der Blutzellen Separa der Isolation der mononuklear paration Blutausstrichs, Cytopreps und in Institut für Immunologie Biotechnologie

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1 Separa paration der Blutzellen Isolation der mononuklear learenen Zellenen aus dem Blut: Präparationation des Blutausstrichs, Cytopreps und der Anfärbung Universität Pécs, Fakult ultät für Medizin in Institut für Immunologie und Biotechnologie ie

2 Der Blutausstrich

3 Blutausstriche von EDTA-Venenblut müssen innerhalb von 2-4 Stunden angefertigt werden, da man später häufig Abbauformen und atypische Zellen antrifft. 1-2 Tropfen auf das äußere Drittel eines entfetteten Objektträgers geben: Einen zweiten entfetteten Objektträger (oder ein Deckgläschen) mit der schmalen Kante in der Mitte des ersten Objektträgers aufsetzen und im Winkel von an den Bluttropfen heranführen, bis sich dieser an der Kante gleichmäßig verteilt hat: Den zweiten Objektträger im Winkel von über den ersten hinwegschieben. Das anhängende Blut wird so gleichmäßig aufgestrichen. Je kleiner der Ausstrichwinkel und je langsamer man ausstreicht, um so dünner wird der Ausstrich

4 Der Blut utausstrich

5 Die Aufteilung der Lymphozyten im menschlichen Blut 10% NK -Zellen 15% B -Zellen 45% 28% 75% T -Zellen

6 Isolation der mononuklear learenen Zellenen aus dem Blut I 1. Methoden, die auf physikal alischen Parametern basieren: - Filtration (wegen( verschiedener Größ öße der Blutzellen) - Zentrifugation ( wegen verschiedener Sedimentationskonstantenten der Blutzellen) 2. Methoden, die auf der Leukozytenadhärenz basieren: -Nylonwatte:: Monozyten nozyten,, B-ZellB ellenen Adhäsion; T-Zellenen keine Adhäsion -Plastik- oder Glasoberfläche: Adhäsion von MonoM onozyten (Anreicherung), und Beseitigung von Lymphozyten

7 Verteilung von Leukozyten Dichtegradiente - Zentrifugation Ficoll-Dichte 1.077

8 Trennung der der mononuklear learenen Zellenen 1. Frisches Blut (Gerinnung mit Heparin oder EDTA gehemmt) wird in PBS (1:1 Verhältnis ltnis, gebrauchsfertig) verdünnt 2. Blut wird vorsichtig auf die Ficoll-Hypaque - Lösung gefüllt (überschichtet),, 2 ml Ficoll 4 ml verdünntes Blut 3. Zentrifugieren des Röhrchens bei 900g 20 Min, RT 4. Aufnehmen der mononuklear learenen Zellschicht durch das Serum mit einer Pipette 5. Leukozyten werden mit PBS verdünnt nnt (1:3) und dann bei 500 g 10 Min. zentrifugiert. 6. Das Pellet wird in 5 Tropfen PBS aufgelöst 7. Davon werden Cytoprep topreps gemacht 900 g 20 min 500 g 10 min

9 Leukozyte ytenseparation durch Dichtegradient gradienten Ficoll: Saccharosepolymer Dichte = g/ml entwickelt für die Isolation von Lymphozyten aus peripherem Blut Percoll PVP-beschichtete Silicapartikeln bilden einen isoosmotischen Gradienten g/ml geeignet für Zellseparation

10 Percoll -Gradientenzentrifugation Blut auf Percoll Serum Mononukleare Zellen Percoll Supernatant Erythrozyten Zentrifugierung Pellet

11 Cytoprep von isolierten mononuklearen Zellen

12 Isolation der mononuklear learenen Zellenen vom Blut II 3. Separationsmethod methodenen basieren rend auf Zelloberflächenstrukturen chenstrukturen: - Rosette: Bindung zwischen CD2-Mole olekül humaner T-Zellenen und Rotblutzellen des Schafes (SRBC) -Immunrosette mit Antikörper-beschichteten SRBC (zelloberflächenspezifische Antikörper) -Immunrosette mit Antikörperkomplex, (Anti ntikörperkombination von zelloberflächenspezifischen-undnd RBK-spe spezifischen Antikörpern) - Paramagnetische Kügelchen (MACS) - Zellaffinitätschromatographie - FACS - Immunopanning - Antikörper-beschichtete Plastikoberfläche - Komplementvermittelte Zellenlyse - Elimination ion der durch Antikörper markierten Zellenen durch das Komplementsystem

13 Schematische Abbildung der Immunrosette

14 Affinitäts tschromatographie

15 Immunopanning 1. Zelloberflächenproteinspezifische Antikörperbeschichtete Petrischale 2. Spezifische Bindung zwischen Zellen und Antikörpern

16 Komplementvermittelte Zellenlyse

17 Zellseparation mit Antikörperbeschichteten magnetischen Körperchen (MACS)

18 Zellseparationeparation mit Durchflusszytometr ytometrie I: auf Größ öße und Granularität basierend

19 Zellseparationeparation mit Durchflusszytometr ytometrie II: mit fluoreszenten Molekülen konjugierte Antikörper

20 May-Gr Grünwald-Giemsa-Färbung 1, Trocknen der Blutausstriche, Cytopreps topreps. 2, Fixierung ierung mit May-Gr Grünwald-Lösung 3 Min. 3, Verdünnen der May-Gr Grünwald-Lösung mit destilliertem Wasser, Färben 1-3 Min. 4, Vorsichtiges Waschen der Ausstriche, Cytopreps mit destilliertem Wasser 5, Färbung mit Giemsa-Lösung sung 20 Min. Die Blutausstriche und Cytopreps dürfen nicht austrocknen, es soll genug Färbelösung auf der Probe sein!