Über Lymphozytose und Lymphopenie Wertigkeit der Lymphozytentypisierung mittels Durchflusszytometrie

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1 Über Lymphozytose und Lymphopenie Wertigkeit der Lymphozytentypisierung mittels Durchflusszytometrie Prof. Dr. Winfried F. PICKL Medizinische Universität Wien Zentrum für Pathophysiologie, Infektiologie und Immunologie Institut für Immunologie Abteilung für Zelluläre Immunologie und Immunhämatologie Lymphozytose und Lymphopenie 1

2 Lymphozyten Herkunft und Rolle der Lymphozyten Durchflusszytometrie - FACS Lymphozytosen Lymphopenien Lymphozytose und Lymphopenie 2

3 Lymphozyten Herkunft und Rolle der Lymphozyten Durchflusszytometrie - FACS Lymphozytosen Lymphopenien Lymphozytose und Lymphopenie 3

4 Zellen des Immunsystems Angeborene und erworbene Immunität Innate immunity (rapid response) Adaptive immunity (slow response) Dendritic cell Mast cell Macrophage B cell γδ T cell T cell Natural killer cell Basophil Complement protein Eosinophil Granulocytes Natural killer T cell Antibodies CD4 + T cell CD8 + T cell Neutrophil Figure 1 The innate and adaptive immune response. The innate immune response functions as the first line of defence against infection. It consists of soluble factors, such as complement proteins, and diverse cellular components including granulocytes (basophils, eosinophils and neutrophils), mast cells, macrophages, dendritic cells and natural killer cells. The adaptive immune response is slower to develop, but manifests as increased antigenic specificity and memory. It consists of antibodies, B cells, and CD4 + and CD8 + T lymphocytes. Natural killer T cells and γδ T cells are cytotoxic lymphocytes Lymphozytose that straddle und Lymphopenie the interface of innate and 4 adaptive immunity. Dranoff G., Nat. Rev. Canc., 2004, 4:11

5 Kompartmentbildung im Immunsystem: Ausbildung vielgestaltiger B Zell und T Zell Rezeptoren - Anpassbarkeit des Immunsystems Zelluläre Antwort Humorale Antwort Das Immunsystem eines Erwachsenen besteht aus etwa 1 kg Leukozyten (d.h. 1 x Zellen) G.W. Litman et al. Nature 459:784; 2009 Lymphozytose und Lymphopenie 5

6 Markanter Evolutionssprung vor Millionen Jahren: Anpassung des Mund-, Hals-, Rachenraumes von Wasserlebewesen an die Luftatmung > Ausbildung knöcherne Kiefer Placodermata: Waren die ersten Wirbeltiere, die eine spezifische zelluläre Immunität entwickelten (vor ca Millionen Jahren) und Antikörper herstellen konnten, d.h. sie waren dazu imstande B und T Lymphozyten ausbilden. Placodermata waren die ersten Fisch-ähnlichen Wirbeltiere, welche Kiefer ausbilden konnten (Gnathostomata). Entwicklungsgeschichtlich gesehen waren die Placodermata den heute noch weit verbreiteten Hai-artigen sehr ähnlich. Lymphozytose und Lymphopenie 6

7 Alle Leukozyten des Körpers stammen von pluripotenten Stammzellen im Knochenmark ab Das Milieu des Knochenmarks führt in Vorläuferzellen zur Anschaltung von Genen, welche auch die Lymphozytenentwicklung einleiten Stromazellen des KM stellen dafür spezifische Adhäsionsmoleküle lösliche und membangebundene Zytokine und Chemokine bereit Die B Zell Entwicklung (B Zell Rezeptor) findet zu Gänze im Knochenmark statt Charles Janeway et al., Immunobiology, 7th Edition Garland Science 2008 Lymphozytose und Lymphopenie 7

8 Alle Leukozyten des Körpers stammen von pluripotenten Stammzellen im Knochenmark ab Unterschiedliche Reifungsorte T Lymphozyten-Vorläufer Zellen entstehen im Knochenmark reifen jedoch erst im Thymus B Lymphozyten und NK Zellen reifen im Knochenmark Charles Janeway et al., Immunobiology, 7th Edition Garland Science 2008 Lymphozytose und Lymphopenie 8

9 Typische Morphologie der Lymphozyten im peripheren Blut T Lymphozyt B Lymphozyt NK Zelle Die einzelnen lymphozytären Linien sind morphologisch nicht voneinander zu unterscheiden! Lymphozytose und Lymphopenie 9

