Instrumentelle Methoden Teil I: Gelelektrophorese

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1 Instrumentelle Methoden Teil I: Gelelektrophorese

2 Gliederung Theoretische Grundlagen Gelmedien Nachweis/Färbemethoden Instrumentierung Elektrophoretische Grundlagen und Durchführung Präparative Methoden Hochauflösende zweidimensionale Elektrophorese

3 Definition Unter Elektrophorese versteht man die Wanderung von Teilchen im elektrischen Feld. Eigenschaften der Teilchen (Ladung, Größe) bewirken eine unterschiedliche elektrophoretische Beweglichkeit. Die verschiedenen Teilchen werden getrennt und sammeln sich dabei in einzelnen Zonen.

4 Theoretische Grundlagen In einem elektrischen Feld wirken unterschiedliche Kräfte auf ein geladenes Teilchen: Beschleunigende Kraft: Fe = q E mit q = z e Reibungskraft: F tr = f c v q: Ladung E: elektrische Feldstärke fc: Reibungskoeffizient v: Wanderungsgeschwindigkeit Stehen die Kräfte im Gleichgewicht, bewegen sich Teilchen mit einer konstanten Geschwindigkeit im elektrischen Feld.

5 Theoretische Grundlagen F e = F fr q E = f c v q E v = = u E f c Der Faktor u ist ein Proportionalitätsfaktor zwischen Wanderungsgeschwindigkeit und Feldstärke. Er wird als Mobilität bezeichnet und ist substanzspezifisch.

6 Theoretische Grundlagen Effekte auf das Teilchen im elektrischen Feld F e : Beschleunigungskraft F RET : Retardationskraft F REL : Relaxationskraft F r : Reibungskraft Auf Grund beider Effekte nimmt die Mobilität bei zunehmender Ionenstärke ab.

7 Theoretische Grundlagen Retardationseffekt Nach der Debye-Hückel Theorie ist um das Zentralion eine Ionenatmosphäre entgegengesetzter Ladung aufgebaut. Sie bewirkt, das das Teilchen durch eine Lösung wandert, die entgegengesetzt fließt. Retardationseffekt Relaxationseffekt Durch Anlegen eines elektrischen Feldes wird die Ionenwolke hinter dem Zentralion her gezogen, das Ion wird abgebremst. Relaxation

8 Theoretische Grundlagen Bei schwachen Basen und Säuren ist nicht die Mobilität des vollständig dissozierten Teilchens wichtig, sondern die effektive Mobilität ueff. Sie wird über den Dissoziationsgrad α mit der Ionenmobilität verknüpft: α: Dissoziationsgrad ueff = α Die Wanderungsgeschwindigkeit kann bei schwachen Säuren und Basen über ph-werteinstellungen optimiert werden. ui

9 Theoretische Grundlagen Puffersysteme Bei Durchführung einer Elektrophorese wandern nicht nur die Probenionen, sondern auch die dissozierten Pufferionen. An beiden Elektroden müssen daher Pufferreservoirs mit ausreichend Puffer vorhanden sein. Verwendet werden Säure/ Base- Systeme (z.b. Tris- Chlorid, Tris-Borid)

10 Theoretische Grundlagen Wärmeabfuhr Durch den Einsatz von Strom wird bei einer Elektrophorese Joul sche Wärme entwickelt. Pro Volumeneinheit entwickelte Wärme W gilt: W = E² λ c c = molare Konzentration des Elektrolyten λ = Äquivalenzleitfähigkeit F = Faraday- Konstante E = elektrische Feldstärke ui = Mobilität zi = Anzahl Für λ gilt: λ = u i z i F

11 Theoretische Grundlagen Die Wärmeabfuhr erfolgt über die Wände oder eine Seite des Systems Ein Temperaturgradient entsteht Bei trägerfreier Elektrophorese kommt es zur Durchmischung Bei einer Kapillar- oder Gelelektrophorese sollten geringe Innendurchmesser bzw. dünne Schichten verwendet werden, damit die Temperaturdifferenz gering gehalten werden kann. Die Materialien sollten eine gute Wärmeleitfähigkeit haben.

