DNA Isolierung. Praktikum Dr. László Kredics

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1 Isolierung Praktikum Dr. László Kredics

2 SZTE, Inst. für Med. Biol., Praktikum -Isolierung Zellaufschluss Isolierung genomischer Isolierung von Plasmid Konzentrationsbestimmung der -Lösungen Anhand Absorptionswert der Lösung Anhand Gelelektrophorese Auf basierende diagnostische und Forschungsverfahren

3 Aufgabe: Isolierung von Plasmid aus Bakterienzellen Plasmid : pbluescript Vektor, Gröβe: 2960 Bps 1. 1,5 ml Bakterienkultur in Eppendorf-Röhrchen pipettieren, 2 Minuten lang bei rpm zentrifugieren 2. Überstand vorsichtig abgiessen, Pellet in 200 l Sol I+Lysozym resuspendieren, 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren l Sol II Lösung zugeben, vorsichtig mischen, 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren l Sol III Lösung zugeben, 5 Minuten lang auf Eis inkubieren 5. Vortex, dann 5 Minuten lang bei rpm zentrifugieren 6. Überstand in ein neues Eppendorf-Röhrchen pipettieren, 600 l Isopropanol zugeben, mischen, 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren 7. 5 Minuten lang bei rpm zentrifugieren 8. Überstand abpipettieren, Pellet mit 200 l 70% eiskaltem Ethanol waschen 9. 5 Minuten lang bei rpm zentrifugieren 10. Pellet in 30 l TE-puffer aufnehmen l Plasmid mit 5 l Laufpuffer in den Schlitz auftragen 12. Plasmid mit Gelelektrophorese laufen lassen (1% Agarosegel, 30 min, 100 V)

4 Lösungen: Sol I.: für 1000 ml: 15.7 g/1 Tris-HCl, 3.72 g EDTA ph = 7.5 Sol II: 0,2 M NaOH, 1% SDS Sol III.: 3 M K-Azetat; ph=4.8 eingestellt mit Essigsäure

5 Isolierung von Plasmid Denat. genomische, Plasmid und RNA Renat. Plasmid und RNA Zellaufschluss: Mit SDS bei basischem Zustand (mit NaOH) ph wird blitzartig Neutralisiert (mit K-Azetat) Präzipitation mit Alkohol (Isopropanol) Waschen Trocknen +EDTA Resolvation +RNase Denat. genomische und denat. Proteine Plasmid, RNA Präzipitat Plasmid Lösung +RNA +RNA

6 Der Weg von lebendigen Zellen bis zur Verwendung der genomischen Leukozyten Geweben von Pflanzen/Tieren Kultivierte Zellen Embryonale Zellen Rechtsmedizinische Proben Fossilien Genbibliothek Molekulare PCR Sequenzierung Southern-blot Polymorphismus-Analysen: Klonierung SNP,VNTR, RFLP

7 Isolierung genomischer durch Proteinase-K Behandlung, Extraktion mit Phenol und Präzipitation mit Alkohol Zellaufschluss + EDTA (bildet Chelat mit Mg 2+, schützt vor DNase) Proteinase-K (schneidet Proteine) Extraktion mit Phenol (Denaturierung der Proteine) RNA Denat. Proteine Phenol Präzipitation mit Alkohol (Denaturierung der Nukleinsäuren) RNA Präzipitat RNA Proteine Waschen Resolvation Trocknen + RNase Lösung

8 Chaotrop: löst Wasserstoffbrückenbindungen auf, wirkt denaturierend auf Proteine. Isolierung genomischer mit Affinitätssäule Silica-Matrix: in der Anwesenheit von chaotropen Salzen bindet Zellaufschluss: + EDTA + RNase Probenauftrag + chaotrope Salze z.b.: NaI Waschen Elution bei niedriger Salzkonzentration Denaturierte Proteine Denaturierte Proteine Lösung

9 Der Weg von lebendigen Zellen bis zur Verwendung der genomischen Leukozyten Geweben von Pflanzen/Tieren Kultivierte Zellen Embryonale Zellen Gerichtsmedizinische Proben Fossilien Genbibliothek Molekulare PCR Klonierung Sequenzierung Southern-blot Polymorphismus-Analysen: SNP, VNTR, RFLP

10 Isolierung von Geweben/Zellen und Aufschluss der Zellen Leukozyten: hypotonische Behandlung, Detergenzien -Isolierung aus Leukozyten Probenahme kann schnell und einfach gemacht werden. Die Proben können einfach aufbewahrt werden. Die Isolierung genomischer aus Leukozyten des Blutes geht schnell und effizient. (1 ml Blut enthält 4x x10 6 Leukozyten). Aufschluss der Zellen: - Hypotonische Behandlung - Verwendung von Detergenzen (SDS) um die Membran zu zerstören