10 Vielfarben Durchflusszytometrie (FACS) ermöglicht Erstellung eines erweiterten Differentialblutbildes Lymphozyt Linien und Subsets Die Durchflusszytometrie erlaubt eine detaillierte Bestimmung der Lymphozytären Linien und deren Subpopulationen (Subsets) Charles Janeway et al., Immunobiology, 6th Edition Garland Science 2005 Lymphozytose und Lymphopenie 10

11 Lymphozyten Herkunft und Rolle der Lymphozyten Durchflusszytometrie - FACS Lymphozytosen Lymphopenien Lymphozytose und Lymphopenie 11

12 Vielfarben Fluoreszenz mittels direkt markierter monoklonaler Antikörper Für die standardisierte Vielfarben-Fluoreszenz Durchflusszytometrie wird die direkte Immunfluoreszenz Technologie angewendet Charles Janeway et al., Immunobiology, 6th Edition Garland Science 2005 Lymphozytose und Lymphopenie 12

13 Phänotypisierung mittels hochauflösender Durchflusszytometrie 4 Laser: 17 Parameter Lymphozytose und Lymphopenie 13

14 Analyse Optionen am Durchflusszytometer: Bestimmung des Phänotyps einer bestimmten Lymphozytenpopulation Histogramm Eindimensionale Darstellung der Zellpopulation im Histogramm-Format B-Zellen CD19 + Spezifischer Fokus auf einen Parameter % positive Zellen Fluoreszenz-Intensität = Kanal-Nummer Zellzahl T-Zellen CD3 + Fluoreszenz Intensität Lymphozytose und Lymphopenie 14

15 Durchflusszytometer: Weitere Analyse Optionen Steigerung des Informationsgehaltes durch Kombination von zwei oder mehreren Parametern (Histogrammen & Gating) zu einem 2- oder mehrfach- Parameter Dot-Plots 2-Parameter Dot-Plot 12% 67% Lymphozytose und Lymphopenie 15

16 Initiale Leukozyten-Diagnostik 1. Leukozyten-Populationen 250K Eosinophils 3,53 200K Granulocytes 49,1 Granulierung SSC 150K 100K Monocytes 5,13 Basophils 139 0,96 Leukocytes ,0 50K 0 Basophils 0,96 Lymphocytes 37, CD45 Pan-Leukozyten Marker Lymphozytose und Lymphopenie 16

17 Initiale Leukozyten-Diagnostik 1. Leukozyten-Populationen 15 Oberflächen-Marker 10 Farben Granulierung SSC 250K 200K 150K 100K 50K 0 Granulocytes 49,1 Basophils 0,96 Eosinophils 3,53 Monocytes 5,13 Lymphocytes 37, CD45 Pan-Leukozyten Marker Alles in einer Färbung! (1 Röhrchen) Basophils 139 0,96 Leukocytes ,0 CD3 CD4 CD5 CD8 CD14 CD19 CD20 CD25 CD38 CD45 CD56 HLA-DR sig-k sig-l TCR-gd Lymphozytose und Lymphopenie 17

18 Lymphozyten Herkunft und Rolle der Lymphozyten Durchflusszytometrie - FACS Lymphozytosen Lymphopenien Lymphozytose und Lymphopenie 18

19 Erkrankungen des lymphatischen Systems manifestieren sich als Lymphopenie oder Lymphozytose Referenzwerte: /µl bzw x 10 9 /L Lymphopenie (ab 12a) : < bzw /µl (bis 12a): < 2.500/µl* Lymphozytose (ab 12a) > 4.000/µl (bis 12a): < /µl* Bitte immer Absolutzellzahlen bewerten, Relativzahlen sind nur beschränkt aussagekräftig! *) Kinder haben generell höhere Lymphozytenwerte, bitte entsprechende Tabellen konsultieren. Lymphozytose und Lymphopenie 19

20 Lymphozytose: Reaktiv oder Klonal? Anamnese (B-Symptomatik, Gewichts-, Größenzunahme, Knochenschmerzen) Physikalische Untersuchung (Lymphadenopathie, Hepato-, Splenomegalie) Blutbild (Anämie, Thrombozytopenie, Neutropenie) Differential-Blutbild (Morphologie der Lymphozyten) Rezente Infektionserkrankungen Lymphozytose und Lymphopenie 20

