HER2easy Kit IHC. Gebrauchsanweisung
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- Erna Vogel
- vor 8 Jahren
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1 HER2easy Kit IHC REF / Cat. No.: ZUC063 ca. 60 Tests Gebrauchsanweisung Zweckbestimmung HER2easy Kit IHC ist für die semiquantitative immunchemische Bestimmung der Expression des HER2 Proteins in Gewebeschnitten von in Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Mammakarzinomen bestimmt. Zum Gebrauch als In vitro Diagnostikum. Zusammenfassung / Erläuterung Das HER2 Protein (Human Epithelial Growth Factor Receptor 2) ist ein 185 kda transmembranes Glykoprotein mit Tyrosin Kinase Aktivität. Es gehört zur Familie der epidermalen Wachstumsfaktor Rezeptoren und hat eine hohe Homologie mit dem Epidermalen Wachstumsfaktor Rezeptor 1 (EGFR1 oder HER1). Andere Bezeichnungen für das HER2 Protein sind CD380, EGFR2 oder p185. Das Gen wird u.a. als HER2, ERBB2 oder NEU bezeichnet. Das HER2 Protein wird von einer Vielzahl von Epithelzellen exprimiert (1-6). Ein gewisser Anteil von Patientinnen mit Mammakarzinomen weist eine Überexpression des HER2-Proteins auf, welche als eine Ursache für die maligne Transformation und Tumorprogression angesehen wird. Der Nachweis einer HER2 Überexpression eines Mammakarzinoms wird zur Bestimmung der Eignung für eine Therapie mit Trastuzumab (Herceptin ) als notwendig erachtet (7-9). Prinzip der Methode Schnittpräparate von in Paraffin eingebetteten Geweben werden zunächst entparaffiniert und rehydratisiert. Endogene Peroxidase im Gewebeschnitt, die später zu unerwünschter Hintergrundfärbung führen kann, wird durch Inkubation des Präparates mit 3 %iger H 2 O 2 -Lösung ( Peroxide Block ) inaktiviert. Anschließend erfolgt die Inkubation mit dem spezifischen Primärantikörper gegen das HER2 Protein. Nach einem Waschschritt wird ein Sekundärantikörper aufgetragen, der kovalent an ein Meerrettichperoxidase-Polymer ( HRP- Polymer ) gekoppelt ist. Nach einem weiteren Waschschritt wird durch Hinzugeben einer zuvor angesetzten Substrat/DAB Lösung eine enzymatische Reaktion mit der Peroxidase gestartet, in deren Verlauf sich am Ort der Bindung des Primärantikörpers ein Farbniederschlag bildet. Die Farbgebung ist abhängig vom verwendeten Chromogen. Das im Kit enthaltene DAB bildet ein dunkelbraunes Reaktionsprodukt. Die Gewebeschnitte können anschließend gegengefärbt und eingedeckt werden. Die Auswertung der immunhistochemischen Färbungen erfolgt lichtmikroskopisch. Gelieferte Reagenzien und Lagerungshinweise Reagenz Form Menge Lagerung HIER Citrate Buffer ph 6,0 (10 X) 10 X Konzentrat 2 x 100 ml 2 8 C Wash Buffer (20 X) 20 X Konzentrat 500 ml C Peroxide Block gebrauchsfertig 8 ml 2 8 C Mouse monoclonal antibody HER2/neu (c-erbb2) clone CB11 gebrauchsfertig 6 ml 2 8 C HRP Polymer anti-mouse/rabbit/rat gebrauchsfertig 6 ml 2 8 C DAB Chromogen Konzentrat 3 ml 2 8 C DAB Substrate Buffer gebrauchsfertig 8 x 5 ml 2 8 C
2 Benötigte Zusatzmaterialien, die nicht im Lieferumfang enthalten sind: Adhäsive Objektträger und Deckgläser Gerät zur Epitopdemaskierung (Schnellkochtopf, Dampfgarer) Pipetten, Messzylinder, Färbeküvetten, ggf. Inkubationskammer ( feuchte Kammer ) Positives und negatives Kontrollgewebe Xylol oder geeignete Ersatzstoffe, Ethanol, demineralisiertes oder destilliertes H 2 O PAP Pen (z. B. Bestell Nr. LP0001) Reagenz zur Negativkontrolle Lösung zur Gegenfärbung Eindeckmittel Lagerung und Handhabung Die Lösungen sollten den Lagerungshinweisen auf den Produktetiketten