peqgold RNA Pure FL Methode zur Isolierung von RNA aus flüssigen Proben

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1 peqgold RNA Pure FL Methode zur Isolierung von RNA aus flüssigen Proben Lot-Nr. Best.-Nr ml ml ml Lagerung: Lichtgeschützt bei 4 C für 12 Monate haltbar. Einleitung Die zeitsparende Isolierung reiner und nicht-degradierter RNA ist eine Voraussetzung für viele molekularbiologische Experimente. Chirgwin et al. 1 zeigten, daß durch eine Zentrifugation mit Guanidinisothiocyanat und LiCl aus vielen Geweben gute RNA-Ausbeuten erzielt werden können. Bei Zellen oder Geweben mit einem hohem RNase-Gehalt kommt es bei dieser Methode jedoch häufig zu Problemen. peqgold RNAPure FL ist eine Weiterentwicklung ursprünglicher Reagenzien und Protokolle. In einer einfach durchzuführenden 1-Schritt-Präparation kann in 1 bis 2 Stunden aus flüssigem Probenmaterial unterschiedlichster Herkunft saubere RNA isoliert werden. Die erhaltenen RNA ist von hoher Qualität, nahezu nicht degradiert und weitgehend frei von DNA- und Proteinkontaminationen. Sie enthält das ganze Spektrum von RNA-Molekülen, einschließlich sehr kleiner RNAs (4-5 S). Northern Blottings, Dot- Blot-Hybridisierungen, Poly(A) + -Selektionen zur mrna-isolierung, cdna-synthesen, in-vitro- Translationen und RNase-Protection-Assays können direkt anschließend an die Präparation durchgeführt werden. Extrakte zahlreicher Zellsorten beinhalten in der endgültigen RNA-Fraktion noch Material unbekannter Zusammensetzung mit einem hohen Polysaccharidanteil. Dieses Material ist in wäßrigen Guanidinisothiocyanatlösungen und Wasser löslich sowie in Alkohol unlöslich. Es bildet DNA-ähnliche Fäden und hat eine den Nukleinsäuren vergleichbare UV-Absorption. Dadurch führt es zu falschen Berechnungen des RNA-Gehaltes, was bei Hybridisierungen und Enzymreaktionen zu Problemen führen kann. Darüber hinaus verschlechtert es die RNA-Qualität und hat inhibitorische Effekte auf RT- PCRs. Zellen verschiedener Entwicklungsstadien enthalten unterschiedliche Mengen dieses kontaminierenden Materials. Die einfache Erweiterung der peqgold RNAPure -Methode durch eine anschließende peqgold OptiPure -Reinigung entfernt derartige Verunreinigungen. Warnung: peqgold RNAPure enthält die gesundheitsschädlichen Stoffe Phenol und Guanidinisothiocyanat. Das Arbeiten mit peqgold RNAPure darf nur mit Handschuhen und Schutzbrille unter einem Abzug erfolgen. Sollte es dennoch zu einem Kontakt von peqgold RNAPure mit der Haut oder den Augen kommen, sind die betroffenen Stellen für mindestens 15 Minuten unter fließendem Wasser zu waschen. Begeben Sie sich anschließend umgehend in ärztliche Behandlung. Dieses Produkt ist ausschließlich für Forschungszwecke geeignet. Eine Verwendung für diagnostische Zwecke oder als Arzneimittel sowie eine Verabreichung an Menschen oder Tiere ist nicht gestattet. PEQLAB_v0815_D 1