12 Elektrochemische Doppelschicht Auf der Oberfläche vieler Materialien ( Glas, Teflon, Papier, Agarose) bildet sich bei Kontakt mit Elektrolytlösungen eine elektrochemische Doppelschicht. Grund : Oberflächenladungen Erläuterungen am Beispiel einer fused Silica Kapillare

13 Theoretische Grundlagen Aufbau und Potentialverlauf der elektrochemischen Doppelschicht Bei der Dissoziation von Silanolgruppen werden negative Ladungen an der Wand ausgebildet. Diese werden durch positive Gegenladungen aus der Lösung kompensiert. Die Abbildung zeigt einen Potentialabfall. In der starren Schicht an der Wandung ist der Abfall linear. X=Abstand von der Kapillarwand In diffusen Schicht in der Lösung liegt ein exponentieller Abfall vor

14 Elektroosmotischer Fluß (EOF) Durch die Doppelschicht bedingt wird bei Anlegen einer elektrischen Spannung das Lösungsmittel in einen Fluß (EOF) in Richtung der Kathode gebracht. Eine Strömung in der flüssigen Phase tritt auf. Grund: positive Gegenladungen der Doppelschicht. Geschwindigkeit des EOF: abhängig vom ζ-potential veof Theoretische Grundlagen ε ζ E = 4 η ε: Dielektrizitätskonstante ζ: Zeta-Potential E: elektrische Feldstärke η: Viskosität In der Gelelektrophorese tritt die Elektroendosmose auf. Folgen: da der EOF der Richtung der Probenionen entgegengesetzt ist, sind Verzerrungen und Verdünnungen der Zonen die Folge.

15 Theoretische Grundlagen Elektroendosmose: Aufgrund fixierter Ladungen an der Matrixoberfläche entsteht im elektrischen Feld ein der Elektrophoreserichtung entgegengesetzter osmotischer Fluß.

16 Gelmedien Agarose Einfache Handhabung Ungiftig Werden eingesetzt zur Trennung hochmolekularer Proteine über 500 kda Niedrige Siebwirkung für kleine Proteine Gele sind nicht klar Sind nicht Elektroendosmose frei

17 Gelmedien Polyacrylamid Vernetzungsmuster des Polyacrylamids (PA)

18 Gelmedien PA ist chemisch inert und stabil (Gele reißen nicht so leicht) Geringe Elektroendosmose Klare Gele auf Grund Vernetzer N,N -Methylenbisacrylamid Porengröße der Gele ist von der Konzentration und dem Vernetzungsgrad abhängig Eignen sich für viele Färbemethoden

19 Gelmedien Nachteile: Monomer ist toxisch Proteine über 800 kda können nicht getrennt werden

20 Nachweis/Färbemethoden Qualitativer Nachweis: Färbung oder radioaktive Markierung Quantitativer Nachweis: Densitometrie (Lichtabsorption)

21 Nachweis/Färbemethoden Coomassie-Brilliant Blue Einfachste Methode, kurze Färbemethode Proteine werden blau angefärbt Empfindlichkeit: 100 ng 1 µg pro Bande Silberfärbung Silberionen werden von Proteinen gebunden und durch Reduktion in Silber umgewandelt. Mechanismus ähnlich dem der Fotografie Empfindliche Methode, längere Färbezeiten Empfindlichkeit: ng-bereich pro Bande

22 Nachweis/Färbemethoden Coomassie Die Banden in den Taschen/Spuren 1-3 sind Markerproteine.

23 Nachweis/Färbemethoden Agarosegel Dargestellt sind PCR-Produkte. Links befindet sich ein Standard. Die Färbung erfolgte mit Ethidiumbromid und wird unter UV-Licht (254 nm) fotographiert.