entsprechend gelagert werden ohne weiter verdünnt zu werden. Bitte bewahren Sie die Lösungen an einem lichtgeschützten Ort auf. Nicht einfrieren. Die Lösungen sind haltbar bis zum angegebenen Verfallsdatum, wenn sie sachgemäß gelagert werden, und dürfen nicht über das Verfallsdatum hinaus verwendet werden. Sämtliche Reagenzien werden im Kühlschrank bei 2-8 C gelagert. Nur der Waschpuffer (Wash Buffer 20 X) ist bei Raumtemperatur (18-25 C) zu lagern. Bei Aufbewahrun g des 20X Konzentrates im Kühlschrank fallen Salze aus, die aber wieder in Lösung gehen, wenn der Puffer Raumtemperatur angenommen hat. Der Waschpuffer ist anschließend ohne Einschränkung verwendbar. Gebrauchsfertig verdünnter Waschpuffer ist bei 2-8 C aufzubewahren und für mindestens eine Woche haltbar. Falls die Lagerungsbedingungen für die Reagenzien von diesen Empfehlungen abweichen, so müssen sie vom Anwender validiert werden. Da es für eine mögliche Instabilität der Reagenzien des Kits keine offensichtlichen Indikatoren gibt, müssen parallel zum Untersuchungsmaterial stets Positiv- und Negativkontrollen mitgeführt werden. Wenn eine unerwartete Färbung auftritt, die nicht durch veränderte Labormethoden zu erklären und vermutlich auf die Reagenzien zurückzuführen ist, kontaktieren Sie bitte unseren technischen Kundendienst. Vorsichtsmaßnahmen und weitere Hinweise 1. Anwendung ausschließlich durch geschultes Fachpersonal. Sicherheitsdatenblätter für fachlich qualifizierte Anwender stehen auf Anfrage zur Verfügung. 2. Zur Verwendung für in vitro-untersuchungen. 3. Tragen Sie Schutzausrüstung, um Augen-, Haut- oder Schleimhautkontakt mit den Reagenzien zu vermeiden. Falls Sie mit einem der Reagenzien an empfindlicher Stelle in Kontakt kommen, waschen Sie diese mit reichlich Wasser. 4. Die Reagenzien des Kits enthalten die Konservierungsstoffe ProClin 300 und Natriumazid (NaN 3 ). Natriumazid kann jedoch mit in Wasserleitungen und Abflussrohren vorhandenem Blei oder Kupfer hoch explosive Metall-Azide bilden. Um solche Azidanreicherungen zu vermeiden, muss bei der Entsorgung mit reichlich Wasser nachgespült werden. Auf Anfrage ist das Sicherheitsdatenblatt für die Reinsubstanz erhältlich. 5. Peroxide Block enthält 3 % Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ). Das Sicherheitsdatenblatt ist auf Anfrage erhältlich. 6. Mouse monoclonal antibody HER2/neu und HRP Polymer anti-mouse/rabbit/rat enthalten Material tierischer Herkunft und müssen wie alle aus biologischen Materialien gewonnenen Produkte ordnungsgemäß gehandhabt werden. 7. DAB Chromogen enthält 3,3 -Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid. Es kann Verätzungen verursachen und steht im Verdacht, Krebs erzeugende Wirkung zu haben. Das Sicherheitsdatenblatt ist auf Anfrage erhältlich. 8. Eine mikrobielle Verunreinigung der Reagenzien sollte vermieden werden, da sonst eine unspezifische Färbung auftreten könnte. 9. Von den angegebenen Spezifikationen abweichende Verdünnungen, Inkubationsbedingungen und technische Methoden können zu fehlerhaften Resultaten führen. 10. Die Lagerung der Kitkomponenten und die Durchführung der Färbung dürfen nicht bei intensivem Lichteinfall, wie z.b. direkter Sonneneinstrahlung, erfolgen. 11. Die Kitkomponenten sind aufeinander abgestimmt und dürfen ohne erneute Validierung nicht durch andere Reagenzien ersetzt werden. Nur an Stelle des Waschpuffers (Wash Buffer 20 X) und des Citratpuffers (HIER Citrate Buffer) können die entsprechenden Einzelprodukte ZUC020 und ZUC028 verwendet werden.
