Fluoreszenzmikroskopie

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1 Fluoreszenzmikroskopie Grundlagen 1: Fluoreszenz und was sie der Biologie bringt Grundlagen 2: Fluoreszenzmikroskop Aufbau und Funktion Grundlagen 3: Konfokalmikroskopie Anwendungen 1: FRET und Proteininteraktion Anwendungen 2: FRAP und Proteindynamik Anwendungen 3: Apotom, TIRF 9.Apotom Perspektiven: Jenseits der Auflösungsgrenze

2 1. Was ist Fluoreszenz und was bringt sie der Biologie? Frage: Warum verwandelt das Fluoreszenzmikroskop grüne in rote Zellbiologie? 9.Apotom Jablonski-Diagramm des Chlorophylls

3 1. Was ist Fluoreszenz und was bringt sie der Biologie? Licht kann auf drei Arten mit Molekülen wechselwirken: 1. Absorption: Grundlage für Hellfeldmikroskopie und Histologie. 2. Reflexion: Grundlage für Reflexionsmikroskopie (Geologie). 3. Fluoreszenz: Grundlage für Fluoreszenzmikroskopie. Anregung und Emission sind für jedes Molekül spezifisch: Fluoreszenzmikroskopie zeigt also nicht nur, wo etwas ist, sondern auch, was es ist: Fluoreszenzmikroskopie ist also Biochemie mit dem Mikroskop.

4 1. Was ist Fluoreszenz und was bringt sie der Biologie? Frage: Warum ist das Emission immer langwelliger als die Anregung (Stokes-Shift)? Plancksche Formel n = c/l Brogliesche Formel E=h(c/l) Jablonski-Diagramm des Chlorophylls Plancksches Wirkungsquantum h: J sec weil beim Übergang zwischen verschiedenen Singulett-Zuständen Energie in Form von Wärme verlorengeht.

5 1. Was ist Fluoreszenz und was bringt sie der Biologie? Frage: Nur bei wenigen Biomolekülen reicht die Energie von Licht zur Anregung aus. Was tun? Wenn es keine spontane Eigen- (auch Auto-)fluoreszenz gibt, muss man die Struktur von Interesse mit fluoreszie-renden Farbstoffen (Fluorochromen) anfärben. Die Spezifität kommt dabei von dem Zielmolekül: Antikörper (erkennt Protein, gegen das er hergestellt wurde) Spezifische Wirkstoffe (Phalloidin bindet Actinfilamente) Stengelquerschnitt der Nies-wurz. Oben Hellfeld, unten spontane Eigenfluoreszenz von Cumarylalkoholen (Vorstufe des Lignins) nach Anregung mit nahem UV. Moleküle mit ausgeprägten Wechselwirkungen (DAPI DNA) Mehr über Fluorochrome in folgender Vorlesung

6 2. Fluoreszenzmikroskop: Aufbau und Funktion DAS AUGE: sieht ein schwaches, aber sehr spezifisches Signal. Sperrfilter: läßt nur Grünlicht durch (wichtig bei Doppelfluoreszenzen). Anregungsfilter: isoliert BL Farbteiler: reflektiert kurzwelliges Licht (<515 nm), läßt langwelliges Licht (>515 nm) durch. Reflexion: BL, das nicht auf FITC trifft, wird am Präparat reflektiert. Lichtquelle: Quecksilber-Hochdruckdampflampe Fluoreszenz: FITC emittiert Grünlicht

7 2. Fluoreszenzmikroskop: Aufbau und Funktion Technische Details: Woher stammt das Anregungslicht? HBO-Lampe (Quecksilber-Hochdruck-Dampflampe) es werden viele Linien aus dem gesamten Spektrum erzeugt. Inzwischen immer mehr durch haltbarere Dioden-Arrays ersetzt.

8 2. Fluoreszenzmikroskop: Aufbau und Funktion Technische Details: Was bringt ein Farbteiler? Der Farbteiler (dichroitische Spiegel) reflektiert kurzwelliges Licht wird transmittiert langwelliges Licht. Trenn-Wellenlänge über Schichtdicke und Brechungsindices einstellbar. Fazit: Es gäbe keine Epifluoreszenz ohne Farbteiler!

9 2. Fluoreszenzmikroskop: Aufbau und Funktion Technische Details: Wie funktioniert das? Von Schmetterlingen lernen Das (kurzwellige) Anregungslicht trifft seitlich auf und wird daher nach unten zum Objektiv reflektiert Das (langwellige) Emissionslicht vom Präparat wird durchgelassen. Prinzip: Interferenzfilter über Schichtdicke und Brechungsindex wird die Trenn-Wellenlänge eingestellt.