2 Gefährliche Inhaltsstoffe Bestandteile Signalwort / Symbole Gefährliche Inhaltsstoffe H- und P-Sätze RNAPure FL DANGER Phenol 30-60%, Guanidinium thiocyanate 10-30%, 2- Mercaptoethanol <1%, CAS: , , H341, H301+H311+H331, H373, H314, H412, EUH032, P201, P280, P273, P301+P330+P331, P302+P352, P304+P340, P307+P310 H- und P-Sätze Erläuterungen H341 H301+H311+H331 H373 H314 H412 EUH032 P201 P280 P273 P301+P330+P331 Kann vermutlich genetische Defekte verursachen (Expositionsweg angeben, sofern schlüssig belegt ist, dass diese Gefahr bei keinem anderen Expositionsweg besteht). Giftig bei Verschlucken, Hautkontakt oder Einatmen. Kann die Organe schädigen (alle betroffenen Organe nennen) bei längerer oder wiederholter Exposition (Expositionsweg angeben, wenn schlüssig belegt ist, dass diese Gefahr bei keinem anderen Expositionsweg besteht). Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden. Schädlich für Wasserorganismen, mit langfristiger Wirkung. Entwickelt bei Berührung mit Säure sehr giftige Gase. Vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen. Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/Gesichtsschutz tragen. Freisetzung in die Umwelt vermeiden. BEI VERSCHLUCKEN: Mund ausspülen. KEIN Erbrechen herbeiführen. P302+P352 P304+P340 P307+P310 BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT: Mit viel Wasser/ waschen. BEI EINATMEN: Die Person an die frische Luft bringen und für ungehinderte Atmung sorgen. Bei Exposition: Sofort Giftinformationszentrum oder Arzt anrufen Extraktionsmethode mit peqgold RNAPure FL Benötigte Reagenzien, die nicht mitgeliefert werden: Chloroform Isopropanol EtOH Hochwertige Polypropylen-Zentrifugenröhrchen (Zentrifugation mit Phenol bei x g!!!) PEQLAB_v0815_D 2

3 Die RNA-Isolierung mit peqgold RNAPure FL besteht aus folgenden Schritten: 1. Homogenisierung 0.75 ml peqgold RNAPure FL ml Probe 2. RNA-Extraktion Homogenat ml Chloroform 3. RNA-Präzipitation wäßrige Phase ml Isopropanol 4. Waschen der RNA 70 % Ethanol Homogenisierung a. Biologische Flüssigkeiten: 0.75 ml peqgold RNAPure FL mit 0.25 ml Probe oder 5-10 x 10 6 Zellen mischen und Zellen durch mehrmaliges Aufziehen mit einer Pipette lysieren. b. Gewebesuspension: 0.75 ml peqgold RNAPure FL mit 0.25 ml Probe in einem Glas-Teflon- oder einem Polytron-Homogenisator homogenisieren. Proben mit einem zu geringen Volumen sollten mit Wasser auf 0.25 ml aufgefüllt werden. RNA-Extraktion Pro 1 ml Homogenat 0.2 ml Chloroform zugeben, 15 Sekunden kräftig schütteln und für 5 Minuten auf Eis inkubieren. Anschließend die Probe für 15 Minuten bei x g (4 C) zentrifugieren um eine Phasentrennung zu bekommen. Es bilden sich drei Phasen: eine untere gelbe Phenol-Chloroform-Phase, eine obere farblose wässrige Phase und eine dazwischenliegende Interphase. Die RNA ist ausschließlich in der wässrigen Phase angereichert, während sich die DNA und die Proteine in der Interphase und der Phenolphase befinden. Die wässrige Phase nimmt dabei ca. 70 % des Probenvolumens ein. RNA-Präzipitation Die wäßrige Phase in ein neues Röhrchen überführen und pro 0.75 ml eingesetztem peqgold RNAPure FL 0.5 ml Isopropanol zugeben, mischen und für 15 Minuten bei 4 C inkubieren. Anschließend 15 Minuten bei x g und 4 C zentrifugieren. Am Boden des Röhrchens setzt sich das weiß-gelbe RNA-Präzipitat ab. Waschen der RNA Überstand abnehmen und das RNA-Pellet in 70% Ethanol waschen und anschließend für 8 Minuten bei x g (4 C) zentrifugieren. Falls das Pellet noch Phenol-Geruch aufweist, sollte der Waschschritt wiederholt werden. Pro µg RNA werden ca. 0.8 ml Ethanol benötigt. Lösen der RNA Das RNA-Pellet kurz an der Luft oder durch Anlegen eines leichten Vakuums trocknen lassen. Ein vollständiges Trocknen des Pellets verschlechtert die Löslichkeit der RNA und sollte deshalb vermieden werden. Die RNA nicht durch Vakuumzentrifugation trocknen lassen!!! Die RNA durch mehrmaliges Auf- und Abziehen mit der Pipette in deionisiertem Formamid, RNasefreiem Wasser oder in 0.5 %igem SDS lösen. Ein Erhitzen der RNA-Lösung auf C verbessert die Lösbarkeit. Um eine Kontamination mit RNasen zu verhindern sollten Wasser und SDS-Lösungen, die zum Lösen der RNA eingesetzt werden, vorher mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandelt werden. PEQLAB_v0815_D 3

