Prof. Dr. Michael Lohoff Tel. Büro: 06421/ Privat:06421/ Dr. Eberhard von Löw Tel. Büro: 06421/ Privat:06424/3210

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1 Betriebsanweisung für die gentechnische Anlage der Sicherheitsstufe 2 des Institutes für Medizinische Mikrobiologie im BMFZ Räume:+2/ 61320, 61330, 61340, 61410, 61380, 61390, 61400, 61120, 61150, 61160, 61170, 61180, 61220, 61240, 61270, 61280, 61290, 61190, 61140, und -1/63190 Projektleiter und Stellvertreter: Prof. Dr. Michael Lohoff Tel. Büro: 06421/ Privat:06421/ Dr. Eberhard von Löw Tel. Büro: 06421/ Privat:06424/3210 Dr. Markus Eickmann (Anlage: -1/61390) Tel. Büro: 06421/ Verantwortlich für die gentechnischen Arbeiten, für die Einhaltung der Betriebsanweisungen und für die regelmäßige Unterweisung der Mitarbeiter im Arbeitsbereich der gentechnischen Anlage nach 14 (1) GenTSV. Beauftragter für die biologische Sicherheit (BBS): Prof. Dr. W. Garten Tel. Büro: 06421/ Verantwortlich für die Kontrolle der sicherheitsrelevanten Einrichtungen, d.h. die Überwachung des, für die Sicherheit der gentechnischen Anlage zuständigen Projektleiters, sowie die Beratung des Projektleiters u.a. verantwortlicher Personen zu sicherheitsrelevanten Fragen und Berichterstattung an den Betreiber nach 18 GenTSV. Besondere Vorkommnisse und Zwischenfälle sind unverzüglich dem Projektleiter und dem BBS zu melden. Wichtige Rufnummern bei Zwischenfällen: Feuerwehr: Polizei: Interner Notruf: 125 Betriebsarzt Maßnahmen bei Zwischenfällen 1. Bei Hautkontakt mit gentechnisch veränderten Organismen (GVO) ist der kontaminierte Bereich mit Hautdesinfektionsmitteln (Sterilium, Meliseptol, s. Hygieneplan) zu desinfizieren. Bei Verletzungen und nach Aufnahme (Inkorporation) von Mikroorganismen bzw. gentechnisch veränderten Zellen (Verschlucken, Einatmen von Aerosolen, Schleimhautkontakt) ist der Betroffene nach einer evtl. erforderlichen Erste-Hilfe-Behandlung unverzüglich dem Betriebsarzt (Tel ) vorzustellen

2 2. Bei Unfällen, Verletzungen und Inkorporationen sind der Projektleiter und der Beauftragte für Biologische (BBS) zu benachrichtigen. 3. Im Gefahrfall ist analog der Brandschutzverordnung zu verfahren. Grundregeln guter mikrobiogischer Technik 4. Die Arbeiten sollen den Anforderungen der guten Laborpraxis für mikrobiologische und gentechnische Labors entsprechen. Für gentechnisch nicht veränderte Mikroorganismen gelten die Anforderungen entsprechend dem festgesetzten Risikopotenzial (L1 L4) der UVV Biotechnologie (BCV C4 Biotechnologie vormals VBG 102), für Arbeiten mit gentechnisch veränderten Mikroorganismen (GVO) gelten zusätzlich die Anforderungen der Gentechniksicherheits-Verordnung (GenTSV). 5. Der Gentechnik-Arbeitsbereich muss als solcher unter Nennung der Sicherheitsstufe gekennzeichnet sein (z.b. Gentechnische Anlage der Sicherheitsstufe 2). Die Kennzeichnung ist an den Zugangtüren der Flure bzw an den Labortüren anzubringen. Der Bereich ist außerdem mit dem Warnzeichen Biogefährdung zu kennzeichnen. An den Türen von Laborräumen, Funktionsräumen und Büros, die nicht zum Gentechnik-Bereich gehören, müssen, soweit diese Verbindungen zum Gentechnik- Bereich darstellen, entsprechende Hinweise (z.b. Keine gentechnische Anlage, Schutzkleidung vor Betreten ablegen) angebracht werden. Dieses gilt für die Denkzellen: 61130, 61230, 61250, 61270, und sowie für die Büroräume 61350/ und In den Abzügen (61150, 61180, 61240) innerhalb der Anlage dürfen keine gentechnischen Arbeiten durchgeführt werden. Sie sind entsprechend zu kennzeichnen. 6. Für den Gentechnikbereich bestehen Zutrittsbeschränkungen. Es dürfen sich nur die dort beschäftigten und eingewiesenen Mitarbeiter aufhalten. Die Zutrittsberechtigung entsprechend autorisierter Mitarbeiter wird über die Vergabe von Transpondern (elektronische Schließsysteme, die je nach Zutrittsberechtigung für bestimmte Räume freigeschaltet werden) kontrolliert. Der Eingangsbereich der Anlage ist verschlossen und kann von betriebsfremden Personen nur durch Betätigung eines Rufsystems betreten werden, nachdem die Eingangstür von innen von den jeweiligen Mitarbeitern geöffnet wurde. 7. Die Laborräume sollen sauber und aufgeräumt sein, insbesondere dürfen Wege nicht verstellt werden (Stolpergefahr) 8. Die Arbeitstische dürfen nicht als Abstellfläche benutzt werden, Vorräte müssen in der dafür vorgesehenen Schränken bzw. Räumen gelagert werden. (s. Sicherheitshinweise für Arbeiten im Labor) 9. Die Sicherheitswerkbank ist 15 min vor der Benutzung einzuschalten 10. Die Sicherheitswerkbänke sind regelmäßig üblicherweise einmal jährlich entsprechend den Vorgaben des Herstellers zu warten. Die Überprüfung der HOSCH- Filter der Sicherheitswerkbank erfolgt einmal jährlich durch die technische Abteilung der Universität bzw. Hygienetechnik. Die Arbeiten werden protokolliert. Die Protokolle sind bei der Werkbank aufzuheben.

3 11. Ein Filterwechsel darf nur auf Weisung und nach Vorgaben des Projektleiters im Gentechnik-Bereich durchgeführt werden, dabei werden die Filter mittels Formalinbegasung inaktiviert (Begasungssystem der Firma Kendro Heraeus). Siehe Formblatt AL, 5,1,2). 12. Brennbare Flüssigkeiten (z.b. Alkohol) dürfen nicht in Flammennähe (Bunsenbrenner) aufbewahrt werden. Vorsicht bei Sprühdesinfektionen mit alkoholischen Präparaten in der Werkbank. Es muss sichergestellt sein, dass während der Desinfektion und bis zur Verflüchtigung der Brenner nicht arbeitet bzw. gezündet wird! 13. In den Arbeitsräumen darf nicht gegessen, getrunken, geschnupft und sich geschminkt oder geraucht werden. Getränke, Lebensmittel und Kosmetika dürfen auch nicht dort aufbewahrt werden. Für diesen Zweck steht ein Sozialraum (+2/63270) zur Verfügung. 14. Fenster und Türen sind während der Arbeit geschlossen zu halten 15. Im Sicherheitsbereich müssen Laborkittel getragen werden. Die Kittel dürfen außerhalb des gentechnischen Laborbereiches nicht getragen werden, auch nicht in den Büros. In den Fluren besteht dann keine Pflicht einen Kittel zu tragen, wenn Bereiche aufgesucht werden die nicht zur gentechnischen Anlage gehören (z.b. Büros, Sozialraum). 