10 Intermezzo: Denken Sie mal nach! Sie finden Ihren Filtersatz zerlegt vor. Wie finden Sie heraus, welcher Filter der Farbteiler ist? A B C D Photometer: Filter mit dem kurzwelligsten Spektrum Photometer: Filter mit dem langwelligsten Spektrum Filter ändert Farbe je nach Blickwinkel Licht ändert Farbe, wenn man durchschaut

11 2. Fluoreszenzmikroskop: Aufbau und Funktion Technische Details: warum sind Fluoreszenzobjektive so teuer? Objektive sind gleichzeitig der Kondensor! Intensität des Signals wächst mit der 4. Potenz der NA Um nahes UV durchzulassen (für DAPI) Flußspat statt Glas

12 3. Konfokalmikroskopie Was bringt Konfokalmikroskopie? :=unfokussiertes Licht wird entfernt. Dadurch kann das Objekt optisch geschnitten werden, obwohl es physisch intakt bleibt. Dadurch wird die dritte Dimension zugänglich. Gehirn von Drosophila konventionell versus konfokal. Konfokaler z-stapel durch eine Tabakzelle, die einen GFP- Marker für Actinfilamente exprimiert. Projektion eines z-stapels für einen fluoreszenten Microtubulimarker im lebenden Hypokotyl of Arabidopsis thaliana)

13 3. Konfokalmikroskopie Wie ist ein Konfokalmikroskop aufgebaut? Photomultiplikator: das Signal ist für das Auge zu schwach Bilderzeugung ist sequentiell, nicht simultan Lochblende: nur Licht aus der Fokusebene kann durch Lichtquelle: Laser (stark, aber nur bestimmte Wellenlängen verfügbar). Scanner: zwei rotierende Spiegel, die den Strahl über das Präparat wandern lassen.

14 3. Konfokalmikroskopie Technische Details: der Laser HBO-bulb Ar-laser Vorteil: starke, spezifische Anregung Nachteil: teuer, verschiedene Laser nötig Zum Nachdenken: warum brauche ich überhaupt einen Laser?

15 3. Konfokalmikroskopie Technische Details: Wozu dient die Lochblende? Durch simple Geometrie wird nicht-fokussiertes Licht nicht durchgelassen. Lochblende eng Lochblende weit ACHTUNG!! 1 2 Z-Achse 1 2 A B X-Achse 1 und 2 in Z-Richtung voneinander getrennt. Wenig Licht, aber gute Konfokalität 1 und 2 in Z-Richtung nicht voneinander getrennt. Viel Licht, aber schlechte Konfokalität A und B in X-Richtung voneinander getrennt. Die Auflösung hängt NUR VOM OBJEKTIV ab (ABBÉSCHES GESETZ) Doch dies schluckt sehr viel Signal trotz starker Laser braucht man einen photomultiplier das Auge würde nicht reichen.

16 3. Konfokalmikroskopie Technische Details: Wie geht man mit thermischem Rauschen um? Problem: Der photomultiplier muss so empfindlich sein, dass er auch auf das thermisches Rauschen in der Photodiode reagiert. Dies führt zu Signalen, die gar nicht auf die Fluoreszenz zurückgehen. Ansatz: Averaging jede z-ebene wird mehrfach abgerastert und die Bilder dann überlagert. Rauschen ist zufällig und mittelt sich weg, echte Signale werden aufsummiert. Grenzen: in lebenden Präparaten ändert sich das Bild während des Rasterns, ausserdem wird das Präparat durch das mehrfache Rastern stärker gebleicht.

17 3. Konfokalmikroskopie Was bringt ein Zweiphotonen-Laser? Konventionelle Konfokalmikroskopie: Anregung (und Bleichung!) überall, Konfokalität durch Wegfiltern des Ausgangssignals. Lochblende eng Lochblende weit Zweiphotonen-Laser: Bestrahlung mit Infrarotlicht, Konfokalität durch Begrenzung der Anregung auf den Fokus Photon A (800 nm) ACHTUNG!! Photon B (800 nm) und 2 in Z-Richtung voneinander getrennt. Wenig Licht, aber gute Konfokalität Z-Achse und 2 in Z-Richtung nicht voneinander getrennt. Viel Licht, aber schlechte Konfokalität Nur im Fokus addieren A Bsich 1 die Energien X-Achse der Laser zur für die Anregung ausreichenden Energie A und B in X-Richtung voneinander getrennt. Die Auflösung hängt NUR VOM OBJEKTIV ab (ABBÉSCHES GESETZ) Summe (=400 nm)

18 3. Konfokalmikroskopie Two-Photon Laser Microscopy Wozu? Anregung nur im Fokus. Bleichung und thermische Belastung gering Schonende Langzeitbeobachtung möglich Ebenen der Spezifität Weitfeld: Anregung global, Auslesen global CLSM: Anregung global, Auslesen fokussiert Two-Photon: Anregung und Auslesen fokussiert Electrophysiologie und nichtinvasive 2-Photon-Microscopy im Neocortex einer lebenden Maus.