21 Typische Konstellation bei reaktiven Lymphozytosen Polyklonale Lymphozytose Entsprechende Grunderkrankung (meist Infekt) Kein Verdacht auf hämatologische Grunderkrankung Meist nach 1-2 Monaten wieder normalisiert Lymphozytose und Lymphopenie 21

22 Typische Konstellation bei klonalen Lymphozytosen Akutes oder chronisches lymphoproliferatives Geschehen Klonalität (Karyotyp, klonales Immunglobulin- od. T Zell Rezeptor Rearrangement, Leichtkettenrestriktion k oder l) Dynamik mit ansteigenden Lymphozytenzahlen (Verdopplungszeiten) Oft assoziiert mit Zytopenien (Anämie, Neutro-, Thrombopenie) B-Symptomatik (Nachtschweiß, Fieber, Gewichtsverlust) Lymphozytose und Lymphopenie 22

23 Wichtige Ursachen für reaktive Lymphozytosen: virale Infekte Adenoviren Coxsackie Viren Cytomegalie Virus Epstein Barr Virus Hepatitis Herpes Viren HTLV-1 HIV Masern Mumps Poliovirus Varizellen Lymphozytose und Lymphopenie 23

24 Ursachen reaktive CD8 + Lymphozytosen: Virale Infekte mit mononukleoseartigem Bild (1) Infektiöse Mononukleose (kissing disease, Pfeiffersches Drüsenfieber, Monozytenangina) EBV Infektion atypische Lymphozyten mit Aktivierungszeichen Gipfel 2-3 Wochen nach Krankheitsbeginn CD8 + T Zellen erhöht Daher Inverse CD4/CD8 Ratio! K Luzuriaga et al., N Engl J Med, 2010, 362: Lymphozytose und Lymphopenie 24

25 Ursachen reaktive CD8 + Lymphozytosen: Virale Infekte mit mononukleoseartigem Bild (2) CD8 + T Zellen erhöht Inverse CD4/CD8 Ratio! T Zellen aktiviert: HLA-DR positiv! CD8 CD8 CD4 HLA-DR HLA-DR CD3 Patient Gesunde Kontrollperson CD4 CD3 Lymphozytose und Lymphopenie 25

26 Ursachen reaktive CD8 + Lymphozytosen: Infekte mit mononukleoseartigem Bild (3) Mononukleose Syndrome (ähneln infektiöser Mononukleose): CMV Infekt kann Bild einer IM machen HIV-1 Primärinfektion (oft mit CMV gepaart) Selten auch HHV-6, Adenovirus Typ 12. Lymphozytose und Lymphopenie 26

27 Ursachen reaktive Lymphozytosen: andere virale und bakterielle Infekte Leukämieartige Reaktion nach Infektion mit Mumps-Virus Summary of Laboratory Data Obtained during the Course of the Illness. Varizellen, Influenza, Hepatitis, Röteln, Masern, Coxsackie Virus B, Poliovirus, Enteroviren. R Garcia R, N Engl J Med 1964, 271: Lymphozytose und Lymphopenie 27

28 Wichtige Ursachen für reaktive Lymphozytosen: bakterielle Infekte Bartonella Brucellose Pertussis Paratyphus Typhus Syphilis Tuberkulose Lymphozytose und Lymphopenie 28

29 Ursachen für reaktive Lymphozytose: Pertussis Pertussis (Keuchhusten): Infektion mit Bordetella persussis ALC /µl Lymphozyten-Kerne im Blutausstrich zum Teil deformiert, gespalten bzw. gefurcht Inzidenz 2015: 579 Fälle in Österreich, deutlicher Anstieg gegenüber Vorjahren! T Funaki et al., Lancet Infect Dis, 2015, 15:130 Lymphozytose und Lymphopenie 29

30 Ausmaß der reaktiven Lymphozytose bei Pertussis 76% > 5.000/µl 58% > 7.000/µl 28% > /µl Säuglinge < 6 Monate: ± 450 Säuglinge > 6 Monate: ± ältere Kinder: ± 840 Lymphozyten/µl * Pertussis n = Tage - Krankheitsverlauf Th Becker et al., Klin Päd, 1981, 193: Lymphozytose und Lymphopenie 30

