Folien und Supplementals auf.

Transkript

1 Folien und Supplementals auf

2 Folien und Supplementals auf

3 IUPAC Regeln A = Adenin C = Cytosin G = Guanin T = Thymin U = Uracil R = G A (Purin) Y = T C (Pyrimidin) K = G T (Keto) M = A C (Amino) S = G C W = A T B = G T C D = G A T H = A C T V = G C A N = A G C T/U (Beliebig)

4 Plain FASTA-Format Struktur der Daten ACAAGATGCCATTGTCCCCCGGCCTCCTGCTGCTGCTGCTCTCCGGGGCCACGGCCACCGCTGCCCTGCCCTGGAGGGTGGCCCCACCGG CCGAGACAGCGAGCATATGCAGGAAGCGGCAGGAATAAGGAAAAGCAGCTCCTGACTTTCCTCGCT >AB acc=ab descr=homo sapiens mrna for prepro cortistatin like peptide, complete cds. len=368 ; Kommentarzeile 1 ACAAGATGCCATTGTCCCCCGGCCTCCTGCTGCTGCTGCTCTCCGGGGCCACGGCCACCGCTGCCCTGCC CCTGGAGGGTGGCCCCACCGGCCGAGACAGCGAGCATATGCAGGAAGCGGCAGGAATAAGGAAAAGCAGC >Sequenz 2 ;Kommentarzeile 2 CTCCTGACTTTCCTCGCTTGGTGGTTTGAGTGGACCTCCCAGGCCAGTGCCGGGCCCCTCATAGGAGAGG AAGCTCGGGAGGTGGCCAGGCGGCAGGAAGGCGCACCCCCCCAGCAATCCGCGCGCCGGGACAGAATGCC Obwohl Kommentare möglich sind (durch ;), werden diese von vielen Datenbanken nicht unterstützt. NCBI gibt als Vorgabe für das FASTA-Format: Identifikationszeile Start mit > Sequenz Alle Zeilen mit maximal 80 Zeichen.

5 Struktur der Daten EMBL ID AB standard; RNA; PRI; 368 BP. XX AC AB000263; XX DE Homo sapiens mrna for prepro cortistatin like peptide, complete cds. XX SQ Sequence 368 BP; acaagatgcc attgtccccc ggcctcctgc tgctgctgct ctccggggcc acggccaccg 60 ctgccctgcc cctggagggt ggccccaccg gccgagacag cgagcatatg caggaagcgg 120 caggaataag gaaaagcagc ctcctgactt tcctcgcttg gtggtttgag tggacctccc 180 aggccagtgc cgggcccctc ataggagagg aagctcggga ggtggccagg cggcaggaag 240 gcgcaccccc ccagcaatcc gcgcgccggg acagaatgcc ctgcaggaac ttcttctgga 300 agaccttctc ctcctgcaaa taaaacctca cccatgaatg ctcacgcaag tttaattaca 360 gacctgaa 368 // EMBL Sequenz Dateien können mehrere Sequenzen haben. Diese starten mit SQ und enden mit //.

6 Alle Links bei BioKemika Ihr findet alle Tools unter BCDS Seminar in der BioKemika.

7 Tools und Programme: Group DNA DNA Protein Converter Protein DNA Converter DNA RNA Sequence Editor RNA Sekundärstruktur VARNA Java Applet für RNA Visualisierung PDA Primer Design Assistant NCBI Primer-BLAST DoubleDigest von Fermentas Serial Cloner 2.0

8 Formatierung von DNA Sequenzen GROUP DNA

9 Group DNA Formatierung von DNA Formatiert deine DNA Sequenz Nummeriert Basen Setzt Leerzeichen Setzt Anzahl an Basen/Zeile Sequenzen

10 DNA -> PROTEIN: TRANSLATE

11 DNA -> Protein: Translate DNA oder RNA Sequenz inserieren.

12 DNA -> Protein: Translate Beachte: 3 Open-Reading-Frames pro DNA- Strang; Komplementärer Strang wird ebenfalls translatiert (=> 6 Möglichkeiten). Aussuchen einer der ORFs führt zu einer Seite mit mehr Optionen für die so generierte Proteinsequenz.

13 DNA -> Protein: Translate

14 DNA -> Protein: Translate Auswählen einer Aminosäure in der gegebenen Sequenz führt zu einem virtuellen Swiss-Prot-Eintrag. Nur die Start-Aminosäure kann ausgewählt werden. Protein wird dann bis zum nächsten Stop-Codon translatiert.

