Zellkulturtechnik: Hamsterzellen und die Herstellung Biopharmazeutika gehören zu den umsatzstärksten Medikamenten. Die meisten

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1 Powered by Seiten-Adresse: Zellkulturtechnik: Hamsterzellen und die Herstellung von Biopharmazeutika Biopharmazeutika gehören zu den umsatzstärksten Medikamenten. Die meisten erfolgreichen biopharmazeutischen Wirkstoffe werden in CHO- Zelllinien hergestellt. Scharfe Konkurrenz zwingt die Produzenten zu ständigen Verbesserungen im Prozessablauf und in der Anlagentechnik, für die hoch qualifizierte Fachkräfte benötigt werden. Cricetulus griseus, der chinesische Zwerghamster privat Biopharmazeutika sind makromolekulare Wirkstoffe ( Proteine, Nukleinsäuren), die nicht durch chemische Synthese, sondern in gentechnisch veränderten lebenden Zellen hergestellt werden. Die ersten Biopharmazeutika wie Insulin und Wachstumshormon wurden in geklonten Bakterien, die leicht in Kultur zu halten sind, schnell wachsen und hohe Ausbeuten an rekombinantem Protein liefern, hergestellt. Bakterienzellen können aber die für viele unserer Proteine charakteristischen posttranslationalen Modifikationen wie zum Beispiel das Anhängen von Zuckerketten (Glykosylierungen) nicht durchführen. Deshalb verwendete man für kompliziertere rekombinante Proteine Hefezellen, deren 1

2 Kultivierung noch relativ einfach und billig ist und die als Eukaryonten Glykosylierungen und die Bildung von Disulfidbrücken durchführen können. Ihre Proteinexpression ist allerdings schwieriger zu kontrollieren als bei Bakterien, und es stellte sich heraus, dass die Glykosylierungsmuster nicht mit dem von Säugerzellen identisch sind. Für viele der wichtigsten modernen Biopharmazeutika greift man daher auf Säugetier- Zelllinien zurück, obwohl sie schwierig und teuer zu kultivieren sind, langsam wachsen und im Vergleich zu Mikroorganismen nur geringe Ausbeuten an rekombinantem Protein liefern. Jahresumsätze von über 5 Milliarden US$, die heute für Biopharmazeutika wie Enbrel, Remicade, Rituxan, Avastin, Herceptin und Humira erzielt werden, machen die Produktion in Säugerzellen zu einem lohnenden, aber heiß umkämpften Geschäft, bei dem jeder einzelne Kostenfaktor genau geprüft wird. Die bei weitem wichtigste Säugerzelllinie für therapeutische Proteine sind die chinese hamster ovary cells" (CHO-Zellen). Unsterbliche Hamsterzellen Prof. Dr. Theodore T. Puck ( ), Vater der CHO-Zellen und Gründer des Eleanor Roosevelt Institute for Cancer Research, Denver, Colorado, kurz vor seinem Tode. University of Colorado Alle in den hunderten von Laboratorien und Produktionsanlagen der ganzen Welt heute gehaltenen CHO-Zellen stammen von einem einzigen chinesischen Zwerghamster ab, der 1957 im Labor von Theodore T. Puck an der University of Denver, Colorado, lebte und starb. Es muss ein ungewöhnliches Tier gewesen sein, denn Puck berichtete begeistert: In Kultur gehaltene Zellen aus Lunge, Niere, Milz und dem Ovar dieses Tieres haben sich ausgezeichnet vermehrt; und die aus dem Ovar konnten schon länger als zehn Monate in Kultur gehalten werden, ohne dass die Vermehrungsrate nachgelassen oder sich die Gestalt der Zellen verändert hätte (J. Exp. Med. 108, 945 ff., 1958; zitiert aus Biopharmazeutika - Hightech im Dienst des Patienten", Broschüre des vfa, 2010). Diese Eigenschaften hatten die CHO-Zellen auch noch, als Puck (der eigentlich Puckowitz hieß) 2005 mit 89 Jahren an den Folgen eines Sturzes starb. Er war hoch berühmt und geehrt nicht nur als Vater der CHO-Zellen", sondern auch für seine zahlreichen richtungsweisenden Arbeiten zur Zytogenetik und Zellkultur menschlicher Zellen, ohne die das weltweite Humangenomprojekt nicht hätte begonnen werden können. Heute werden etwa 70 Prozent der rekombinanten biopharmazeutischen Wirkstoffe für menschliche Medikamente in Zellen hergestellt, die sich von der immortalisierten Primärkultur von Ovarienzellen dieses einen Hamsterweibchens ableiten. 2