31 Inzidenz Pertussis Österreich Pertussis Fälle/Jahr Statistik Austria Lymphozytose und Lymphopenie 31

32 Die Lymphozyten-Verteilung im menschlichen Körper: Nur 2% der Lymphozyten befinden sich in der Zirkulation Thymus Bone Marrow 50 x x 10 9 Lung 30 x 10 9 Gut 50 x 10 9 BLOOD 10 x 10 9 Lymphocytes traveling though blood = 500 x 10 9 /day Spleen 70 x 10 9 Other Tissues 40 x 10 9 Lymph Nodes 190 x 10 9 Westermann et al., Clin Invest,1992; 70:539 Lymphozytose und Lymphopenie 32

33 Pertussis-Toxin blockiert die Chemokin-Rezeptor Signalübertragung (Wanderung/Adhäsion) Pertussis-Toxin katalysiert die ADP- Ribosylierung der alpha 1 Untereinheit von heterotrimeren G-Proteinen. Dadurch wird die Signalübertragung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren blockiert. Dazu zählen viele Chemokin-Rezeptoren. CD4 + T Zellen Daher ist u.a. auch die Einwanderung der Lymphozyten in die sekundären Lymphorgane gestört > Lymphozytose. A Sodhi et al., Nat Rev Mol Cell Biol, 2004, 5: Lymphozytose und Lymphopenie 33

34 Chemokine regulieren die zellulären Autobahnen des Körpers Chemokine und Chemokinrezeptoren regulieren die organotypische Lymphozytenwanderung im Körper A Zlotnik et al., Nat Rev Immunol, 2011, 11: Lymphozytose und Lymphopenie 34

35 Washington Univer teilung etablierte schen Universität in Kenntnisse war er durchaus vertraut. Sein Hauptarbeitsg intensiv mit der Sch le fever, das dama Theobald SMITH ( ) hezu vollständig a Theobald SMITH wurde amviehzüchter 31. Juli 1859Gehör als So scher Immigranten in Albany, New York, geb heitserreger seien, 18 Jahren bekam er ein BOURNE Stipendium für die und Cooper Universität, wo er bis 1881 Philosophie studierte,nicht zweidie Jahre später Erreger ab am Albany Medical College sein Medizinstudium ab, ging dann ab SMITH gilt außerdem an die Cornell-Universität, um seine Studien bei Simon G AGE zu choleraesuis), bena Dieser vermittelte ihm dann auch eine Anstellung am neu gegründ am BAI. Gemeinsam reau of Animal Industry (BAI) in Washington DC. teteaußerdem Bakterien unte bei SMITH dort von 1886 bis 1895 an der Columbian University (heute und eröffneten dam Washington University), wo er schon bald eine gegen eigene Typhus bakteriolog und teilung etablierte die damals erste solche Abteilung annach einer Pathologie Ha schen Universität in den USA. Dank seiner guten Deutschund Fra logie ans Rockefelle Kenntnisse war er mit den Arbeiten von Robert OCH und Lou 1929Kblieb. durchaus vertraut. SMITH erhielt insges Sein Hauptarbeitsgebiet war die Tuberkulose, aber beschäftigte che er Preise und Aus intensiv mit der Schweinepest, der Histomonoseder und ebensociety, dem T Royal d le fever, das damals in manchen Regionen der USA ganze Rinderh Naturwissenschafte hezu vollständig auslöschte. Er war der Erste, phie der den überschilderu die Bede Viehzüchter Gehör schenkte und ihre Vermutung, dass Zecken dd ein Standardwerk heitserreger seien, ernst nahm. Gemeinsam mit Kollegen in seinen New York. BOURNE und Cooper CURTICE konnte er schließlich zeigen, dass die Zec nicht die Erreger aber dafür die Vektoren dieser verheerenden Seu SMITH gilt außerdem als der Entdecker von Salmonella entericako( breitet. In Europa choleraesuis), benannt nach Daniel SALMON, seinem damaligen Vorg vor allem aufdas die am BAI. Gemeinsam konnten die beiden auchsich demonstrieren, len. tete Bakterien beim Tier eine protektive Immunität hervorrufen und eröffneten damit den Weg für die Entwicklung der Schluckim Auch infür Mitteleu gegen Typhus und Cholera ging SMITH als Professor Verg Pathologie nach Harvard und 1915 als Direktor(Rhipicephalus der Abteilungallerdi für T logie ans Rockefeller-Institut in Princeton, wo gelmäßig er bis zu seiner Pensi mit Hunde 1929 blieb. schleppt). Die weitau H. Aspöck al., 30: SMITH erhielt insgesamt 12 Ehrentitel vonet führenden Universitäten ist Ixodes ricinus.gold Die che Preise und Auszeichnungen unter anderem die Copley cke ist daher der Royal Society, aufvergleic dem G Winfried F Pickldie damals wohl größte Auszeichnung Lymphozytose undseine Lymphopenie 35 Naturwissenschaften erschienene,ricinus 300 Seiten starke M kommt in nah phie über die Bedeutung von Zecken als Vektoren des Texas-Fiebe Biologiezentrum Linz/Austria; download unter Weitere Ursachen für reaktive Lymphozytenveränderungen : andere Infekte Babesiose Toxoplasmose Rindermalaria