15 DNA -> Protein: Translate Möglichkeiten der anschließenden Bearbeitung: BLAST In ExPASy oder NCBI ProtParam Mw, pi, Anzahl der AS, Anzahl der Atome, Extinktionskoefficient, Halbwertszeit, aliphatisches Index Compute pi/mw pi und Mw PeptideCutter Schnittstellen verschiedener Proteasen werden angegeben

16 PROTEIN -> DNA REVERSE TRANSLATE

17 Protein -> DNA reverse translate Protein Sequenz in FASTA Format Codon Usage Standard ist E. coli Codon

18 Protein -> DNA reverse translate Wahrscheinlichkeiten für die einzelne Nucleobasen: Beste Codons für gewähltes Codon- Usage Konsensus für Codons

19 DNA RNA SEQUENCE EDITOR

20 DNA RNA Sequence Editor Möglichkeiten: Antiparallel = Complement und Inverse gleichzeitig Complement = Komplementär- Strang Inverse = Invertieren ACG - GCA T to U = T zu U U to T = U zu T Ucase = Großbuchstaben Lcase = Kleinbuchstaben Einfach DNA- oder RNA-Sequenz einfügen und die gewünschte Operation durchführen.

21 RNA SEKUNDÄRSTRUKTUR ANALYSE

22 Darstellungen der Sekundärstruktur Mehrere Möglichkeiten RNA- Struktur anzuzeigen: a. Radiate b. Circular c. Structure d. Tree

23 RNA Sekundärstruktur Analyse RNA Sequenz im FASTA Format Unten Rechts: Proceed zum Starten

24 RNA Sekundärstruktur Analyse Ausgabe: Primär und sekundär Struktur GGGCUAUUAGCUCAGUUGGUUAGAGCGCACCCCUGAUAA GGGUGAGGUCGCUGAUUCGAAUUCAGCAUAGCCCA (((((((..((((...)))).(((((...)))))...(((((...)))))))))))). rot = sehr wahrscheinlich; lila = sehr unwahrscheinlich. Freie Energie Gibt auch die Sekundärstruktur-Wahrscheinlichkeit an: je mehr Energie frei wird, desto wahrscheinlicher ist die Bildung der Struktur.

25 Java Applet für RNA Visualisierung VARNA

26 VARNA Java Applet für RNA Visualisierung Weitere Optionen durch Rechts-Klick: Öffnen, Speichern, Exportieren von Bildern. Auf Redraw Algorithm kannst du weitere Anzeigemöglichkeiten wählen. Füge die gewünschten Sequenzen ein: Seq: One Letter Code Str: (( )) Code

27 PDA PRIMER DESIGN ASSISTANT

28 PDA Primer Design Assistant Einfach zu bedienen. Sucht nach Fehlerquellen: Dimer Bildung Hairpin Bildung

29 Ergebnis der Primer Suche Save Top und Save All speichert die Primer direkt auf den Computer, wobei Save Top nur die besten 5 Paare speichert. Anzahl der Ergebnisse und Informationen zu den Primer-Paaren. Links führen zu den 5 besten Primer-Paaren bzw. allen Primer-Paaren.

30 5 besten Primer Paare nach PDA Durch Klick auf full text kann die gesamte replizierte Sequenz dargestellt werden. Sequenz der Primer wird Fett dargestellt. Weitere Infos zum Primer-Paar: Tm, GC%, Position der Primer- Bindung.

31 NCBI PRIMER-BLAST

32 Fermentas DOUBLEDIGEST

33 DoubleDigest von Fermentas Mit DoubleDigest könnt ihr Restriktionsenzyme schnell nachschauen und eine Klonierung planen. Angaben über die Qualität der Enzymauswahl werden gegeben, wie Hitzeinaktivierung und Pufferauswahl.

34 Wähle zwei Enzymen um deren Kompatibilität auszuwerten. Enzym-Auswahl

35 Kompatibilität der Enzyme Puffer und Temperatur die vorgegeben werden für beste Effizienz Anpassung mit andere Puffer und Über-Nacht Restriktionen sowie Temperatur für Hitzeinaktivierung (wenn möglich). Vergleich mit weitere Enzyme. Klicke ein Enzym um mehr zu erfahren.