3 Durchführung der Färbung A. Vorbereitung der Reagenzien 1. Ansetzen der Vorbehandlungslösung: 1 Teil HIER Citrate Buffer ph 6,0 (10 X) mit demineralisiertem oder destilliertem H 2 O im Verhältnis 1:10 ansetzen und mischen. 2. Ansetzen des Waschpuffers: 1 Teil Wash Buffer (20 X) mit demineralisiertem oder destilliertem H 2 O im Verhältnis 1:20 ansetzen und mischen. 3. Ansetzen der Substrat/DAB Lösung: 5 Tropfen (ca. 200 µl) DAB Konzentrat (DAB Chromogen) in eine Flasche Substratpuffer (5 ml DAB Substrate Buffer) geben und gut mischen. Die so angesetzte DAB Lösung ist bei Raumtemperatur für mindestens 6 Stunden stabil, muss aber vor starkem Lichteinfall geschützt aufbewahrt werden. B. Vorbehandlung der Paraffinschnitte (HIER, Hitze induziertes Epitop Retrieval) Auf adhäsive Objektträger aufgezogene Paraffinschnitte entparaffinieren, rehydratisieren und anschließend zur Epitopdemaskierung gemäß Protokoll I (Schnellkochtopf) oder Protokoll II (Dampfgarer) vorbehandeln. Protokoll I: Schnellkochtopf 1. Schnellkochtopf mit demineralisiertem oder destilliertem H 2 O befüllen. Für einen handelsüblichen Schnellkochtopf werden etwa 1,5 Liter H 2 O benötigt. 2. Geeignete Küvetten so weit mit zuvor verdünnter Vorbehandlungslösung (HIER Citrate Buffer ph 6,0) befüllen, dass die Gewebeschnitte später vollständig bedeckt sind. Diese befüllten Küvetten in den Schnellkochtopf stellen und die Deckel auflegen. 3. Den Schnellkochtopf mit aufgelegtem, aber nicht verschlossenem Deckel auf einer Heizplatte erwärmen, bis die Vorbehandlungslösung in den Küvetten 95 C erreicht hat. 4. Objektträger mit den Gewebeschnitten in die Küvetten mit der heißen Vorbehandlungslösung stellen und die Küvetten wieder locker mit Deckeln verschließen. 5. Schnellkochtopf verschließen und die Heizplatte auf der höchsten Heizstufe belassen, bis der größtmögliche Druck erreicht ist. D.h. bei den meisten handelsüblichen Geräten, dass beide Ringe der Druckanzeige zu sehen sind. 6. Schnellkochtopf noch für 10 Minuten auf der Heizplatte belassen. Die Gesamt-Kochzeit beträgt damit 10 Minuten. 7. Heizplatte ausschalten. Schnellkochtopf unter fließendes kaltes Leitungswasser stellen und dadurch so weit abkühlen, dass der Überdruck abgebaut wird. 8. Den drucklosen Topf öffnen und kaltes Leitungswasser zulaufen lassen, bis sowohl das H 2 O im Topf als auch die Vorbehandlungslösung in den Küvetten vollständig durch Leitungswasser verdrängt worden ist. 9. Schnitte in Waschpuffer (Wash Buffer) überführen und mit der immunhistochemischen Färbung beginnen. Protokoll II: Dampfgarer 1. Dampfgarer mit Leitungswasser bis zur Maximum Markierung füllen und bei geschlossenem Deckel aufheizen, bis das Wasser siedet (ca. 10 Minuten). 2. Geeignete Küvetten so weit mit zuvor verdünnter Vorbehandlungslösung (HIER Citrate Buffer ph 6,0) befüllen, dass die Gewebeschnitte später vollständig bedeckt sind. Die befüllten Küvetten in das heiße Wasser in den Dampfgarer stellen und die Deckel auflegen. 3. Den Dampfgarer verschließen und für 30 Minuten aufheizen, um die Vorbehandlungslösung in den Küvetten zu erhitzen. 4. Temperatur in der Vorbehandlungslösung in den Küvetten prüfen (muss >/= 95 C betragen), Objektträge r mit den Gewebeschnitten in heiße Vorbehandlungslösung stellen und Küvetten wieder mit dem Deckel verschließen. 5. Dampfgarer verschließen und für weitere 30 Minuten aufheizen. 6. Dampfgarer ausschalten, Küvetten samt heißer Lösung und Präparaten entnehmen und für 20 Minuten auf dem Labortisch abkühlen lassen. 7. Anschließend langsam kaltes Leitungswasser in die Küvetten laufen lassen, bis die Vorbehandlungslösung in den Küvetten vollständig durch das Wasser verdrängt worden ist. 8. Schnitte in Waschpuffer (Wash Buffer) überführen und mit der immunhistochemischen Färbung beginnen.