36 51% aller Zecken in Österreich sind mit Babesia spp. infiziert 441/864 Zecken positiv mit Babesien-PCR. Sampling sites in Austria. CZ, Czech Republic; SK, Slovakia; H, Hungary; SLO, Slovenia; I, Italy; CH, Switzerland M. Blaschitz et al., Appl Env. Microbiol, 2008, 74:4841 Lymphozytose und Lymphopenie 36

37 Weitere Ursachen für reaktive Lymphozytosen Stress-induzierte Lymphozytose: Lymphozyten-Zahlen: /µl Kardiale Notfälle Schwere Traumata Status Epilepticus Wahrscheinlich Umverteilungsphänomen durch Katecholaminwirkung verursacht. Lymphozytose bei hospitalisierten PatientInnen ( auch ohne Trauma): 3 x höheres Mortalitätsrisiko A.N. Khoet al., J. Hosp. Med., 2007, 2:5 Lymphozytose und Lymphopenie 37

38 Lymphozytose als bester Vorhersagewert für Mortalität bei hospitalisierten PatientInnen Ery Stechapfelformen Kernhaltige Ery Parameter Odds Ratio Confidence Interval P Value Age (years) < Gender (male) < WBC > 12, < Hematocrit (> 54) < Hematocrit (< 37) < MCV (> 94) < High RDW (>14.5) < Lymphocytosis (>4000) < Metamyeloctye (y/n) < Macrocytes (y/n) < Toxic Granules (y/n) Sickle Cells (y/n) Burr Cells (y/n) < Band Forms (y/n) < NRBCs (y/n) < Häufigkeit 8.5 % 0.7 % 1.3 % A.N. Khoet al., J. Hosp. Med., 2007, 2:5 Lymphozytose und Lymphopenie 38

39 Lymphozytose als bester Vorhersagewert für Mortalität bei hospitalisierten PatientInnen: Rolle von Epinephrin Cortisol Epinephrine S Dimitrov al., Blood, 2009, 113:5134 opsis. Numbers of circulating T cell subpopulation Lymphozytose und Lymphopenie 39

40 Post-Splenektomie Lymphocytosis Lymphozyten: /µl Persistent für > 50 Monate Vor allem NK-Zellen betroffen J Garcia-Suarez et al., Br J Hematol, 1995, 89:653 Lymphozytose und Lymphopenie 40

41 Persistente polyklonale B Zell Lymphozytose Alter: 40a ( ) Frauen 83% Raucherinnen: 90% Lymphozyten-Zellzahlen: 6.600/µl ( ) B-Lymphozytose mit zweigelappten Kernen: 3.9% (1-40) CD5 negativ, CD23 negativ Hyper IgM Phänotyp: 780 mg/dl ( ) Splenomegalie/Lymphadenopathie: 9-18% HLA-DR7 assoziiert: 77% Isochromosom: i(3)(q10) und bcl-2/ig Rearrangements E Cornet et al., BMC Res Notes, 2016, 9:138 Lymphozytose und Lymphopenie 41

42 Persistente polyklonale B Zell Lymphozytose (PPBL) JF Lesesve et al., Blood, 2011, 118:6485 Lymphozytose und Lymphopenie 42

43 Persistente polyklonale B Zell Lymphozytose (PPBL) Lymphozytose und Lymphopenie 43

44 Lymphozytose beim älteren Patienten klonal? Bei Verdacht auf Vorliegen einer klonalen, malignen Lymphozytose sind Lebensalter und Lymphozytenzahl die besten Prädiktoren: Lebensalter 50-67a: ALC > 6.700/µl bzw. Lebensalter > 67a: ALC > 4.000/µl sind mit hoher Wahrscheinlichkeit mit einem abnormalen Immunphänotyp assoziiert. Von untersuchten Patienten > 50a: 1.3 % ALC > 4.000/µl 59 % davon mit abnormalem Immunphänotyp (B-NHL, etc.) JM Andrews et al., Leuk Lymphoma, 2008, 48: Lymphozytose und Lymphopenie 44