11 Isolierung von Geweben/Zellen und Aufschluss der Zellen Leukozyten: hypotonische Behandlung, Detergenzien Pflanzliche/Tierische Geweben: Enzymatische Abbau, Homogenisatoren, Mörsern nach Frieren -Isolierung aus pflanzlichen/tierischen Geweben, und Pilzen Die interzelluläre Matrix (Zellwand bei Pflanzen und Pilzen, interzelluläre Fasern bei Tieren) erschwert die Homogenisierung und Aufschluss der Zellen. Wege des Zellaufschlusses: - Enzymatische Behandlung (Abbau der Zellwand bei Pflanzen und Pilzen) - Zersetzung: Messer-, Glaskugeln - Homogenisatoren - Mörsern nach Frieren in flüssigem Stickstoff

12 Isolierung von Geweben/Zellen und Aufschluss der Zellen Leukozyten: hypotonische Behandlung, Detergenzien Pflanzliche/Tierische Geweben: Enzymatische Abbau, Homogenizatoren, Mörsern nach Frieren Kultivierte Zellen: Trennung: Behandlung mit Trypsin Zellaufschluss: hypotonische Behandlung, Detergenzien -Isolierung aus kultivierten Zellen Die kultivierten Zellen kolonisieren die innere Wand des Kultivierungsgefäßes. Sie bilden eine einzelne Schicht. Membranproteine sind verantwortlich für die Adhäsion an der Oberfläche. Trennung der Zellen: - Behandlung mit Trypsin - Mechanisch Aufschluss der zusammengesammelten Zellen: - Hypotonische Behandlung - Verwendung von Detergenzen (SDS) Aus 10 6 Zellen kann ~200μg genomische isoliert werden.

13 Isolierung von Geweben/Zellen und Aufschluss der Zellen Leukozyten: hypotonische Behandlung, Detergenzien Pflanzliche/Tierische Geweben: Enzymatische Abbau, Homogenisatoren, Mörsern nach Frieren Kultivierte Zellen: Trennung: Behandlung mit Trypsin Zellaufschluss: hypotonische Behandlung, Detergenzien Embryonale Zellen: durch differenzielle Zentrifugation können aus dem Fruchtwasser isoliert werden. Embryonale Zellen Bei Amniozentese wird 15-20ml Fruchtwasser isoliert. Embryonale Zellen werden aus dem Fruchtwasser durch differenzierende Zentrifugation isoliert. Aufschluss der Zellen geschieht ähnlich wie bei kultivierten Zellen.

14 Isolierung von Geweben/Zellen und Aufschluss der Zellen Leukozyten: hypotonische Behandlung, Detergenzien Pflanzliche/Tierische Geweben: Enzymatische Abbau, Homogenisatoren, Mörsen nach Frieren Kultivierte Zellen: Trennung: Behandlung mit Trypsin Zellaufschluss: hypotonische Behandlung, Detergenzien Embryonale Zellen: durch differenzielle Zentrifugation können aus dem Fruchtwasser isoliert werden. Gerichtsmedizinische Proben: wenige Zellen, komplexe Proben Gerichtsmedizinische Proben Spezialitäten bei Isolierung genomischer : - In den meiβten Fällen können wir nur aus extrem wenigen Zellen ausgehen. (z.b.: aus Zigarettenfilter isolierte menschliche Zellen). - Komplexität der Probe: a.) Die isolierten Zellen können von mehreren Personen stammen. b.) Die physikalische, chemische und mikrobiologische Kontamination (z.b..: Bluttropf auf dem Boden). Probenahme und Isolierung genomischer benötigen in den meiβten Fällen die Betrachtung von mehreren Faktoren.

15 Isolierung von Geweben/Zellen und Aufschluss der Zellen Leukozyten: hypotonische Behandlung, Detergenzien Pflanzliche/Tierische Geweben: Enzymatische Abbau, Homogenizatoren, Mörsen nach Frieren Kultivierten Zellen: Trennung: Behandlung mit Tripsin Zellaufschluss: hypotonische Behandlung, Detergenzien Fossilien ist ein sehr stabiles Makromolekül, in mineralisierten Knochen kann sogar mehrere Millionen Jahre lang relativ gut konserviert werden. Nach Mörsern der Knochen, kann aus der Probe extrahiert werden.

