA), unabhängig davon, ob sie dem körpereigenen Genom bzw. Transkriptom (mrna) oder pathogenen Erregern (Viren, Bakterien, Pilze, Parasiten) entstammen, erlaubt es in vielen Fällen, direkt eine bestimmte pathologische Ursache nachzuweisen, z. B. Genmutationen bei bestimmten monogenetischen Erkrankungen, Genamplifikationen in Tumoren oder virale bzw. bakterielle Infektionen. Demgegenüber adressiert die klinischchemische und immunologische Analytik klassischerweise die mehr oder weniger spezifische Manifestation der pathologischen Veränderung,z.B.diemodifiziertenAktivitätenund Eigenschaften von Enzymen, Oberflächen- und Signalmolekülen, Struktur- und Speicherproteinen, daraus resultierende bzw. veränderte Metaboliten oder spezifisch generierte Antikörper und responsive Mediatoren. Durch das Ineinandergreifen der klassischen Labordiagnostik und der molekulargenetischen Analytik ist es nun möglich, in vielen Fällen den exakten Nachweis eines bestimmten pathologischen Geschehens zu erbringen, wäh- Tab. 4-2 Genetische Grundbegriffe. Begriff Allel Genotyp Genotypisierung Haplotyp Hemizygotie Homo-/Heterozygotie Polymorphismus Single nucleotide polymorphism (SNP) Wildtyp Bedeutung Bezeichnung für Varianten eines Gens auf den paarweise vorhandenen, homologen Chromosomen Gesamtheit der genetischen Information eines Individuums Bestimmung polymorpher Gene einem Chromosom zuordenbare Nukleotidsequenz an einer oder mehreren polymorphen Stellen auf einem einzelnen Chromosom bei einem Individuum Vorhandensein nur eines Allels Vorhandensein zweier identischer/unterschiedlicher Allele Auftreten eines Allels in einer Population singuläre Basenaustausche, -deletionen, -insertionen in der Natur vorkommendes (»gesundes«) Allel

5 4.4 Molekulargenetische Diagnostik 105 rend dies einstmals nur indirekt und auf Grundlage bestimmter Konstellationen von labordiagnostischen Parametern möglich war. Aus den zunächst eher verschiedenen Forschungsdisziplinen vorbehaltenen Anwendungen der Molekulargenetik sind in der Vergangenheit sehr schnell auch Applikationen für die Routinediagnostik hervorgegangen, die gleichwohl zunächst noch mit erheblichem methodischen und apparativen Aufwand verbunden waren. Doch immer fortschrittlichere Methoden (Real-time-PCR, DNA-Microarray-/Chip- Technologie, DNA-Sequenzierung, amplifizierende Detektionsverfahren), die vor allem an eine automatisierte Hochdurchsatzanalytik adressieren, machen die molekulargenetische Diagnostik mittlerweile auch zu einem unverzichtbaren Bestandteil der modernen Labormedizin. Dies gilt vor allem für die Detektion monogenetischer Erkrankungen, für die Pharmakogenetik, für Vaterschaftstestungen und forensische Analytik (Mikrosatellitenmarker, HLA) sowie für den qualitativen und quantitativen Nachweis pathogener Erreger wie Viren, Bakterien, Pilze und Parasiten. In Tabelle 4-2 sind die wichtigsten genetischen Grundbegriffe erläutert Bestimmungsmethoden Polymerasekettenreaktion (PCR) Konventionelle PCR Die Polymerasekettenreaktion (PCR = polymerase chain reaction) fußt auf der Aktivität thermostabiler DNA-Polymerasen bakteriellen Ursprungs, die einer wiederholten DNA-Denaturierungs- und Elongationsphase ausgesetzt werden können (Abb. 4-9). Entscheidend für die Anwendung der PCR ist die Spezifikation der von der Polymerase verwendeten Matrize (auch Template genannt), von der beliebig viele Kopien generiert werden sollen. Dies wird durch die Bindung kurzer synthetischer, einzelsträngiger DNA-Oligonukleotide (so genannte Primer von zumeist Nukleotiden) erzielt, die über komplementäre Basenpaarung (Adenin-Thymin [A-T], Guanin-Cytosin [G-C]) an die Zielsequenz des einzelsträngigen (durch Denaturierung bei 95 C zu Beginn der Reaktion) Templates binden. HierbeiwerdenzweiverschiedenePrimerinKombination eingesetzt, sodass einer (Forward- Primer) an den so genannten Antisense-(auch Minus- oder 3 -)Strang und einer (Reverse- Zyklus 1 (n = 2) Zyklus 2 (n = 4) Zyklus 3 (n = 8) DNA ( template ) 1. Schritt Schmelzen (95 C) 2. Schritt Annealing (50 C) fp rp Abb.4-9 Schematische Darstellung einer konventionellen PCR. 3. Schritt Extension (72 C)