4 Die erhaltene RNA-Lösung ist frei von DNA und Proteinen und hat in der Regel einen A 260/280- Quotienten zwischen 1,6 und 2,9. Anmerkungen 1. Um RNase-Kontaminationen zu vermeiden, sollten während der gesamten Extraktion Handschuhe getragen und ausschließlich RNase-freie Lösungen und Geräte verwendet werden. 2. Erwartet man nur geringe Mengen von RNA (< 10 µg) sollten pro 0.75 ml peqgold RNAPure FL 50 µg Glykogen als Carrier zugesetzt werden. Proben mit einem zu geringem Volumen sollten mit Wasser auf 0.25 ml aufgefüllt werden. 3. Nach der Homogenisierung und vor der Zugabe von Chloroform können die Proben für einige Monate bei 70 C gelagert werden. Das RNA-Präzipitat kann nach dem Waschen der RNA für 1-3 Wochen bei 4 C in 75 %igem Ethanol oder bis zu einem Jahr bei 20 C gelagert werden. 4. Um RNA aus Monolayer-Zellen zu isolieren, werden ml peqgold RNAPure FL pro 100-cm 3 -Zellkulturschale verwendet. In diesem Fall sollten die Proben nicht mit Wasser verdünnt werden. Die an den Zellen und der Kulturschale verbliebenen Mediumreste reichen aus, um ein Verhältnis von 3:1 zu erhalten. 5. Bei der Verwendung von Proben mit hohem Gehalt an Proteinen, Polysacchariden, Fetten oder anderen Bestandteilen ist ein Extra-Reinigungsschritt ratsam. Vor der Phasentrennung mit Chloroform werden die unlöslichen Bestandteile durch einen Zentrifugationsschritt für 10 Minuten bei x g und 4 C entfernt. Der Überstand enthält die RNA, während im Pellet die Polysaccharide, extrazellulären Membranbestandteile und hochmolekularen DNAs lokalisiert sind. Bei Proben aus fettreichem Gewebe kommt es zur Bildung einer schaumartigen Fettschicht, die entfernt werden sollte. Der klare, RNA-haltige Überstand wird in ein neues Röhrchen überführt und die Phasentrennung wie beschrieben durchgeführt. 6. Ein hoher Gehalt an kontaminierendem Material kann auch durch eine Verdünnung der Probe mit Wasser vermieden werden. Dieses Verfahren ist bei Extraktionen von RNA (und DNA) aus Vollblut oder Serum üblich. Eine 1:1-Verdünnung mit Wasser ist dabei ausreichend. Anschließend wird nach dem Standardprotokoll verfahren. Erfahrungsgemäß können aus 1 ml Blut ca µg RNA extrahiert werden. PEQLAB_v0815_D 4

5 Troubleshooting Guide Erwartete RNA-Mengen pro mg Gewebe oder 10 6 Zellen Leber und Milz 6-10 µg Niere 3-4 µg Skelettmuskulatur und Gehirn µg Plazenta 1-4 µg Epithelzellen 8-15 µg Fibroblasten 5-7 µg RNA-Menge zu gering: Unvollständige Homogenisierung oder unvollständige Lyse RNA-Pellet nicht vollständig gelöst A 260/280-Quotient < 1.65: Probe wurde in zu geringem Volumen homogenisiert Probe wurde nach der Homogenisierung nicht bei Raumtemperatur gelagert Die wäßrige Phase war mit der Phenolphase kontaminiert RNA-Pellet nicht vollständig gelöst RNA-Abbau: Blut oder Zellen wurden nicht direkt zur Extraktion verwendet oder nicht direkt eingefroren Zellen wurden durch Trypsinieren zerstört Kontamination mit RNase während der Präparation Die verwendeten Proben wurden nicht bei 70 C gelagert Bei der Elektrophorese lag der ph-wert der Formaldehydlösung unter 3.5 Verringerung von Scherkräften verbessert das 18S und 28S Verhältnis der isolierten RNA DNA-Kontamination: Probe wurde in zu geringem Volumen homogenisiert Die zur Extraktion verwendeten Proben enthielten organische Lösungen z.b. Ethanol, DMSO, konzentrierte Puffer oder hatten einen alkalischen ph-wert Literatur 1. Chirgwin J.M. et al. (1979): Biochemistry 18, Devinoy E.I. et al. (1989): Reprod. Nutr. Develop. 28, Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrock J. (1982): Molecular Cloning, Cold spring Harbor Laboratory, PEQLAB_v0815_D 5