Ringvorlesung B Fluoreszenz und Anwendung in Molekularer Biotechnologie

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1 Ringvorlesung B Fluoreszenz und Anwendung in Molekularer Biotechnologie Inhalt: Physikalische Grundlagen Eigenschaften von Fluorophoren Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Institut für Pharmazie and Molekular Biotechnologie Abteilung: Chemie - Nachwuchsgruppe Chemische Biologie AK Wombacher

2 Fluoreszenz physikalisch chemische Grundlagen

3 Das Jablonski Diagramm Fluoreszenz: Relaxation aus angeregtem Singlet Zustand Phosphoreszenz: Relaxation aus angeregtem Triplet Zustand

4 Fluoreszenzspektren Stokes Shift und Spiegeleffekt Stokes shift Stokes Verschiebung (Stokes shift): Verschiebung hinsichtlich der Wellenlänge bzw. der Frequenz von Licht (elektromagnetische Strahlung) zwischen den Intensitätsmaxima der Absorptions- und Emissionsspektren.

5 Häufige Fluorophore: Emissionswellenlänge und Helligkeit

6 Photostabilitaet verschiedener Fluorophore

7 Ringvorlesung B Fluoreszenz und Anwendung in Molekularer Biotechnologie Inhalt: Häufige Fluorophore Lösungsmittel- und Umgebungseffekte DNA/RNA-Technologien Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Institut für Pharmazie and Molekular Biotechnologie Abteilung: Chemie - Nachwuchsgruppe Chemische Biologie AK Wombacher

8 Dipolmomentaenderung bei Elektronenanregung Aufhebung des Spiegeleffekts Anwendung in environmental probes, z. B. Prodan

9 Fluoreszenzaenderung Lösungsmitteleffekte 4-Dimethylamino-4 -nitrostilben (DNS)

10 DNA-Sequenzierung mit Fluorophoredetektion 4-Lane sequencing

11 DNA-Sequenzierung mit Fluorophoredetektion Single Lane sequencing

12 Fluoreszenzlöschung / Fluoreszenzquenching Quenching-Effekte Zu den Quenching-Effekten gehören alle Vorgänge, die entweder den angeregten Zustand des Fluorophors strahlungslos in den Grundzustand überführen oder aber verhindern, dass der Fluorophor in den angeregten Zustand übergehen kann. Dynamisches Quenching (Stosslöschung) Statisches Quenching Resonanz-Energie-Transfer Mischeffekte (mehrere der zuvor genannten) Das Phänomen der Fluoreszenzlöschung bietet eine Möglichkeit Indikatoren auf Molekularer ebene zu entwerfen.

13 Molecular Beacons Entwickelt 1996 Beinhalten ein Donor (Fluorophor) - Akzeptor (Quencher) Paar Loop Region und Stamm Region Loop Region ist komplementär zu einer Zielsequenz Bindung an Zielsequenz trennt Fluorophor und Quencher räumlich Fluoreszenz

14 Molecular Beacons Anwendung Identifizierung von Punktmutationen Loop komplementär zu Zielsequenz Stamm Bereich (hält F-Q Paar Beieinader) Fluorophor Quencher

15 Molecular Beacons Anwendung Applikation in Microarray Technologie Screening einer großen Anzahl von Sequenzen möglich: Fluoreszenzquenching erfolgt hier durch Wechselwirkung des Fluorophors mit Goldoberfläche Gold ist ein effektiver RET-Fluoreszenzquencher!

16 Molecular Beacons Anwendung Detektion von mrna in lebenden Zellen Monitor Genexpression in einzelnen lebenden Zellen ( >Mikroinjektion) Molecular Beacon gegen beta-actinin mrna Intensität blau rot gibt Information über lokale mrna Konzentration

17 Molecular Beacons Anwendung Sensoren für kleine Moleküle - Aptamere Aptamere: (von lat. aptus, passen und gr. meros, Gebiet) sind kurze einzelsträngige DNA- oder RNA-Oligonukleotide (25 70 Basen), die ein spezifisches Molekül über ihre 3D-Struktur binden können. ATP-Aptamer Hier: Abnahme der Fluoreszenzintensität durch Zusammenführung von Fluorophor und Quencher

18 Molecular Beacons Anwendung Sensoren für kleine Moleküle - Aptamere Sensor für Drogentests: Selektivität

19 FISH - Fluoreszenz in situ Hybridisation Schema zur Fluorescence in situ Hybridisation (FISH)

20 FISH - Fluoreszenz in situ Hybridisation Schema zur Fluorescence in situ Hybridisation (FISH)

21 Excursion: DAPI - DNA-Interkalator als DNA Fluoreszenzmarker Die Verbindung lagert sich bevorzugt an AT-reiche Regionen in der kleinen Furche der DNA an. 4,6-Diamidin-2-phenylindol: Alternative (besser membrandurchgängig): Hoechst (Hoechst stain) DAPI gefärbte DNA in HeLa Zellen in unterschiedlichen Zellphasen: