Aus der Klinik und Poliklinik für Urologie und Kinderurologie der Universität Würzburg Direktor: Universitäts-Professor Dr. med. H.
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1 Aus der Klinik und Poliklinik für Urologie und Kinderurologie der Universität Würzburg Direktor: Universitäts-Professor Dr. med. H. Riedmiller MicroRNA-221 reguliert PMEPA1 und moduliert den TGFß-Signalweg im Prostatakarzinom Inaugural - Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Julius-Maximilians-Universität Würzburg vorgelegt von Philip Paul Herreiner aus Dietmannsried Würzburg, Mai
2 1 EINLEITUNG Inzidenz und Diagnostik des Prostatakarzinoms MicroRNAs und ihre regulatorische Funktion MicroRNA Expressionsprofile in Tumoren MicroRNA Expressionsprofile im PCa TGFß Der tumorsuppressive TGFß/Smad-Signalweg TGFß als Tumorpromotor Die Konversion von TGFß vom Tumorsuppressor zum Tumorpromotor Die Bedeutung von TGFß für die epithelial-mesenchymale Transition PMEPA PMEPA1 als T umorsuppressor PMEPA 1 als onkogenes Regulatorprotein 10 2 FRAGESTELLUNG 13 3 MATERIAL UND METHODEN Material Zellkultur Zelllinien Zellkulturmedien Chemikalien und Biochemikalien Zellkulturreagenzien Chemikalien für molekularbiologische Experimente Primer für quantitative Real-Time PCR 18 1
3 Angesetzte Puffer und Lösungen Antikörper Geräte und Verbrauchsmaterialien Software Methoden Sterilisation der verwendeten Materialien und Lösungen Kultivierung der Tumorzelllinien Transiente Transfektion Vitalitätsassay Zellemte RNA-lsolierung und Bestimmung der RNA-K.onzentration Bestimmung der mrna Expression mittels quantitativer Real-Time PCR Reverse Transkription qrt-pcr Proteinisolierung und Bestimmung der Proteinkonzentration Bestimmung der Proteinexpression SDS-PAGE Western Blot Dual Reporter Luciferase Test Allgemeines Klonierung und Plamsidisolation Transfektion Vermessung Datenverarbeitung Datenverarbeitung für Vitalitätsassay Datenverarbeitung für Western Blot 34 2
4 Datenverarbeitung für qrt-pcr Datenverarbeitung für Dual Reporter Luciferase Test Statistik 35 4 ERGEBNISSE PMEPA1 als Zielgen der mir Analyse der mir-221 kontrollierten PMEPA1 Expression auf mrna-ebene Ermittlung der Transfektionseffizienz nachpre-mir-221 -Transfektion Analyse der PMEPA 1 Expression in pre-mir-22/-transfizierten Zellen Vergleich der mir-221- und PMEPA 1 Expression in PCa-Zelllinien Analyse der mir-221-kontrollierten PMEPA1 Expression auf Proteinebene Vorhersage potentieller mir-221 Zielgene in Internetdatenbanken Analyse der Interaktion von mir-221 mit PMEPA 1 im Dual Reporter Luciferase Test Einfluss von mir-221 Überexpression und exogener TGFß-Zufiihr auf das Proliferationsverhalten von PC3- und RWPE-l-Zellen Analyse des Proliferationsverhaltens von RWPE-l-Zellen Analyse des Proliferationsverhaltens von PC3-Zellen Ex v/vo-analyse von mir-221 und PMEPA 1 im Primärtumorkollektiv Beschreibung des Primärtumorkollektivs Analyse der mir-221- und PMEPA 1 Expression im primären PCa und im assoziierten nicht-tumorösen Gewebe Analyse der Assoziation und Korrelation von mir und PMEPA 1 Expression im Tumorkollektiv 53 5 DISKUSSION PMEPA1 als Zielgen der tumorsuppressiven mir-221 im PCa 56 3
5 5.2 Die mir-221 vermittelte PMEPA1 Regulation und ihr Einfluss auf die Kontrolle des Zellwachstums in PCa-Zellen MiR-221 verstärkt in PCa-Zelllinien den TGFß vermittelten Effekt auf das Proliferationsverhalten Die PMEPA1 Expression ist im primären PCa erhöht und korreliert signifikant mit Herabregulation der mir Mechanismus des mir-221 regulierten Einflusses von PMEPA1 auf die Tumorgenese und -progression Der TGFß-Antagonismus als potentielle antikarzinogene Therapie 65 6 ZUSAMMENFASSUNG 67 7 LITERATURVERZEICHNIS 69 8 DANKSAGUNG 79 9 LEBENSLAUF 80 4
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