24 Instrumentierung Grundsätzlich finden horizontale und vertikale Systeme Verwendung. Vertikale Systeme: Die Gele sind in Kassetten oder auf Trägermaterial (Glasplatten, Polycarbonatplatten) befestigt und von flüssigem Puffer umgeben. Die Proben werden in Taschen am oberen Ende der Gele aufgegeben. Die Proben laufen von oben nach unten. Die schweren und großen Proteine befinden sich im oberen Teil des Gels. Die Wärmeabfuhr wird durch Kühlung mittels der Puffer geregelt.

25 Instrumentierung Vertikale Elektrophoreseapparatur

26 Instrumentierung Horizontale Systeme: Die Gele können auf einem Trägermaterial aufgetragen sein. Die Versorgung mit Pufferionen erfolgt entweder durch Filterpapierstreifen, die in Flüssigpuffertanks hängen oder durch getränkte Filterpapierstreifen. Moderne Systeme verwenden Gelstreifen die mit den Pufferionen versetzt sind. Das Verfahren ist als semidry anzusehen. Die Probe kann über einen aufliegenden Filterstreifen aufgebracht werden oder sie werden in eingegossene Taschen pipettiert. Die entstehende Wärme muss abgeführt werden, daher haben solche Systeme eine Wasserkühlung. Die Elektrophorese wird mit Spannungen von 200V durchgeführt werden.

27 Instrumentierung Horizontales Elektrophorese Systeme B: statt Filterpapierstreifen werden auch Gelstreifen mit Puffer verwendet

28 Grundprinzipien und Durchführung Zonenelektrophorese: Trennprinzip beruht auf unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten der geladenen Teilchen im Feld. Grundlage jeder Elektrophorese Isotachophorese: Die geladenen Teilchen wandern alle mit der gleichen Geschwindigkeit im diskontinuierlichen System. Isoelektrische Focussierung: Trennung der Teilchen nach dem isoelektrischen Punkt innerhalb eines ph- Gradienten

29 Grundprinzipien und Durchführung

30 Grundprinzipien und Durchführung Zonenelektrophorese Grundprinzip der Elektrophorese Trennung eines Proteingemisches in Zonen Das Trennprinzip beruht auf den unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten ( Mobilität) Beeinflussung der Ladung durch Temperatur und ph- Wert des Puffers Unveränderlicher ph-wert des Gels Bestimmung nach Molekulargewicht, Molekülgröße oder isoelektrischer Punkt

31 Grundprinzipien und Durchführung Probenauftrag der gemischten Proteine Auftrennung in Zonen

32 Grundprinzipien und Durchführung Porengradientengele Dienen zur Ermittlung von Molekülgrößen eines Proteins. Durch eine kontinuierliche Veränderung der Vernetzung eines Gels erhält man einen Gradienten. Die Proteine bleiben in der enger werdenden Poren des Gels je nach Größe stecken.

33 Grundprinzipien und Durchführung Herstellung eines linearen Porengradientengels Zwei Polymerisationslösungen mit unterschiedlicher Monomerkonzentration werden mit Hilfe eines Gradientenmischers vermischt. Dabei wird der höherkonzentrierten Lösung die niederkonzentrierte Lösung zugemischt. Um ein Vermischen in der Gelkassette zu verhindern wird die konzentrierte Lösung Glycerin überschichtet.

34 Grundprinzipien und Durchführung Disk-Elektrophorese Disk steht für diskontinuierlich Gelmatrix ist in zwei Bereiche geteilt: weitporiges Sammelgel und engporiges Trenngel Vorteil : die Aggregation der Proteine wird verhindert, man erhält schärfere Banden Kombination zweier Puffersysteme: Tris-Chlorid/ Tris-Glycin-System

35 Grundprinzipien und Durchführung Sammelgel ph 6,8 und Trenngel ph 8,8 Glycin hat auf Grund des ph-wertes eine niedrige elektrophoretische Mobilität und fungiert als Folge-Ion, Chlorid hat eine hohe Mobilität und dient als Leit-Ion. Die Mobilitäten der aufzutrennenden Proteine liegen zwischen denen der Leit- und Folge- Ionen.