45 Maligne Lymphozytosen im Alter: Chronische Lymphatische Leukämie Lymphozytose: > B Zellen/µl (Werte von /µl nicht unüblich) Progressive Akkumulation funktionell inkompetenter Lymphozyten Phänotyp: CD19 +, CD5 +, CD23 +, und Leichtkettenrestriktion Hypogammaglobulinämie: 8% bei Erstdiagnose und in 66% der Fälle während des weiteren Verlaufes der Erkrankung Chronisch lymphoproliferative Erkrankung ist äufigste Leukämie Inzidenz: 5/ (d.h. 400 neue Fälle pro Jahr in Österreich) Mittleres Alter bei Diagnose: 70 Jahre Lymphozytose und Lymphopenie 45

46 10 Diagnose der Chronischen Lymphatische 2 10 Leukämie Comp-V500-A :: CD45 (CLL) mittels Durchflusszytometrie 250K 200K Granulocytes 36,6 Eosinophils 1,40 Comp-PE-Cy7-A :: CD19+TCRgd Basophils 1,31 Lymphocytes 51,3 CD5+ B cells 52,9 CD5+ 150K Comp-PerCP-Cy5-5-A :: CD5 100K 50K 0 Basophils 1,31 Monocytes 4,80 Lymphocytes 51, Comp-FITC-A :: CD8+IgL Name Count CD19+ B cells 2962 Lymphocytes+ab T cells-gd T cells Lambda+ B cells 3,58 Kappa+ B cells 95,0 Name Count Lambda+ B cells 106 Kappa+ B cells 2813 CD19+ B cells 2962 Leichtkettenrestriktion Comp-V500-A :: CD Comp-PE-A :: CD56+IgK 10 5 Lymphozytose und Lymphopenie 46 Name Count

47 T Zell large granular lymphocytic (LGL) Leukemia (T-gamma Lymphozytose Syndrom, T Zell Lymphozytose mit Neutropenie, Granulierte T Zell Lymphozytose mit Neutropenie) LGL vermehrt > 2.000/µl Zwei unterschiedliche Phänotypen möglich: CD3 +, TCRab +, CD5 schwach, CD8 + (CD4 + selten), CD16 +, CD27 -, CD28 -,CD45R0 -, CD45RA +, CD57 + ; (Phänotypen mit CD56 + Expression sind aggressiver) CD2 +, CD3 -, TCRab -, CD4 -, CD8 +, CD16 +, CD56 +, beide sind CD95/CD95L (CD178) stark positiv Assoziation mit Neutropenie & Autoimmunerkrankungen: RA, Felty Syndrom, Hashimoto, AI polyglanduläres Syndrom, SLE Laborbefunde: ANA, RF, Hyper- oder Hypogammaglobulinämie, Anti- Thrombo Ak, ANCA, MGUS, zirkulierende Immunkomplexe Benigne LGL Vermehrung: HIV, Splenektomie, ahsct, Organ-TX; MG Rose et al, Oncologist, 2004, 9: Lymphozytose und Lymphopenie 47

48 T Zell large granular lymphocytic (LGL) Leukemia (T-gamma Lymphozytose Syndrom, T Zell Lymphozytose mit Neutropenie, Granulierte T Zell Lymphozytose mit Neutropenie) CD4/CD8-Ratio: 0.37 T Lamy et al., Blood, 2017, 129: Lymphozytose und Lymphopenie 48

49 Lymphozyten Herkunft und Rolle der Lymphozyten Durchflusszytometrie - FACS Lymphozytosen Lymphopenien Lymphozytose und Lymphopenie 49

50 Lymphopenie Referenzwerte: x 10 9 /L or /µl Kinder: > 2.8 x 10 9 /L < 3 Monate Primär oder Sekundär? 95% der Lymphozytenwerte von gesunden Individuen liegen innerhalb des Referenzintervalls Ältere Patienten mit diskreter Lymphopenie (500>1500/µl) und Fehlen von Symptomen: keine weiteren Untersuchungen nötig Lymphozytose und Lymphopenie 50

