Zusammenfassung Chromatographische und Elektrophoretische Trennverfahren. Zeit. [ ] stationär. mobil. " t M t M. = t R. t R,A ' & " t R,A w A 2 + w B

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1 Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 81 Teil Chromatographische und Zusammenfassung Chromatographische und 1. Theoretische Grundlagen t,b t,a Detektorsignal t M : solvent delay M A B w Zeit Verteilungskoeffizient K, K = A etentionszeit t [ ] stationär thermodynamisches, A [ A] mobil Gleichgewicht mobil A stationär Kapazitätsfaktor k k A ' = t " t M t M Selektivitätsfaktor α " = t,b # t M t,a # t M " Anzahl theoretische Böden N N =16 t % $ # w ' & 2 Bodenhöhe H H = L N Auflösung s s = t,b " t,a w A 2 + w B 2

2 Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 82 Teil Chromatographische und Van-Deemter-Gleichung H = B u + c su + c m u Bodenhöhe (H) H c s u Flussgeschwindigkeit, cm/s Einflussfaktoren: longitudinale Diffusion, Diffusion in der stationären Phase, Wirbel-Diffusion in der Säule, Säulendurchmesser, Dicke der stationären Phase 6 c m u B/u 8 ptimieren von etentionszeit und Auflösung Einflussnahme auf α, k, N, H Änderung der Säulentemperatur, der stationären Phase (z.b. Veränderung der Polarität), der mobilen Phase (z.b. ändern des ph), der Flussgeschwindigkeit der mobilen Phase, der Säulenlänge, Erhöhen der k -Werte (k >10 meist nicht mehr effektiv zur Erhöhung der Auflösung), Gradienten fahren (Temperatur, mobile Phase) Nicht-ideale Peakformen (tailing). Häufigster Grund: überladene Säule Quantitative Methoden Externer Standard Interner Standard Standardaddition

3 Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 83 Teil Chromatographische und 2. Gaschromatographie Datenverarbeitung Hauptkomponenten: Gasversorgung Gasreinigung Injektor Säule fen Detektor Datenverarbeitung

4 Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 84 Teil Chromatographische und Temperaturgradient: die meist verwendete Methode zur Änderung der Trennleistung ohne die Kolonne zu wechseln Mobile Phase (Trägergas): inerte Gase wie He oder N 2 Stationäre Phase: feste und flüssige stationäre Phasen. Gepackte Säulen und Kapillarsäulen. Am meisten verwendet: flüssige Phasen in Kapillarsäulen. Flüssige Phasen in Kapillarsäulen: meist auf der Basis von Polysiloxan: Si Si = Methyl, Phenyl, Cyanopropyl, Trifluoropropyl zunehmende Polarität Elutionsreihenfolge kann je nach stationärer Phase ändern (Polaritätsüberlegungen) Temperaturlimit der Säulen beachten (Säulenbluten) GC-Detektoren Flammenionisationsdetektor (FID), der universelle Elektroneneinfangdetektor (ECD), für Halogene Wärmeleitfähigkeitsdetektor (WLD), nicht destruktiv Spektroskopische Methoden, relativ aufwendig Masenspektrometer (MS), universell, das grössten Potential Derivatisierungen: schwerflüchtigen Verbindungen werden messbar, erhöhen z.t. Detektionsempfindlichkeit

5 Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 85 Teil Chromatographische und 3. Flüssigchromatographie (HPLC) Vorrat Pumpe Injektor Filter Säule Detektor Verteilungsprinzipien: Adsorption: die Analyten werden an der berfläche physikalisch adsorbiert (Adsorptionschromatographie). Verteilung: Absorption in die (organische) stationäre Phase (Verteilungschromatographie, Verteilung zwischen mobiler Phase und flüssiger stationärer Phase (oft problematisch) oder kovalent gebundener Phase (am häufigsten verwendet)) Ionische Wechselwirkung (Ionenaustauschchromatographie) Grössenabhängige Diffusion in enge Poren der stationären Phase (Gelpermeationschromatographie) Verteilungschromatographie Mobile Phase ist wesentlich am Trennvorgang beteiligt (v.a. Polaritätsargumente) Gradientenelution: Kontinuierliche Änderung der Eluentzusammensetzung während eines Experiments. Säulenmaterial für chemisch gebundenen Phasen: Trägermaterial: meist Kieselgel-Partikel (3-10µm Durchmesser), poröse oder nicht-poröse Teilchen Normalphasen (polare Eigenschaften) und Umkehrphasen (eversed Phase, aploare Eigenschaften Stationäre Phase Mobile Phase polar apolar (z.b. Hexan) apolar polar (z.b. Wasser) Elutionsreihenfolge der Probenmoleküle apolar vor polar polar vor apolar Bezeichnung Normalphasen Umkehrphasen (eversed-phase )