16. Laborhandschuhe sind zu tragen: a. wenn die Gefahr einer Kontamination mit potenziell pathogenen Organismen besteht b. wenn mit aggressiven bzw. gesundheitsschädlichen Chemikalien (z.b. Desinfektionsmittel, Sybr Dye, Ethidiumbromid) umgegangen wird. Dabei ist darauf zu achten, dass normale Latex-Laborhandschuhe nicht ausreichen. Dafür stehen Nitril-Handschuhe zur Verfügung. c. Beim Verlassen des Arbeitsplatzes, z.b. zur Gel-Dokumentation, ist darauf zu achten, dass zumindest von der Hand der Handschuh entfernt wird, mit der u.a. die Türklinken angefasst werden. 17. Mit dem Mund pipettieren ist untersagt. Es müssen Pipettierhilfen verwendet werden. 18. Spritzen und Kanülen sind in durchstichsicheren Gefäßen zu sammeln. Deren Lagerung ist aus ein Mindestmaß zu beschränken. Das recapping (Rückführung der gebrauchten Kanüle in die Schutzkappe) ist nicht zulässig: Verletzungsgefahr! 19. Bei Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen (GVO) bzw. Mikroorganismen müssen Aerosole soweit wie möglich vermieden werden, zum Beispiel durch dichte Zentrifugenrotoren, bzw. Becher. Arbeiten mit GVO, bei den Aerosole entstehen können, sind unter Sicherheitswerkbank durchzuführen. 20. Nach Beendigung der Arbeit und vor Verlassen des Labors müssen die Hände desinfiziert und gegebenenfalls gründlich gewaschen und rückgefettet werden. 21. Alle Arbeitsplätze sind täglich zu desinfizieren (s. Hygieneplan)

4 22. Ungeziefer und mögliche Überträger von GVO müssen mit den dafür vorgeschrieben Mitteln bekämpft werden (erfolgt durch die Hygienetechnik) 23. Die Identität der GVO bzw. der Mikroorganismen muss dann regelmäßig überprüft werden, wenn diese zur Beurteilung des Gefährdungspotenzials notwendig ist. Im Falle der GVO kommen dabei folgende Verfahren zur Anwendung: Amplifikation mit vektorspezifischen Primern und Sequenzierung des DNA-Inserts. 24. Beim Umgang mit humanpathogenen GVO muss gemäß 12 Abs. 7 GenTSV der Arbeitsbereich hinsichtlich möglicher Kontaminationen überwacht werden. Diese Überwachung beschränkt sich auf die gentechnisch veränderten E.coli K12-Stämme (JM109, TOP10) und den Bereich, in dem dieser angezüchtet und verarbeitet wird. Der Nachweis erfolgt über die Ampicillin-Resistenz dieser Stämme. Dazu werden Abstriche aus der Sicherheitswerkbank, Armaturhebel der Waschbecken und Zentrifugen sowie in Stichproben, Abstriche von Türgriffen, sowohl der Raumtüren, als auch der Brut- und Kühlschranktüren, zunächst halbjährlich kontrolliert. Als Selektivnährboden dient eine LB-Nährbouillon mit Ampicillin. Die Beprobung erfolgt unter der Leitung des Projektleiters und wird dokumentiert. 25. In der Mikrobiologie unerfahrene Mitarbeiter müssen über die möglichen Gefahren unterrichtet, sorgfältig angeleitet und überwacht werden. 26. Die Mitarbeiter sind bei der Einstellung und danach fortlaufend (1 mal pro Jahr) anhand der Betriebsanweisung zu unterrichten. Der Inhalt der Unterrichtung muss schriftlich festgelegt werden. Die Teilnahme an der Unterweisung ist durch die Unterschrift des Unterwiesenen zu dokumentieren. Es ist außerdem festzuhalten, wer die Unterweisung durchgeführt hat (Projektleiter) 27. Gentechnisch veränderte Organismen (GVO) und mit GVO kontaminierter fester oder flüssiger Abfall und kontaminiertes Abwasser müssen gefahrlos gesammelt werden und durch Autoklavieren ( 30 min bei 121 C) inaktiviert werden. 