51 Primäre (angeborene) Lymphopenien Sehr selten: rare-diseases Prävalenz <1: Schwere, rekurrente Infektionen & Gedeihstörungen & positive Familienanamnese Der häufigste autosomal dominant vererbte schwere Immundefekt (SCID): Adenosine deaminase (ADA) deficiency Der häufigste X-chromosomal vererbte SCID : common gamma chain deficiency AK Abbas (ed) Cellular and Molecular Immunology, 7th Edition, Elsevier Saunders, 2012 Lymphozytose und Lymphopenie 51

52 Fehlende HLA Klasse II Expression auf B Zellen und Monozyten KG Schmetterer et al., Int Arch Allergy Immunol, 2010, 152:390 Lymphozytose und Lymphopenie 52

53 Niedrig normale bzw schwere CD4+ T Zell Lymphopenie bei HLA Klasse II Defekt KG Schmetterer et al., Int Arch Allergy Immunol, 2010, 152:390 Lymphozytose und Lymphopenie 53

54 Komplettes Fehlen von B Zellen bei Morbus Bruton [X-linked agammaglobulinemia] M. Bruton Patient #1 M. Bruton Patient #2 Gesunde Kontrollperson Lymphozytose und Lymphopenie 54

55 Defekte Expression der BTK (B Zell Tyrosin Kinase) in Leukozyten von M. Bruton Patienten M. Bruton Patient Gesunde Kontrolle BTK 75 kd Actin 50 kd 37 kd AK Abbas et al. Cellular and Molecular Immunology 4t h Edition, WB Sounders 2000 AK Abbas (ed) Cellular and Molecular Immunology, 7th Edition, Elsevier Saunders, 2012 Lymphozytose und Lymphopenie 55

56 Nicht alle (kompletten) B Lymphopenien werden durch einen PID verursacht Gesunde Kontrolle XLA, M. Bruton S.p. anti-cd20 Therapie Non-Hodgkin Lymphom CD19 CD3 Cave #1: Anamnese! Anamnese! Anamnese! Cave #2: Relative Zellzahlen stellen immer nur eine Annäherung dar Für die Diagnosestellung sind Absolutwerte unabdingbar Lymphozytose und Lymphopenie 56

57 Sekundäre (erworbene) Lymphopenien Produktionsstörung Vermehrte Lymphozyten-Destruktion Lymphozyten-Verteilungsstörung Lymphozytose und Lymphopenie 57

58 Sekundäre (erworbene) Lymphopenie Rezente virale, bakterielle oder andere Infektionen? Pneumozystis, multiple Warzen, schwere rekurrente Infekte? Medikamente? Systemische Erkrankung (Autoimmunerkrankungen, Lymphom, Sarkoidose, Nieren- Herzinsuffizienz)? B-Symptomatik, welche ein Lymphom vermuten ließe Fehlernährung Alkoholabusus? Andere abnormale Zeichen bei physikalischer Untersuchung (Lymphadenopathie, Splenomegalie, Gelenksbeschwerden, Hautausschläge)? D Brass et al., Brit Med J, 2014, 348:g1721 Lymphozytose und Lymphopenie 58

59 Beispiel für HIV induzierte CD4 + T Lymphopenie Healthy donor HIV infected individual 1 Idiopathische - essentielle CD4 Lymphopenie 53 0 CD CD4 Cave: Relative Zell-Zahlen stellen nur eine Annäherung dar! Immer Absolutzellzahlen bewerten Lymphozytose und Lymphopenie 59

60 SLE (Lupus): Die Höhe der Autoantiköper-Titer korreliert mit Ausmaß der Lymphopenie M Noguchi et al., Ann Rheum Dis, 1992, 51: Lymphozytose und Lymphopenie 60

61 Lymphopenie ist der wichtigste, unabhängige Risikofaktor für schwere Infekte bei SLE J Merayo-Chalico et al., Q J Med, 2013, 106: Lymphozytose und Lymphopenie 61

62 Ursachen für sekundäre Lymphopenien in einem Kollektiv von > hospitalisierten Patienten Diagnose Frequenz Bakterielle/Pilz-Sepsis 24 % Post-Operativ 22 % Malignome 17 % Kortikosteroide 15 % Castelino et al., Aust NZ J Med 1997, 27:170 Lymphozytose und Lymphopenie 62