19 Anwendung 1: FRET und Protein-Interaktion Was bringt FRET (:= Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer)? FRET erlaubt es, Distanzänderungen von 2 Fluorochromen zu sehen FRET-Effizienz sinkt mit r 6 (Förster- Distanz) <1-8 nm Damit lassen sich Protein-Protein- Interaktionen in vivo messen.

20 Anwendung 1: FRET und Protein-Interaktion Was bringt FRET (:= Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer)? Klassisches Beispiel: Adhäsionsplaques in Fibroblasten (Labor Beni Geiger, Weizman, Israel) Problem: Mehrere actinbindende Proteine sind daran beteiligt, lichtmikroskopisch läßt sich jedoch nicht auflösen, wie diese zusammenhängen. Ansatz: durch paarweisen Nachweis mit fluoreszenten Antikörpern (FITC / Rhodamin) konnte man über FRET die Reihenfolge festmachen: Actin Actinin Vinculin Talin

21 Anwendung 2: FRAP und Protein-Dynamik Was bringt FRAP (:= Fluorescent Recovery After Photobleaching)? Damit läßt sich innerzelluläre Dynamik sichtbar und meßbar machen. Die Beobachtungsstelle (ROI:=region of interest) wird mit dem Laser gebleicht. Durch Einwanderung fluoreszierender Moleküle wird die Struktur wieder sichtbar. Je höher die Dynamik, umso schneller wird die Einwanderung. Beispiel: fluoreszent markierte Mikrotubuli in einer Epidermiszelle vor und nach der Bleichung. Die Lebensdauer pflanzlicher Mikrotubuli liegt bei 60 Sekunden (Yuan et al. 1994, Himmelspach und Nick 1999).

22 Anwendung 2: FRAP und Protein-Dynamik Was bringt FRAP (:= Fluorescent Recovery After Photobleaching)? Fallbeispiel: FRAP-Analyse im Zellkern einer Rattenzelle: GFP als Negativkontrolle zeigt Diffusion an. Histon 2B-GFP als DNS-gebundenes Protein zeigt kein FRAP Retinoblastoma-Protein-GFP zeigt starkes FRAP, ist also sehr dynamisch

23 Anwendung 3: Apotom und TIRF Gibt es Konfokalmikroskopie ohne Laser? Apotom hier wird die Konfokalität durch ein Gitter erzeugt, dadurch wird weniger Signal verloren als bei einer Lochblende hier kommt man ohne Laser aus, das Bild kann simultan erzeugt werden. Prinzip: Das Gitter wird in das Präparat hineinprojiziert und dann das Bild des Gitters über das Präparat bewegt. Es werden drei Bilder aufgenommen. Bildpunkte, die nicht aus der Fokusebene stammen, werden in allen drei Bildern gleich hell sein, Bildpunkte aus der Fokusebene werden dagegen ihre Intensität ändern. Das kann nun automatisch erkannt und korrigiert werden, so dass nur die Bildpunkte aus der Fokusebene übrigbleiben.

24 Anwendung 3: Apotom und TIRF Beispiel: Dreifachfärbung von Fibroblasten Mikrotubuli rot, Kerne blau, Adhäsionsplaques grün. Links: konventionelle Bildaufnahme, rechts: Apotom.

25 Anwendung 3: Apotom und TIRF Ganzkörper-Mikroskopie mit dem Apotom: Cnidarienlarven

26 Anwendung 3: Apotom und TIRF Kann man die Auflösung steigern? In xy-richtung nicht die Auflösung wird begrenzt durch die Wellenlänge des sichtbaren Lichts (Abbésche Formel). In z-richtung schon durch die Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRF). TIRF nutzt das Phänomen der Totalreflektion an der Grenze zwischen Präparat und Glas. Das meiste Licht wird reflektiert, aber ein kleiner Teil dringt ins Präparat ein (sogenanntes evaneszentes Feld).

27 Anwendung 3: Apotom und TIRF Das evaneszente Feld kann nur wenige 100 nm ins Präparat eindringen und dort das Fluorochrom anregen. Damit kann man Signale auffangen, die in z-richtung bis auf 100 nm begrenzt sind (zum Vergleich: die z- Auflösung im Konfokalmikroskop liegt bei 500 nm!) TIRF erlaubt es damit, sogar einzelne Moleküle nahe der Oberfläche einer Zelle sichtbar zu machen.