36 Name Erkennungssequenz und Schnittstelle. Produktinformationen Produktauswahl Enzym Informationen

37 SERIAL CLONER 2.0

38 Serial Cloner fr/serial_cloner.html Freeware Windows, Linux und Mac OS X

39 Serial Cloner 2.0 Hauptfunktionen Sequenz im FASTA-Format Graphische Karte zur DNA Sequenz Automatische Suche bestimmter Eigenschaften (z.b. AmpR) Importiert verschiedene Formate (FASTA, GenBank, pdraw32 ) Sequence Alignment Sequence Map

40 Serial Cloner 2.0 Hauptfunktionen weiter Restriktionsanalyse Extraktion und Ligation von Fragmenten Synthese von Adaptor-DNA mit cohesive ends Virtuelle PCR shrna-synthese aus Basis-Sequenz

41 Serial Cloner 2.0 Beispiel pbluescript Hauptseite von Serial Cloner 2.0 Hier werden Informationen zur Sequenz angegeben: Name der Datei Nukleotid-Länge, Typ, Topologie Sequenz Unter Features können Eigenschaften der Sequenz gezeigt werden, z.b. AmpR. Die wichtigsten Funktionen sind gegeben: Speichern Graphic Map Graphische Darstellung der Sequenz Sequence Map Simuliert die Translation der Sequenz Find Findet Sequenzen innerhalb der Sequenz

42 Serial Cloner 2.0 Beispiel pbluescript Graphische Darstellung: Durch die Check-Boxen können verschiedene Informationen eingeblendet werden: Features für die gespeicherten Eigenschaften (z.b. AmpR in grün). Unique Sites zeigt Restriktionsenzyme, für die nur eine Schnittstelle existiert. Double Sites zeigt Restriktionsenzyme, für die genau zwei Restriktionsschnittstellen existieren. Particular Sites zeigt alle Restriktionsenzyme, die durch anklicken von Choose site ausgewählt wurden (z.b. hier EcoRI).

43 Serial Cloner 2.0 Beispiel pbluescript Weiter an Hauptseite von Serial Cloner 2.0 Sequence Map Zeigt die DNA Sequenz dekoriert mit Schnittstellen und Übersetzung auf AS für alle drei Leseraster. Find tool Hiermit könnt ihr automatisch nach bestimmte DNA Sequenzen suchen, wie orf oder AmpR. Die Suche kann auch nach eine beliebige Sequenz sein.

44 Serial Cloner 2.0 Beispiel pbluescript

45 Serial Cloner 2.0 Beispiel pbluescript Weiter an Hauptseite von Serial Cloner 2.0 Sequence Map Zeigt die DNA Sequenz dekoriert mit Schnittstellen und Übersetzung auf AS für alle drei Leseraster. Find tool Hiermit könnt ihr automatisch nach bestimmte DNA Sequenzen suchen, wie orf oder AmpR. Die Suche kann auch nach eine beliebige Sequenz sein.

46 Serial Cloner 2.0 Beispiel pbluescript Weiter an Hauptseite von Serial Cloner 2.0 Sequence Map Zeigt die DNA Sequenz dekoriert mit Schnittstellen und Übersetzung auf AS für alle drei Leseraster. Find tool Hiermit könnt ihr automatisch nach bestimmte DNA Sequenzen suchen, wie orf oder AmpR. Die Suche kann auch nach eine beliebige Sequenz sein.

47 Serial Cloner 2.0 Restriktionsanalyse Virtuelle Restriktion der DNA mit den gewählten Restriktionsenzymen kann im Menü Restriction gestartet werden.

48 Serial Cloner 2.0 PCR Durchführen Im Menü Function kann eine virtuelle PCR gestartet werden. Einfügen beider Primer- Sequenzen (diese können andere Serial Cloner Dateien sein, Open und Save benutzen). Tm wird automatisch berechnet. Fehler werden angezeigt (z.b. dass beide Primer am selben Strang binden). Run erzeugt eine neue Sequenz mit PCR Ergebnis.

49 Serial Cloner 2.0 Konstrukt bauen Biuld a construct: Selektiere in DNA 1 dein Backbone. Selektiere in DNA 2 (und 3) dein Insert. In die graphische Darstellung, suche die Restriktionsstellen. Ein klick für Start und zwei Klicks zum Stop der Sequenz. Wenn fertig, klicke in Ligate. Ein neues Sequenzfenster öffnet mit dem Ligationsprodukt.

50 Serial Cloner 2.0 Konstrukt bauen