36 Grundprinzipien und Durchführung Prinzip der diskontinuierlichen Elektrophorese Nach Anlegen des elektrischen Feldes setzt die Isotachophorese ein: alle Ionen wandern mit der gleichen Geschwindigkeit und bilden einen Proteinstapel in Reihenfolge ihrer Mobilitäten.

37 Grundprinzipien und Durchführung Proteinstapel wandert langsam in Richtung Anode. Bei dem Übergang in das engporige Trenngel bildet sich eine Art Stau. Proteine erfahren einen Reibungswiderstand. Der Stapel löst sich im homogenen Puffer auf. Die einzelnen Komponenten trennen sich nun nach dem Zonenprinzip auf. Die Proteinenfolge ändert sich, da im Trenngel die Molekülgröße einen großen Einfluß auf die Mobilität hat.

38 Grundprinzipien und Durchführung Saure Nativelektrophorese Methode zur Trennung von basischen Proteinen (z.b. Getreideproteine) Saures Puffersystem (z.b. HEPES Puffer ph 5,5) Proteine sind positiv geladen und wandern zur Kathode

39 Grundprinzipien und Durchführung SDS-PAGE SDS steht für Sodium dodecyl sulfate Anionisches Detergenz Überdeckt die Eigenladungen der Proteine Entstehung von Micellen mit konstanter negativer Ladung pro Masseneinheit 1,4 g SDS pro g Aminosäure PAGE steht für Polyacrylamidgel-Elektrophorese Standardmäßig wird eine diskontnuierliche Elektrophorese mit SDS-haltigen Tris-HCL/ Tris-Glycin Puffern nach Laemmli durchgeführt.

40 Grundprinzipien und Durchführung Probenvorbereitung Proben werden mit einem Puffer versetzt, der die nötige Menge SDS im Überschuß enthält Zusätzlich wird Mercaptoethanol frisch dazu gegeben Aufspaltung von Schwefelbrücken zwischen Cysteinen Die Proben werden für 5 min auf 95 C erhitzt es erfolgt eine Streckung des Moleküls, Sekundär- und Tertiärstrukturen werden aufgebrochen Proben werden nach Erhitzen abzentrifugiert und können auf das Gel pipettiert werden.

41 Grundprinzipien und Durchführung Vorteile der SDS-PAGE Proteinaggregation wird verhindert Schnelle Trennungen, da die Micellen hohe Ladungen tragen Trennung erfolgt nur nach einem Parameter (Molekulargewicht) Es gehen auch sehr hydrophobe und denaturierte Proteine in Lösung Nachteile der SDS-PAGE Denaturierung ist irreversibel SDS ist nicht kompatibel mit nicht-ionischen Detergenzien

42 Grundprinzipien und Durchführung SDS-PAGE Spur 3 enthält ein Markergemisch Rechts Angabe der Molmassen der Markerproteine in kda

43 Grundprinzipien und Durchführung silbergefärbtes SDS-Gel 1 2 In den Spuren 1 und 2 sind Markerproteine

44 Grundprinzipien und Durchführung Isoelektrische Fokussierung (IEF) Protein wandert im elektrischen Feld durch einen ph- Gradienten An dem Punkt, an dem die Nettoladung gleich Null ist befindet sich sein isoelektrischer Punkt Nettoladung eines Protein = Summe aller negativen und positiven Ladungen an den Aminosäuregruppen IEF ist im Gegensatz zu den anderen elektrophoretischen Methoden eine Endpunktmethode die Proteine können nicht mehr weiter wandern