6 Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 86 Teil Chromatographische und Umkehrphasen (meist chemisch gebunden): Derivatisierung der Kieselgel-berfläche mit apolaren, C 2 -C 18 -Alkysilyl- Verbindungen, z.t. mit polaren Endgruppen H 3 C Si CH 3 H 3 C Si CH 3 ClSi(CH 3 ) 2 Si Si Si Si - HCl Si Si Si Si Beeinflussung der Trennleistung, der Elutionsreihenfolge Ionen(austausch)chromatographie (IC) Kieselgel- oder Polymer-Partikel mit Austauscherharz-Beschichtung: Kationentrennung Anionentrennung Sulfonsäuren: -S - 3 H + Quartäre Amine: N(CH 3 ) + 3 H - Carbonsäuren: -C 2 - H + Primäre Amine: NH Mobile Phase: Wasser mit Puffer Mit IC werden hauptsächlich kleinere anorganische und organische Ionen getrennt. Fast ausschliesslich Leitfähigkeitsdetektor Einsatz von Supressorsäulen Ionenpaarchromatographie Der mobilen Phase wird ein Ionenpaarbildner (sogenanntes Gegenion) als Hilfskomponente zugegeben Mechanismus: Paarbildung in der mobilen Phase oder Ionenaustausch (Gegenion-Analytion) an der stationären Phase Gelpermeationschromatographie Trennung beruht auf der unterschiedlichen ( 3D- ) Grösse der Analytmoleküle etentions-/trennmechanismus: Diffusion der Analyten in die Poren des Packungsmaterials Idealerweise keine weitere Wechselwirkung zwischen Analyt und stationären/mobilen Phase

7 Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 87 Teil Chromatographische und Affinitäts-Chromatographie Trennprinzip: spezifische Wechselwirkung, die bei vielen biochemischen Systemen zu beobachten ist Selektive Adsorption eines Analyten an das Affinitätsharz Elution des Analyten durch Änderung der Zusammensatzung der mobilen Phase (z.b. ph) Einsatz oft im präparativen Bereich Detektoren UV/VIS-Detektor: Absorption des Lösungsmittels beachten Brechungsindex-Detektor: universell aber relativ unempfindlich Fluoreszenz-Detektor: sehr empfindlich Leitfähigkeits-Detektor: Ionenchromatographie Massenspektrometrie-Detektor: empfindlich, aufwendig, APCI, ESI Verdampfungs-Lichtstreu-Detektor: nur für spezielle Anwendungen, Probleme mit Puffersalzen Derivatisierungen: Vor- und Nachsäulenderivatisierung Dünnschichtchromatographie (DC) DC-Platten: Kantenlängen zwischen 5-20cm stationäre Phase: µm dick relativ geringe Auflösung schnell und viele Experimente parallel möglich 2D DC Detektion: off-line, UV, Fluoreszenz, Laser-MS Methoden