63 Lymphopenie durch Behandlung mit mehr oder weniger spezifischen Medikamenten Glukokortikoide: induzieren T Zell Tod (nur Hochdosistherapie) hemmen pro-inflammatorische Wachstumsfaktoren beeinflussen die T Zellmorphologie und wanderung verändern die Umverteilung von T Zellen (homing) Lymphozytose und Lymphopenie 63

64 Kortikoide: Umverteilung von T Lymphozyten findet innerhalb von wenigen Stunden statt Peripheres Blut normal 47.1±11.7% Prednison-behandelt E Bloemena et al., Clin Exp Immunol, 1990, 80: Lymphozytose und Lymphopenie 64

65 Kortikoide: Umverteilung von T Lymphozyten vor allem in das Knochenmark wegen verstärkter CXCR4 Expression Peripheres Blut Knochenmark A.S. Fauci, Immunology, 1975, 28: L Besedovsky et al., Am J Physiol Endocrinol Metab, 2014, 306:E1322-E1229 Lymphozytose und Lymphopenie 65

66 Kortisol induziert CXCR4 auf T Lymphozyten, reagiert mit CXCL12 positiven KM-Stromazellen L Besedovsky et al., Am J Physiol Endocrinol Metab, 2014, 306:E1322-E1229 Lymphozytose und Lymphopenie 66

67 Alemtuzumab Lemtrada ein hoch-potentes MS- Therapeutikum Wirkstoff: humanisierter, monoklonaler anti-cd52 Antikörper Wirkmechanismus: CD52 ist auf allen Leukozyten, vor allem auf B- und T-Lymphozyten exprimiert: Depletion der B- und T-Lymphozyten (MabCampath für CLL Behandlung, wurde 2012 vom Markt genommen). Repopulation erst nach 3-6 Monaten, CD4 + und CD8 + T Lymphozyten bleiben länger vermindert. Nach 5a 90% bzw. 88% normale CD4 + bzw. CD8 + Werte. Die Repopulation soll die pathognomonischen T Lymphozyten ersetzen. Einsatz: für hochaktive MS, seit 2014 von FDA zugelassen, Schubratenreduktion im Vergleich zu IFN-b1a um 50%; 23-42% geringere Gehirnatrophie, T2-Läsionen um 34% reduziert. Sicherheitsprofil: Infusionsreaktionen (90%), erhöhte Infektionsrate, bisher keine PML bei Alemtuzumab und MS (nur bei CLL, hier jedoch Effekt der Grunderkrankung). Mukokutane Herpesinfekte, Papylomavirus Exazerbationen (HPV-screening), jahrelang erhöhtes Risiko für Autoimmunerkrankungen (Hypothyreose, ITP, GN). Blut- und Harnuntersuchungen monatlich, 3-monatlich Serumkreatinin, TSH, Leberwerte). Dosis: 5x12 mg, Tage 1-5 im 1. Jahr; 3 x 12 mg, Tage 1-3 im 2. Jahr. Lymphozytose und Lymphopenie 67

68 Alemtuzumab Lemtrada: Reaktivität mit Leukozyten des peripheren Blutes Granulocytes Side Scatter CD52 Fluorescence Intensity Lymphozytose und Lymphopenie 68

69 Alemtuzumab Lemtrada: Die CD52-Reaktivität mit Lymphozyten bestimmt den Grad der Depletion Depletion Y Hue et al., Br J Immunol, 2009, 128:260

70 Alemtuzumab Lemtrada: Behandlung führt zu einer massiven Langzeit-Depletion von CD4 + und CD8 + T Zellen CD4 + T Lymphozyten CD8 + T Lymphozyten J Lundin et al., Leukemia, 2004, 18:484 Lymphozytose und Lymphopenie 70

71 Alemtuzumab Lemtrada: Behandlung führt zu einer Langzeit-Depletion von CD19 + B Zellen CD4 + T Lymphozyten CD19 + B Lymphozyten J Lundin et al., Leukemia, 2004, 18:484 Lymphozytose und Lymphopenie 71

72 Herzlichen Dank für Ihre Aufmerksamkeit! Prof. Dr. Winfried F. PICKL Medizinische Universität Wien Zentrum für Pathophysiologie, Infektiologie und Immunologie Institut für Immunologie Abteilung für Zelluläre Immunologie und Immunhämatologie Lymphozytose und Lymphopenie 72

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