45 Grundprinzipien und Durchführung A: Nettoladungskurven zweier Proteine A und B B: Fokussierung der Probenproteine A und B im Feld

46 Grundprinzipien und Durchführung Bestimmt man die Nettoladungen der Proteine bei unterschiedlichen ph-werten erhält man eine charakteristische Kurve. Der Schnittpunkt der Kurve mit der x-achse gibt den isoelektrischen Punkt des Proteins an. Als Trennmedien dienen auch hier Agarosegele und PA- Gele. In den Gelen muß der Gradient stabil sein und eine gleichmäßige Leitfähigkeit vorweisen Zwei Konzepte finden Verwendung: ph-gradienten aus freien Trägerampholyten und immobilisierte ph-gradienten

47 Grundprinzipien und Durchführung Trägerampholyte Ideale Trägerampholyte weisen folgende Eigenschaften aus: Hohe Pufferkapazität und Löslichkeit am pi Gleichmäßige Leitfähigkeit Frei von biologischen Effekten Niedriges Molekulargewicht Trägerampholyte bestehen aus mehreren hundert unterschiedlichen aliphatischen Oligoamino- Oligocarbonsäuren mit unterschiedlichen pi-werten.

48 Grundprinzipien und Durchführung Konzentrationen der Ampholyte muß gleich im Gel sein, sonst treten Lücken im ph Spektrum auf. 2% Ampholyte im Gel Nach anlegen des elektrischen Feldes richten sich die geladenen Teilchen aus und bilden den Gradienten Die Trägerampholyte mit dem niedrigsten pi wandern bis an das anodische Ende des Gels, die Ampholyte mit dem höchsten pi wandern an das kathodische Ende. Der Gradient kann nach langer Focussionszeit anfangen zu driften (Kathodendrift). Banden werden unscharf, basische Proteine gehen verloren. Vorteil: Trägerampholyte wirken als Zwitterionen und halten Proteine in Lösung

49 Grundprinzipien und Durchführung Immobilisierte ph-gradienten (IPG) IPG sind in die Gelmatrix einpolymerisiert Eingesetzt werden dazu bifunktionelle Immobiline H2C=CH-C=O ( NHR) Immobiline sind Acrylamidderivate und somit schwache Säuren oder schwache Basen. Definition der Immobiline erfolgt über ihre pk-werte Man benötigt zwei unterschiedliche Immobiline. Der zu puffernde ph-wert ergibt sich aus dem Mischungsverhältnis.

50 Grundprinzipien und Durchführung Immobilisierte puffernde Gruppen in einem Polyacrylamidnetzwerk.

51 Grundprinzipien und Durchführung Herstellung immobilisierter ph-gradienten Mischen von unterschiedlichen Polymerisationslösungen mit Gradientenmischer Lösungen enthalten Acrylamidmonomere zur Polymerisation einer Matrix auf einer Trägerfolie. Die Immobiline werden kovalent an das Polyacrylnetzwerk gebunden. Nach der Polymerisation müssen die Katalysatoren mit Wasser aus der Matrix entfernt werden. Gel wird getrocknet und kann bei -20 o C gelagert werden. Vor Gebrauch wird das Gel in Additiva (Harnstoff, Dithiothreitol, Detergenzien) wieder gequollen.

52 Grundprinzipien und Durchführung Vorteile: Endpunktmethode mit hoher Auflösung IP läßt sich dirket ablesen Kombination mit SDS-Elektrophorese 2D-Elektrophorese Nachteile: Aufwendigere Färbtechniken als bei der Zonenelektrophorese Aufwendiges Herstellungsverfahren Aggregierende Proteine (Membranproteine) können nicht in das Gel einwandern Lange Trennzeiten

53 Grundprinzipien und Durchführung A: IEF im Bereich ph 4,35-4,55 B: IEF im Bereich ph 4-10 Isoelektrische Fokussierung:

54 Titrationkurvenanalyse Bestimmung von Nettoladungskurven von Proteinen Durchführung: IEF ohne Probe wird auf einem Trägerampholytgel durchgeführt Bildung des ph-gradienten Gel wird um 90 gedreht Probe wird in eine Gelrinne pipettiert Nach Anlegen eines elektrischen Feldes wandern die Proteine in Abhängigkeit ihres ph-wertes mit unterschiedlichen Mobilitäten. Bildung von Titrationskurven mit Schnittpunkt des pi des Proteins an der Gelrinne

55 Grundprinzipien und Durchführung A: Probenaufgabe auf ein vorfokussiertes Gel B: Nettoladungskurven nach Anlegen des elektrischen Feldes

56 Präparative elektrophoretische Verfahren Elektroelution aus Gelen Präparative Zonenelektrophorese Präparative isoelektrische Focussierung

57 Präparative elektrophoretische Verfahren Elektroelution aus Gelen Dient zur Gewinnung von Proteinen aus PA-Gelen zur weiteren Analyse Methode A: Protein aus einem ausgeschnittenen Gelstückchen wird in einer Vertikalelektrophorsekammer in eine Dialysemembran transportiert. Methode B: Das Protein wird mittels Puffer ohne Dialysemembran in einer Miniapparatur in ein Reaktiongefäß hineineluiert.

58 Präparative elektrophoretische Verfahren Elektroelution aus Gelen

59 Präparative Zonenelektrophorese Reinigungsmethode für mg-mengen Protein Elektrophorese und Trennung in einzelne Zonen wird mit Polyacrylamidgelen in einem Glasrohr durchgeführt. Ankommende Zonen werden durch kontnuierlichen Pufferstrom abgeführt.

60 Präparative IEF Aufreinigungsmethode für größere Mengen Protein Kein Gel mit immobilisierten ph-gradienten Mehrkammer-Focussierungsapparatur mit gepufferten isoelektrischen Polyacrylamidmembranen Zur Probenauftrennung gibt man ein Proteingemisch in eine Kammer Die Proteine wandern nach Anlegen eines Feldes in die benachbarten Kammern gemäß ihren isoelektrischen Werten Das aufgereinigte Protein kann der Kammer entnommen werden

61 Präparative IEF

62 2D Gelelektrophorese Sehr großes Auflösungsvermögen Auftrennung der Proteine erfolgt nach zwei Kriterien: isoelektrischer Punkt und Molmasse Proteine mit gleicher Molmasse oder gleichem pi-wert können durch die zweite Dimension aufgetrennt werden. Trenntechnik zur qualitativen und quantitativen Untersuchung der Proteinexpression von Zellen, Geweben und Organismen (Proteomics) mikropräparative Reinigung von Proteinen aus komplexen Proteingemischen für deren nachfolgende Charakterisierung und Identifizierung

63 Prinzip 2D Gelelektrophorese 1.Dimension Durchführen einer isoelektrischen Fokussierung: die Proteine ordnen sich gemäß ihrem pi-wert auf dem Trägerampholyten oder IPG Streifen an 2. Dimension der Trägerampholyt/Gelstreifen wird um 90% gedreht auf das SDS-Gel gelegt: die Proteine werden gemäß ihrer Masse getrennt

64 2D Gelelektrophorese 1.Dimension: Rehydrieren der IPG-Streifen mit Probe Durchführen der IEF, Trennung nach IP Umpuffern mit DTT und anschließend mit IAA 2.Dimension: Auflegen des IPG-Streifens, quer zur Laufrichtung der Proteine Auftrennen nach Molmasse Fixierung und Färbung

65 2D Gelelektrophorese Abbildung eines 2-D-SDS-PAGE einer Mäuseleberprobe ( Görg A., Biochem.Soc. Trans., 21 (1993)

66 2D-Gel einer Probe mit Standardproteinen