28. Ein Autoklav zur Entsorgung von kontaminierten Abfällen ist vorhanden. Personen, die mit dem Autoklavieren gentechnischer Abfälle beauftragt sind, müssen entsprechend eingewiesen werden. 29. Die Funktionsfähigkeit des Autoklaven ist in halbjährlichen Abständen durch die technische Abteilung der Universität mittels Bioindikatoren zu überprüfen. Die Prüfprotokolle sind aufzubewahren. 30. Bei Reinigungs-, Desinfektions-, Instandsetzungs- und Wartungsarbeiten von Geräten im Gentechnikbereich ist eine schriftliche Erlaubnis durch den Projektleiter oder dessen Stellvertreter nach 12 (5) GenTSV und UVV notwendig. 31. Vor Reinigungs-, Änderungs- und Instandsetzungsarbeiten sind Geräte und Einrichtungen vom Personal zu desinfizieren. 32. Mit gentechnisch veränderten Organismen kontaminierte Glaswaren (Pipetten) werden vor der Reinigung in Desinfektionsmittel eingeweicht (z.b. 1 Stunde in 3% Sekusept forte: s. Hygieneplan).

5 33. Wird kontaminiertes Material verschüttet, ist der betreffende Bereich sofort zu desinfizieren. Dabei sind die im Hygieneplan vorgeschriebenen Verfahren und Desinfektionsmittel anzuwenden (siehe Hygieneplan: Oberflächen von Geräten und Inventar, nach jeder möglichen Kontamination mit GVO). Ist eine Dekontamination nicht gleich möglich, ist der Bereich solange zu sperren, bis eine Dekontamination erfolgt ist. Der gesperrte Bereich ist entsprechend durch ein Schild ( kein Zutritt ; gesperrt ) z.b. an der Raumtür oder an der Werkbank zu kennzeichnen. 34. Die im Hygieneplan (Anhang der Betriebsanweisung) festgelegten Verfahren zur Desinfizierung und Inaktivierung müssen strikt befolgt werden. 35. GVO müssen sachgerecht gelagert werden (GenTSV: Anhang III, Stufe 2 Nr. 12). Die Lagerung erfolgt im Raum +2/ im Tiefkühlschrank (-80 ). Für den Transport (z. B. über den Flur zur Entsorgung oder aus dem Lager mit Flüssig-Stickstoff (-1/63190) der GVO stehen bruchsichere, autoklavierbare Transportbehälter bereit. Die Behältnisse für die GVO sind entsprechend zu kennzeichnen (GVO; S1 bzw. S2, Beschreibung des Inhalts, verantwortlicher Projektleiter, gentechnische Anlage). 36. Für gentechnische Arbeiten besteht eine Aufzeichnungspflicht: Vor dem Beginn gentechnischer Arbeiten müssen sie dem Projektleiter gemeldet werden. Dabei ist eine ausführliche Beschreibung der Arbeiten (Spender, Empfänger, Vektor etc.), soweit es sich um ein neues Konstrukt handelt, vorzulegen. Dieses gilt auch für Umsetzungen von GVOs oder Vernichtung derselben. 37. Für den Raum 1/61390 (Lagerung von GVO der Stufe S1 in flüssig Stickstoff) ist der anlagebezogene Projektleiter Herr Dr. Eickmann (Virologie: UMR 109). Die Projektleitung für die gentechnischen Arbeiten erfolgt durch die oben genannten Projektleiter. Diese sind auch verantwortlich für die Aufzeichnungen nach GenTSV und Gentechnik-Aufzeichnungsverordnung. 38. Um nicht die Zuverlässigkeit der Philipps-Universität Marburg als Betreiberin von gentechnischen Anlagen in Frage zustellen, sind die in einem Behördenbescheid enthaltenen Nebenbestimmungen unbedingt zu beachten und frist- und praxisgerecht auszuführen.