8 Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 88 Teil Chromatographische und 4. Elektrophoretischen Trennverfahren Trennprinzip: unterschiedlich schnelle Wanderung von Ionen in einem elektrischen Feld: Ladung/Grösse Kapillarelektrophorese (CE) Kapillare Detektor Elektrode (+) (Anode) Elektrode (-) (Katode) Inlet Elektrolyt (oder Probe) eservoir utlet Elektrolyt eservoir Hochspannung Elektrophoretische Beweglichkeit µ e = q 6"#r elektroosmotischer Fluss Beobachtete Bewegung µ eof = " # E 4 $ % µ app = µ e + µ eof = L d t M E Flussprofil in der CE: flach (HPLC: parabolförmig) Elutionsreihenfolge: Kationen vor Anionen (neutralen Analyten meist nicht getrennt) + _ f e N c,d + b a _ b c N + d e f + _ EF f e c,d b a (Kationen) (Neutrale) (Anionen) Zeit

9 Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 89 Teil Chromatographische und Möglichkeiten zur Veränderung des Elektroosmotischen Flusses Parameter Elektrische Feldstärke E ph-wert Puffer/Ionenstärke Temperatur rganische Lösungsmittel Ergebnis Kleineres E kleinerer EF geringere Auflösung EF-Abnahme bei niedrigerem ph Grössere Ionenstärke Abnahme des Zetapotentials kleinerer EF Höhere Temperatur höhere Viskosität grösserer EF Veränderung des Zetapotentials Tensid-Zusätze zum Puffer Unterhalb der Mizellenbildungs-konzentration Adsorption an Kapillaroberfläche Kation. Tenside: Abnahme oder Umkehrung des EF. Anion.Tenside: Zunahme des EF Hydrophobe Polymere Kovalente Beschichtung Adsorption an Kapillaroberfläche Kovalente Beschichtung an Kapillaroberfläche Mizellar elektrokinetische Kapillarchromatographie (MEKC) Speziell auch zur Trennung von neutralen Analyten Natriumdodecylsulfat (oder andere Tenside) bilden Mizellen = pseudostationäre Phase Verteilungsprinzip: neben der elektrophoretischen Trennung auch chromatographische Verteilung zwischen Puffer und Mizellen Migration der Mizelle bestimmt die Kapazität der Methode Kapillar-Gelelektrophorese Kapillare ist mit Gel gefüllt Trennung von grossen geladenen Molekülen, z.b. Proteine, DNA Isoelektrische Fokussierung Elektrophorese in einem ph-gradienten, der durch ein Gemisch von Trägerampholyten aufrecht gehalten wird. Die Analyten wandern im ph-gradienten zu der Stelle, die ihrem isoelektrischen Punkt entspricht. 2-D PAGE Kombination von isoelektrische Fokussierung (1. Dimension) und SDS-PAGE (SDS: sodium dodecylsulfate, PAGE: polyacrylamide gel electrophoresis, 2. Dimension). Detektoren meist optische Detektionsmethoden, aber auch elektrochemische Detektoren und Massenspektrometrie.

10 Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 90 Teil Chromatographische und 5. Probenaufbereitung Extraktion aus flüssigen Proben Ausschütteln in Scheidetrichter = klassische Methode, großer Lösungsmittelverbrauch Festphasen-Extraktion: grosse Bandbreite and Adsorptionseigenschaften des Adsorbens (= stationäre Phase) steht zur Verfügung Festphasen-Mikroextraktion (SPME): Kein Lösungsmittel nötig; nur kombinierbar mit GC Extraktion aus festen Proben Batch-Extraktion: geringer Aufwand, oft mäßig erfolgreich Soxhlet-Extraktion: Extraktion im heißen Lösungsmittel, zeitaufwendig Ultraschall-Extraktion: Alternaive zur Soxhlet-Extraktion, besser für thermisch labile Substanzen Mikrowellen-Extraktion: geringer Zeitaufwand, nur polare Lösungsmittel einsetzbar Überkritische Fluid-Extraktion (SFE): Extraktion bei erhöhten Druck und Temperatur, meist wird C 2 verwendet, kein Einsatz von Lösungsmittel Aufkonzentrieren der Extrakte otavap: abdampfen von leicht flüchtigen Lösungsmitteln, für grössere Mengen im Einsatz Einengen in Stickstoff-Strom: bei kleinen Volumina bevorzugt im Einsatz Aufreinigung der Extrakte Präparative HPLC: abtrennen von störenden Komponenten in einem chromatographischen System

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