3 Optimierung aller Prozessabläufe CHO-Zellen in der Kulturschale. T.T. Puck, 1994 Natürlich ist ihre vermeintliche Unsterblichkeit nicht die einzige Eigenschaft, durch die CHO- Zellen zu bevorzugten Objekten biopharmazeutischer Wirkstoffherstellung geworden sind. Hinzu kommt, dass sie in Suspensionskulturen gehalten werden können, dass sie im Gegensatz zu Krebszellen genetisch stabil sind, dass sie reproduzierbar mit Expressionsvektoren, die das gene of interest" (GOI) enthalten, transfiziert werden können und auch während des Prozesses der Selektion, Amplifikation, Einzelzell- Klonierung und der Charakterisierung des Klons stabil bleiben. Dieser Prozess ist zeit- und arbeitsintensiv und daher sehr teuer; er kann fünf Monate in Anspruch nehmen. Die Qualität und der kommerzielle Erfolg bei der Herstellung von Glykoproteinen und monoklonalen Antikörpern hängen in hohem Maße von der Wahl des CHO- Klons und seiner Produktivität ab. Unter dem Druck des Konkurrenzkampfes suchen die Unternehmen die Bedingungen in jedem Einzelschritt dieses sogenannten Downstream Processing ständig zu optimieren. Die Einzelheiten gehören daher zu den wohl gehüteten Betriebsgeheimnissen: ob es sich um die Eigenschaften des Expressionssystems für das GOI oder die Transfektion handelt, die Zusammensetzung des Kulturmediums, die Fütterungsstrategie (beispielsweise durch Perfusion) und die Dauer der Kulturpassagen oder den ph-wert, die Temperatur oder Zellkonzentration. Sie alle beeinflussen die Lebensfähigkeit und Produktivität der Zellen. In den vergangenen zwanzig Jahren konnte die Zellzahl in der Kultur fast um das Zwanzigfache erhöht werden, so dass heute etwa 10 Millionen proteinproduzierende Zellen pro Milliliter möglich sind, und das bei einer dreifach längeren Kultivierungsdauer. Die Dauer des Prozesses bis zur Charakterisierung des stabilen Klons kann durch moderne Technologien weiter verkürzt werden. So lässt sich durch quantitative PCR eine rasche Selektion von Zellen durchführen, und die Identifizierung und Klonierung der bestgeeigneten Einzelzellen aus der amplifizierten Zellpopulation kann über bildbasierte automatisierte Analyse von Mikrotiterplatten, wie sie das Cellavista-System von Roche ermöglicht, erfolgen. Der im Bioreaktor erzielbare Titer an produziertem Protein ist ein entscheidender Kostenfaktor. 3

4 Bei der Produktion therapeutischer Antikörper werden gegenwärtig Titer von drei bis fünf Gramm pro Liter erreicht, und es wird intensiv daran gearbeitet, diesen Wert zu übertreffen. Der allgemeine Trend geht dabei heute zu kleineren Bioreaktoren und der Umstellung des Herstellungsprozesses von Edelstahlanlagen auf Einweg-Geräte aus Plastik. Sie zeichnen sich durch größere Flexibilität und niedrigere Investitionskosten aus: Einweg-Anlagen können schnell konstruiert und in Betrieb genommen werden; Sterilisierung und Reinigung verursachen nur geringe Kosten. Andererseits sind die Personalkosten höher, da bei den halbautomatischen Prozessen der Einweganlagen ein sehr sorgfältiges Training und mehr manuelle Eingriffe als bei den standardisierten vollautomatischen Edelstahlgroßanlagen erforderlich sind. Schulung hoch qualifizierter Fachkräfte Auf die Ausbildung und Qualifikation von Fachkräften, die den hohen Anforderungen der modernen Zellkulturtechnik gerecht werden können, haben sich verschiedene Unternehmen spezialisiert. Ein führender Anbieter für die Fort- und Weiterbildung auf diesem Gebiet - sei es für technisches Personal oder Laborleiter in der Pharmaindustrie oder Postdocs und Hochschullehrer in akademischen Einrichtungen - ist die PromoCell GmbH in Heidelberg. Das Unternehmen, selbst ein in Europa führender Hersteller von humanen Zellkulturen und Nährmedien für die humane Zellkultur, bietet unter dem Label PromoCell Academy" Laborkurse, praktische Schulungen und Seminare auf höchstem Niveau für die neuen Technologien im Bereich der Zellkultur, einschließlich der Zellanalyse, Durchflusszytometrie, Viabilitäts- und Proliferationstests, Mikroskopie, PCR und andere molekular- und zellbiologischen Methoden an. Außer den Trainingsprogrammen im eigenen Seminarzentrum in Heidelberg führt PromoCell Academy auf die speziellen Bedürfnisse und Zielsetzungen der Industrie abgestimmte in house"-schulungen bei den Firmenkunden durch, wo sich die Trainees die erforderlichen Kenntnisse und Techniken vor Ort im realen Umfeld und mit dem eigenen Equipment aneignen können. Fachbeitrag EJ ( ) BioRN BIOPRO Baden-Württemberg GmbH Der Fachbeitrag ist Teil folgender Dossiers Zellkulturtechnik: Mit Nervenfasern von Fröschen fing alles an 4

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