Einführung in die Biophysik - Übungsblatt 7 - mit Lösungen

Transkript

1 Einführung in die Biophysik - Übungsblatt 7 - mit Lösungen July 2, 2015 Allgemeine Informationen: Die Übung ndet immer montags in Raum H030, Schellingstr. 4, direkt im Anschluss an die Vorlesung statt. Falls Sie Fragen haben, schreiben Sie bitte eine an: patrick.moessmer@physik.uni-muenchen.de 1 Point Spread Function 1.1 Was ist eine "Point Spread Funktion"? Was hat sie mit dem mathematischen Begri der Faltung zu tun? Wo ndet sie Anwendung? Lösung: Die "Point Spread Function" gibt an, wie ein idealisiertes, punktförmiges Objekt durch ein System abgebildet würde. Oft ist die Form der Punktantwort unabhängig vom ursprünglichen Ort des idealen, punktförmigen Objekts. In diesem Fall spricht man von einem linearen System und die Gesamtantwort des Systems kann als Summe über die Punktantworten des in seine Punkte zerlegten Objektes berechnet werden. Das Gesamtbild ist also die Summe aus den Bildern der einzelnen Punkte. Das heiÿt, eine simultane Bildgebung von Objekt A und Objekt B liefert dasselbe Ergebnis wie eine separate Bildgebung der beiden Objekte. Man kann ein Objekt in seine Punkte zerlegen, und wenn man für jeden Punkt die Point Spread Function berechnet, kann man die Abbildung vorhersagen. Wie messe ich eine Point Spread Function? Man braucht dazu erstmal in etwa punktförmige Lichtquellen, zum Beispiel mit uoreszierenden Kügelchen in einem Gel. Die mathematische Faltung einer Punktförmigen Lichtquelle und ihrer Point Spread Function ergibt das Bild. Man kann es auch folgendermaÿen ausdrücken: Convolution mathematically describes the relationship between the specimen and its optical image. Each point object in the specimen is represented by a blurred image of the object (the PSF) in the image plane. An image consists of the sum of each PSF multiplied by a function representing the intensity of light emanating from its corresponding point object: i(x) = + o(x x ) psf(x )dx (1) image(r) = object(r) psf(r) (2) Image(ObjectA + ObjectB) = Image(ObjectA) + Image(ObjectB) Dekonvolution! Man kann ein Objekt also aufteilen in einzelne Punkte, und das Bild des Objekts dann berechnen als die Summe der einzelnen Point Spread Functions. Faltung: Eine Faltung ist eine Art Produkt aus Funktionen, für zwei Funktionen f und g liefert sie eine dritte Funktion f*g. 1.2 Es gibt in der Natur keine ideale punktförmige Lichtquelle. Dennoch gibt es einige Arten von Emittern, die diesem Ideal ziemlich nahe kommen, wie beispielsweise Quantenpunkte. Erklären Sie, wie ein Quantenpunkt aufgebaut ist und wie er funktioniert! Was haben Quantenpunkte in modernen Fernsehern zu suchen? Welche anderen Lichtquellen sind beinahe punktförmige Emitter?

2 Lösung: Ein Quantenpunkt ist ein nanoskopischer Emitter, meist aus Halbleitermaterial. Die Ladungsträger sind in allen drei Dimensionen so stark eingeschränkt, dass sie diskrete Energiewerte einnehmen, auf Gröÿenordnung der De-Broglie-Wellenlänge. Man nennt Quantenpunkte auch gerne "articial atoms". Sie sind modizierbar, die elektronischen und optischen Eigenschaften lassen sich einstellen. Figure 1 Im Fernseher: Die Hintergrundbeleuchtung war bisher weiÿes Licht, aus welchem Filter drei Farben, nämlich blau, grün und rot, herausgeltert haben und zur Erzeugung des Bilds entsprechend gemischt haben. In der neuesten Generation von Fernsehern verwendet man jetzt blaues Licht, das Quantenpunkte anregt, die dann ein sehr reines grünes und rotes Licht emittieren. Danach erst kommen die Filter. Man hat also kaum unerwünschte Farben und sehr schmale Linienbreite, daher höhere Ezienz. Im Gegensatz dazu enthält weiÿes Licht ja alle Farben, von denen viele herausgeltert werden müssen. 1.3 Mit welcher Art von Mikroskopie würden Sie Bilder von Quantenpunkten aufnehmen, und warum? Lösung: Ein Dark Field Microscope ist ideal. Es verfügt über einen dunklen Hintergrund, da der anregende Strahl herausgeletert wird, und nur gestreutes Licht zur Bilderzeugung beiträgt. Es ermöglicht super Kontrast für Ein-Photonen-Emitter. Das Prinzip ähnelt der Betrachtung des Sternenhimmels. Die Sterne sind immer da, auch tagsüber, aber erst vor einem dunklen Hintergrund können wir sie sehen. Darkeld-Microscope zeichnen können!