16 Der Weg von lebendigen Zellen bis zur Verwendung der genomischen Leukozyten Geweben von Pflanzen/Tieren Kultivierte Zellen Embryonale Zellen Rechtsmedizinische Proben Fossilien Genbibliothek Molekulare PCR Sequenzierung Southern-blot Polymorphismus-Analysen: Klonierung SNP,VNTR, RFLP

17 Isolierung genomischer durch Proteinase-K Behandlung, Extraktion mit Phenol und Präzipitation mit Alkohol Zellaufschluss + EDTA (bildet Chelat mit Mg 2+, schützt vor DNase) Proteinase-K (schneidet Proteine) Extraktion mit Phenol (Denaturierung der Proteine) RNA Denat. Proteine Phenol Präzipitation mit Alkohol (Denaturierung der Nukleinsäuren) RNA Präzipitat RNA Proteine Waschen Resolvation Trocknen + RNase Lösung

18 Chaotrop: löst Wasserstoffbrückenbindungen auf, wirkt denaturierend auf Proteine. Isolierung genomischer mit Affinitätssäule Silica-Matrix: in der Anwesenheit von chaotropen Salzen bindet Zellaufschluss: + chaotrope Salze z.b.: NaI Probenauftrag Waschen Elution bei niedriger Salzkonzentration + EDTA + RNase Denaturierte Proteine Denaturierte Proteine Lösung

19 AGAROSE GELELEKTROPHORESE - Agarose Gelelektrophorese ist die Methode für Separation von - Fragmenten anhand der Länge der Moleküle - -Fragmente sind negativ geladen, dafür wandern sie in einem elektrischen Feld von der Kathode in die Richtung der Anode - Die Wanderungsgeschwindigkeit ist abhängig von mehreren Faktoren: - die Konzentration des Gels, die den Porendurchmesser determiniert - die Größe der Moleküle - die Konformation der Moleküle - die Zusammensetzung der Elektrolytlösung - die elektrische Feldstärke (Spannung-Strom Verhältniss)

20 AGAROSE GELELEKTROPHORESE - die -Fragmente werden nach Ethidiumbromid-Färbung im UV-Licht sichtbar gemacht (EtBr-gefärbte Banden fluoreszieren im UV-Licht) - die Größe von beliebigen Fragmenten kann durch Kalibration mit s von bekannter Größe (sogenannte Marker s) bestimmt werden - Getrennte s können aus dem Gel für Sequenzierung oder Klonierung isoliert werden.

21 Konzentrationsbestimmung der Lösungen von Anhand Absorptionswert der Lösung Anhand Gelelektrophorese

22 Absorption Proteine (nm) Wellenlänge

23 Absorption bei 260 nm Konzentrationsbestimmung 2,0 1,5 1,0 A 260 =1: 50 μg/ml 0, Konzentration der Nukleinsäure (μg/ml)

24 Reinheits- und Konzentrationsbestimmung der Lösungen von Nukleinsäuren Anhand Absorptionswerten der Lösung Anhand Gelelektrophorese

25 + - Molekulargewicht von : Anhand der Position des Bandes (Unterschied zwischen ringförmige und lineare ) Menge von : Anhand der Dicke des Bandes ~1 μg DNS Plasmid Lineare

26 Plasmid +RNA Genomische Plasmid nach RNase Behandlung Offener Ring Lineare Geschlossener Ring (supercoiled) Fragmentierte lineare chromosomale RNA

27 Präzipitation (Fällung) der aus homogenisiertem Leber 1. Homogenisieren Sie Lebergewebe mit Hilfe von einem Mikromesser- Homogenisator. Homogenisiertes Gewebe wird durch Gaze filtriert. 2. Zentrifugieren Sie die filtrierte Flüssigkeit für 10 Minuten, mit rpm. 3. Beseitigen Sie den Überstand. Geben Sie zum Sediment (enthält Zellkerne) 1,5 ml NaCl-Lösung, dann ergänzen Sie es mit 400 l (2M) EDTA und 20 l (0,2%) SDS. 4. Mischen Sie die Lösung mit Glasstab um die Zellkerne zu lysieren, dann gießen Sie sie in einen Erlenmeyerflasche. 5. Geben Sie dazu 10 ml Chloroform, dann schütteln Sie sie vorsichtig für 10 Minuten (Proteinfällung). 6. Zentrifugieren Sie die Mischung in Röhrchen 10 Minuten lang mit 3000 rpm. Ihre Aufgabe im Praktikum: 1. Pipettieren Sie den Überstand (enthält ) in eine neue Flasche, geben Sie 2 Volumen 96% Alkohol dazu, mischen Sie die Lösung vorsichtig. 2. Die wird ausgefällt (fädiger Niederschlag), es kann um einen Glasstab aufgewickelt werden!