4 C. Immunhistochemische Färbung Die Paraffinschnitte müssen zuvor vollständig entparaffiniert und einer Hitzvorbehandlung (HIER) zur Epitop Demaskierung unterzogen worden sein (s.o.). Reagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur (18-25 C ) bringen. Sämtliche Inkubationsschritte sind bei Raumtemperatur durchzuführen. Dabei müssen die Gewebeschnitte vollständig mit den verschiedenen Lösungen überschichtet sein, um ein Austrocknen zu verhindern. 1. Optional: Gewebeschnitte mit PAP Pen (z.b. LP0001) umranden 2. Peroxide Block (Peroxide Block) 10 Min. 3. Waschen mit Waschpuffer (Wash Buffer) 1 x 2 Min. 4. HER2 Antikörper (Mouse monoclonal antibody HER2/neu) (oder negatives Kontrollreagenz) 60 Min. 5. Waschen mit Waschpuffer (Wash Buffer) 3 x 2 Min. 6. HRP Polymer anti-mouse/rabbit/rat 30 Min. 7. Waschen mit Waschpuffer (Wash Buffer) 3 x 2 Min. 8. DAB 10 Min. 9. Stoppen der Reaktion mit demineralisiertem oder destilliertem H 2 O 10. Gegenfärben und Bläuen 11. Eindecken: wässrig oder permanent organisch über aufsteigende Alkoholreihe und Xylol Qualitätskontrolle Schwankungen bei der Fixierung, Einbettung und weiteren Prozessierung der zu untersuchenden Gewebe können sich auf die Reproduzierbarkeit der Färbergebnisse auswirken und letztendlich zu großen Unterschieden bei den erzielten Resultaten führen. Bei jedem Färbedurchgang ist es daher erforderlich, zusätzlich zum Untersuchungsmaterial eine Positiv- und eine Negativkontrolle mitzuführen. Die Positivkontrolle dient der Überprüfung der korrekten Verarbeitung der Probe. Als Positivkontrolle dienende Gewebe sollten nur schwach positiv sein, um bereits geringfügige Veränderungen in der Sensitivität der Testmethode erkennen zu können. Die Interpretation der Färbung erfolgt nur an intakten Zellen, da nekrotische oder degenerierte Zellen häufig unspezifisch angefärbt werden (10). Ist das negative Kontrollgewebe positiv, so weist dies auf eine unspezifische Färbung hin. In den meisten histologischen Schnitten liegen Bereiche oder Zelltypen vor, die sich als interne Negativkontrollen anbieten. Dies können z.b. normale Milchgänge sein. Geeignete Verfahren zur Qualitätssicherung sind darüber hinaus für jede neue Kit-Charge und nach jeder methodischen Veränderung durchzuführen. Zu erwartende Resultate Während der Reaktion zwischen dem Substrat und der Meerrettichperoxidase in Gegenwart des Substrat-DAB- Gemisches bildet sich am Ort der Bindung des Primärantikörpers ein brauner Farbniederschlag, der im Lichtmikroskop ausgewertet werden kann. Für die Bestimmung der Überexpression des HER2 Proteins werden nur die Anfärbungen der Zytoplasmamembranen berücksichtigt. Die Auswertung erfolgt durch einen Facharzt für Pathologie. Die S3 Leitlinie für die Diagnostik, Therapie und Nachsorge des Mammakarzinoms, 1. Aktualisierung 2008, empfiehlt folgendes Auswerteverfahren (11): A. positiver HER-2-Status: IHC-Score 3+ : gleichmäßige intensive zirkuläre Membranreaktion in mehr als 30 % der invasiven Tumorzellen B. zweifelhafter HER-2-Status: IHC-Score 2+ : ungleichmäßige oder schwache zirkuläre Membranreaktion in mehr als 10 % der invasiven Tumorzellen oder starke zirkuläre Membranreaktion in < 30 % der invasiven Tumorzellen C: negativer HER-2-Status: IHC-Score 0 oder 1+ : keine Membranreaktion oder schwache inkomplette Membranreaktion