3 eld 2.png Figure 2 2 Das Abbé-Limit schlagen 2.1 Auf Übungsblatt 1 wurde das Abbé-Limit besprochen. Im Jahr 2014 erhielten Stefan Hell, Eric Betzig und William Moerner den Chemie-Nobelpreis für die Entwicklung superauösender Fluoreszenzmikroskopie. Erklären Sie, wie es den Forschern gelungen ist, das Abbé-Limit zu schlagen! Gehen Sie dabei insbesondere auf Begrie wie STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy) und NSOM (Near-Field Scanning Optical Microscopy) ein! Lösung: Früher funktionierten Mikroskope ausschlieÿlich über ein passives Beleuchten der Probe. Die Probe wurde also angeleuchtet und das von ihr abgestrahlte Licht wurde aufgezeichnet. Die Art der Mikroskopie ist begrenzt durch Abbé-Limit. In der Fluoeszenzmikroskopie nutzt man nun das aktive Leuchten der Probe durch Fluoreszenz. Das Problem ist, dass die Gröÿe des Bereichs, den man zu Fluoreszenz anregt, nicht beliebig klein gewählt werden kann. Die Gröÿe dieses Flecks ist immer noch beugungsbegrenzt. Der entscheidende Punkt ist das Hinzufügen eines Ausschaltungsstrahls. STED gelingt mit Hilfe von stimulierter Emission und einem donutförmigem Ausschaltestrahl. Der anregendee Strahl ist Kreisförmig, des Ausschaltungsstrahl ist ringförmig und schaltet per stimulierter Emission die FLuoreszenz der Teile der Probe, die sich am Rand des anregenden Fokus benden, aus. Somit gelingt eine Verkleinerung des uoreszierenden Bereichs und damit eine höhere Auösung als mit herkömmlicher Lichtmikroskopie. NSOM: Hier funktioniert die Evaneszente Welle üver eine sehr feine Spitze, die einen sehr kleinen Bereich der Probe belechtet. Sie muss sich dazu nah an der Probe benden, wenige Nanometer, sehr viel Näher als die Wellenlängedes verwendeten Lichts. Der korrekte Abstand wird mit einem Feedback-Mechanismusgewahrt, indem entweder der Tunnelstrom konstant gehalten wird, oder über einen Cantilever. Die Beleuchtung erfolgt über Aperturspitzen mit einem optischem Leiter und einer kleinen Önung an der Spitze. Es gibt auch aperturlose Spitzen, die durch Plasmonische

4 Schwingungen im Nahfeld anregen. Der Detektor muss auch wahnsinnig nah an der Probe dran sein! Figure Inwiefern ermöglicht es der "Auslöschungsstrahl" (siehe Abbildung) bei der STED-Mikroskopie, den zentralen uoreszierenden Bereich kleiner zu machen, als es ansonsten mit einem einzigen anregenden Strahl möglich wäre? Der Anregungsstrahl und der schwarzee Fleck im Auslöschungsstrahl sind beide beugungsbegrenzt. Aber die Intensität des Auslöschungsstrahls kann höher gewählt werden als die des Anregungsstrahls. Je höher die Intensität des Ausschaltestrahls, umso genauer die Auösung, damit ist die Auösung quasi unbegrenzt. Das durch stimulierte Emission wieder abgeregte Eletron springt in ein höheres Vibrationslevel, als es das durch Fluoreszenz tun würde. Somit ist die emittierte Wellenlänge rotverschoben und kann mit einem entsprechenden Filter herausgeltert werden, ohne die Fluorezenz der angeregten Probe im Zentrum herauszultern. (die Ernder hieÿen tatsächlich Hell und Klar, machten die Erndung im Jahr 1999 ) Videos: https : // q uery = ST ED https : // = uym ZP F T cxg4 2.3 Auf Blatt 6 wurden die Begrie "Evaneszente Welle" und "Zero-Mode-Waveguide" im Zusammenhang mit der "Single Molecule Real Time"-Sequenzierung besprochen. Welche Rolle spielen diese in der Mikroskopie? NSOM

5 Figure 4 Figure 5 Figure 6