28 Anwendung 3: Apotom und TIRF Beispiel für den Einsatz von TIRF TIRF-Aufnahmen von GFP-markiertem Actin auf der Oberfläche eines Fibroblasten zeigt eine hochdynamische Population von Mikrofilamenten ( Actinwürmer ), die man vorher noch nicht kannte. (Bilder von Roland Wedlich-Söldner, GSF, München)

29 Intermezzo: Denken Sie mal nach! In einer Publikation finden Sie TIRF-Bilder vom Cytoskelett von Pflanzen. Glauben Sie das? A B C D JA: Weil die Plasmamembran ja nur 30 nm dick ist NEIN: Weil die Zellwand >1 µm dick ist JA: Weil das Cytoskelett außen aufliegt JEIN: Nur, wenn man Protoplasten untersucht

30 Perspektiven: Jenseits der Auflösungsgrenze Auflösungsgrenze Auflösung zweier Punkte hängt von Wellenlänge ab Abbés Formel: D = l / n. sina D minimaler Abstand, l Wellenlänge, n Brechungsindex, a Aperturwinkel 6. This allows to quantify fluorescent molecules on the cellular level. Brechung begrenzt Auflösung. Weil Licht eine Welle ist, können 2 Punkte nur dann aufgelöst werden, wenn sie getrennte Signale liefern. Die Auflösungsgrenze ist in etwa bei der Größe von Zellorganellen. Das Reich der Viren und Proteinkomplexe bleibt unsichtbar (von Huang 2010). l is >450 nm, sina <1, Immersionsöl n=1.41. Auflösung >250 nm in xy, und 550 nm in z-richtung. Strategie: Grenze schieben durch strukturierte Beleuchtung, d.h. Anregung auf < 250 nm!

31 Perspektiven: Jenseits der Auflösungsgrenze 4p Mikroskopie Prinzip der Interferenz begrenzt Anregung auf eine Region, die kleiner ist als l. Zwei Objektive gegenüber in fixierter Position die Probe wird in z-achse bewegt. Objektive sind so eingestellt, dass die 2 Wellen außerhalb der (sehr kleinen) Fokusebene miteinander interferieren. Z-Auflösung <100 nm!

32 Perspektiven: Jenseits der Auflösungsgrenze STED Mikroskopie (=stimulated emission depletion) Prinzip der Interferenz, um Anregung auf Region <l zu begrenzen. Ein Objektiv, aber zwei Laser: Anregung und Löschlaser Durch Interferenz löscht der zweite Laser die Anregung außerhalb eines winzigen zentralen Bereichs. Auflösung von ~20 nm in xy und in z!

33 Perspektiven: Jenseits der Auflösungsgrenze Beispiel für STED Mikroskopie CLSM und STED in humanen Glaukom-Zellen. Innere Mitochondrien- Membran mit ATPase in vivo using STED (war bisher nur durch TEM sichtbar!)

34 Perspektiven: Jenseits der Auflösungsgrenze 3D stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) Synonym: PALM Prinzip: Photoaktivierbare Sonde, die zwischen fluoreszentem und nicht-fluoreszentem Zustand wechselt. Man bestimmt die Position in den 3 Raumdimensionen und nutzt die Information aus der zeitlichen Änderung, um die Signalwolke, die durch ein Molekül erzeugt wird durch eine Gauss- Verteilung zu bestimmen (point spread function). Maximale Präzision <20 nm!

35 Perspektiven: Jenseits der Auflösungsgrenze Beispiel für PALM/STORM Mikrotubuli in Säugerzelle. Links konventionelle CLSM fluorescence microscopy, rechts PALM/STORM Farben geben Tiefe in z-achse an.

36 Perspektiven: Jenseits der Auflösungsgrenze Wie macht man es? Prinzip: wenige Moleküle (<1 %) werden aktiviert, ausgelesen, lokalisiert und gebleicht Zyklus wird vielfach wiederholt, immer mit einem anderen Subset Geringe Aktivierung: nur einzelne Moleküle leuchten. Das erlaubt es, aus der Punktwolke die Position des Moleküls genau zu definieren.

37 x pos / µm x pos / µm x pos / µm Perspektiven: Jenseits der Auflösungsgrenze µm y pos / µm µm PALM 35 des 40 perinukleären Actinkorbs 55 mit dem psred-lifeact Marker. Zum y pos / µm y pos / µm Vergleich ein Weitfeldbild. Rechts sieht man zwei Tochterkerne unmittelbar nach der Telophase. Dieser Actinkorb kommt nur bei Pflanzen vor (tierische Zellen haben stattdessen ein Laminingerüst!) PALM in Pflanzenzellen Die ersten PALM Bilder in lebenden Pflanzenzellen mit 20 nm Auflösung! (Kooperation AG Nienhaus, Physik und AG Nick, Botanik) Rekonstruktion aus Einzelaufnahmen

38 Die Take-Home Question Wir sehen nun, was wir vorher nicht sahen schön ABER: Was brauchen wir, damit die neuen Wahrnehmungen uns Nutzen bringen?