5 Grenzen der Methode Die Immunhistochemie ist eine komplexe Methode, in der histologische und immunologische Detektionsmethoden kombiniert werden. Bereits die Gewebeverarbeitung oder die Handhabung der Proben vor der eigentlichen Immunhistologie können zu ungenauen Ergebnissen führen, wenn die Richtlinien nicht eingehalten werden (12). Schwankungen der Ergebnisse treten insbesondere durch Variationen bei der Fixierung und Einbettung der Gewebe auf. Die Aktivität der endogenen Peroxidase oder der Pseudoperoxidase der Erythrozyten kann unspezifische Färbungen verursachen. Gewebe von Personen mit Hepatitis B Infektion können das HBs Antigen enthalten und bei Verwendung von Detektionssystemen mit Meerrettichperoxidase falsch positive Ergebnisse verursachen (13). Eine unzureichende oder zu starke Gegenfärbung oder ein ungeeignetes Eindeckmittel können die Interpretation der Ergebnisse beeinflussen. Die Farbintensität des Endproduktes kann, insbesondere bei sehr starkem Lichteinfall, abnehmen. Die Bewertung der Ergebnisse muss stets im Kontext der Gewebemorphologie und des klinischen Befundes erfolgen. Sie muss durch angemessene Kontrollen und weitere diagnostische Tests ergänzt werden. Die gefärbten Präparate werden durch einen qualifizierten Pathologen begutachtet, der auch für die Auswahl geeigneter Kontrollen verantwortlich ist. Die Eignung des HER2easy Kits ist nur für Proben untersucht worden, die in neutral gepuffertem Formalin fixiert wurden. Zytomed Systems garantiert, dass das Produkt bei korrekter Lagerung und Handhabung bis zum Ablauf des angegebenen Haltbarkeitsdatums allen beschriebenen Anforderungen entspricht. Darüber hinaus gehende Garantien können nicht gegeben werden. Fehlersuche und behebung Sollte eine ungewöhnliche Färbung auftreten, so lesen Sie bitte diese Packungsbeilage auf eventuelle Hinweise oder kontaktieren Sie unseren technischen Kundendienst. Mögliche Gründe für ein negatives Ergebnis auf einem eigentlich positiven Kontrollschnitt: Reagenzien wurden nicht in der richtigen Reihenfolge eingesetzt. Antigen/Epitop ist bei der durchgeführten Fixierungsmethode nicht stabil. Testen Sie andere Fixierungsmethoden. Chromogen/Substrat-Arbeitslösung war zu alt. Mögliche Ursachen für schwache Färbungen: Unzureichende oder zu starke Fixierung. Unvollständige Entparaffinierung. Nach dem Waschen verbleibt zu viel Waschpuffer auf den Schnitten; die nachfolgenden Reagenzien werden dadurch zu stark verdünnt. Die Inkubationszeiten für die verschiedenen Reagenzien waren zu kurz. Chromogen/Substrat-Arbeitslösung war zu alt. Mögliche Gründe für übermäßige Hintergrundfärbungen: Unvollständige Entparaffinierung. Ungeeignetes oder zu viel Adhäsiv für die Beschichtung der Objektträger. Nicht ausreichendes Waschen. Kritisch sind besonders die Waschschritte nach den Inkubationen mit dem HRP-Polymer und der Chromogen/Substrat-Lösung. Das Gewebe ist während der Prozedur (teilweise) ausgetrocknet. Die Reaktionstemperatur bei der Inkubation der Chromogen/Substrat-Arbeitslösung war zu hoch (z.b. bei erhöhter Temperatur im Labor). Das Substrat wird von im Gewebe enthaltener endogener Peroxidase umgesetzt. Möglicherweise war die verwendete H 2O 2- Blockierungslösung nicht mehr ausreichend aktiv. Die Inkubationszeiten für die verschiedenen Reagenzien waren zu lang.
6 Leistungsdaten HER2easy Kit IHC wurde entwickelt, um die semiquantitative Bestimmung der Expression des HER2 Proteins im Formalin fixierten Paraffinschnitt unter standardisierten und gut reproduzierbaren Bedingungen durchführen zu können. Das Kit ist nicht dafür vorgesehen, Patientinnen oder Ärzten prognostische Informationen zu liefern. Der auch im HER2easy Kit enthaltene Primärantikörper des Klons CB11 gegen das HER2/neu Protein ist ein seit langem etablierter Antikörper, der in einer Vielzahl von Studien im Vergleich mit anderen immunhistochemischen und molekularbiologischen Verfahren untersucht wurde (14-17). Die Reagenzien des HER2easy Kit IHC wurden in internen Untersuchungen evaluiert. Beide hier aufgeführten Vorbehandlungsmethoden zur Epitop Demaskierung (Protokoll I und II) führten dabei zu identischen Ergebnissen. Färbungen in Kombination mit der hier angegebenen Vorbehandlung nach Protokoll I wurden u.a. in den Ringversuchen HER2/neu Immunhistochemie/Mammakarzinom - der Qualitätssicherungs-Initiative Pathologie (QuIP) der Jahre 2007, 2008 und 2009 extern begutachtet. Die erfolgreiche Teilnahme an diesen Ringversuchen wurde in allen Fällen bescheinigt. Literatur 1. Coussens L et al. Science 230: , King CR et al. Science 229: , Yamamoto T et al. Nature 319: , Bargmann CI et al. Nature 319: , Natali PG et al. Int J Cancer 45: , Press MF et al. Oncogene 5: , Lonardo F et al. New Biologist 2: , Carter P et al. Proc Natl Acad Sci USA 89: , Baselga J et al. Cancer Res 58: , Nadji M, Morales AR. Lab Med 14: , Interdisziplinäre S3-Leitlinie für die Diagnostik, Therapie und Nachsorge des Mammakarzinoms, 1. Aktualisierung, Nadji M, Morales AR. Ann NY Acad Sci 420: , Omata M et al. Am J Clin Pathol 73: , Couturier J et al. Mod Pathol 13: , Bánkfalvi A et al. Int J Oncol 23 : , Lebeau A et al. J Clin Oncol 19: , O`Malley FP et al. Am J Clin Pathol 115: , 2001 Erläuterung der auf dem Produktetikett verwendeten Symbole: Bestellnummer Catalog Number Reference du catalogue Chargenbezeichnung Batch Code Code du lot In vitro Diagnostikum In Vitro Diagnostic Medical Device Dispositif médical de diagnostic in vitro Achtung/Gefahr Warning/Danger Attention/Danger Verwendbar bis Use By Utiliser jusque Lagerungstemperatur Temperature Limitation Limites de température Achtung/Gefahr Warning/Danger Attention/Danger Achtung Warning Attention Gefahr Danger Danger RUO Gebrauchsanweisung beachten Consult Instructions for use Consulter les instructions d'utilisation Nur für Forschungszwecke For Research Use Only Pour la recherche uniquement Hersteller / Manufacturer / Fabricant Zytomed Systems GmbH Anhaltinerstraße Berlin, Germany Tel: (+49)
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