Biochemische Übungen I: Proteine I Fällung und Konzentrationsbestimmung

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1 Biochemische Übungen I: Proteine I Fällung und Konzentrationsbestimmung Lerninhalt: Allgemeine Proteineigenschaften (Löslichkeit, Ladung, Hydrophobizität). Native Fällung: Aussalzen mit Ammoniumsalz. Denaturierende Fällung: Ausfällen mit Trichloressigsäure. Proteinbestimmung: Bradford-Färbung Hintergrund: Die Fällung (Präzipitation) von Proteinen ist eine der ersten Techniken, die zur Reinigung von Proteinen eingesetzt wurde. Die Methode beruht auf der Interaktion von präzipitierenden Agenzien mit den in Lösung befindlichen Proteinen. Diese Agenzien können relativ unspezifisch sein und praktisch alle Proteine aus einer Lösung ausfällen, was in den ersten Schritten eines Reinigungsganges zur Gewinnung der Gesamtproteine aus einem Zelllysat eingesetzt wird. Die Fällung kann aber auch so durchgeführt werden, daß eine Fraktionierung der Bestandteile einer Lösung möglich wird (Beispiel Kohn- Fraktionierung von Plasma zur großtechnischen Herstellung von Plasmaproteinen aus Blutplasma durch fraktionierte Fällung mit kaltem Ethanol). Neben der Effizienz einer Fällung sollten auch immer weitere Aspekte beachtet werden: Wird die biologische Aktivität durch das Fällungsmittel und die Fällungsbedingungen beeinträchtigt? Die biologische Aktivität beruht auf einer bestimmten molekularen und räumlichen Struktur. Wird sie zerstört, spricht man von Denaturierung, diese ist oft irreversibel (siehe Denaturierende Fällung). Um Denaturierung zu vermeiden, muss man in der Praxis den Einsatz einiger Reinigungsverfahren von vornherein ausschließen und nicht denaturierende, schonende Präzipitationsverfahren anwenden (siehe Native Fällung) Unter welchen Bedingungen kann das Fällungsmittel wieder entfernt werden? Die Eigenschaften eines Salzes, Proteine zu fällen, ist in der Hofmeister-Serie beschrieben. Dabei sind die weiter links stehenden (sog. antichaotropen) Salze besonders gute und schonende Fällungsmittel. Sie vergrößern hydrophobe Effekte in der Lösung und fördern Proteinaggregation über hydrophobe Wechselwirkungen. Die weiter rechts stehenden chaotropen Salze vermindern hydrophobe Effekte und halten Proteine in Lösung. Native Fällung Aussalzen mit Ammoniumsulfat Soll die biologische Aktivität des Proteins erhalten bleiben, so fällt man mit Ammoniumsulfat, Polyethylenglykol (PEG) oder mit organischen Lösungsmitteln (Aceton, Methanol oder Ethanol) bei tiefen Temperaturen. Die älteste und am häufigsten verwendete Methode, Proteine zu fällen, ist, sie durch Zugabe von Ammoniumsulfat ( (NH4)2SO4 ) auszusalzen. Proteine in Lösung bilden mit ihren exponierten polaren und geladenen Gruppen Wasserstoffbrücken mit den Wassermolekülen. Wird eine hohe Konzentration an stark geladenen Ionen wie

2 Ammoniumionen (NH4 + ) und Sulfationen (SO4 2- ) der Proteinlösung zugefügt, so hydratisieren die Salzionen und entziehen den Proteinen die Hydrathülle. Dies führt zur Aggregation der Proteine durch hydrophobe Wechselwirkung. Die Löslichkeit der Proteine wird so vermindert, was schlußendlich zur Präzipitation führt. Ammoniumsulfat wird portionsweise zur Proteinlösung zugegeben, wodurch eine fraktionierte Fällung und Anreicherung des protein of interest erzielt wird. Faktoren wie Anzahl und Position der polaren Gruppen, das Molekulargewicht der Proteine, ph-wert und Temperatur beeinflussen die Präzipitatbildung. (NH4)2SO4-Fällung wird für die Konzentration von Proteinlösungen >1mg/ml verwendet; aus verdünnten Lösungen fällt Ammoniumsulfat das Protein nur unvollständig. Ammoniumsulfatfällung hinterläßt große Mengen an oft unerwünschten Ionen, die über Ionenaustausch oder Dialyse (siehe Kurs 3) leicht wieder zu entfernen sind. Denaturierende Fällung Säurefällung mit Trichloressigsäure Eine schnelle und sehr effiziente Methode, um Proteine aus Lösungen auszufällen ist Fällung mit 10%-iger Trichloressigsäure (TCA). Mit dieser Methode können Proteinlösungen mit einer Konzentration >5µg/ml ausgefällt werden. Trichloressigsäurereste im Pellet entfernt man durch mehrmaliges Waschen mit eiskaltem 80%- igen Aceton. Das Präzipitat wird im gewünschten Puffer resuspendiert und nach Einstellen des ph weiterverwendet. Diese Methode denaturiert Proteine und wird daher vor allem zur Konzentrierung von Proben für die Gelelektrophorese oder vor enzymatischen Spaltungen verwendet. Konzentrationsbestimmung von Proteinen Eine leidvolle Erfahrung des angehenden Biochemikers ist die Unschärfe von Proteinbestimmungsmethoden. Die gleiche Proteinlösung gibt mit Test A ein anderes Ergebnis als mit Test B. Auch liefert der gleiche Test mit den gleichen Konzentrationen unterschiedlicher Proteine (z.b. 1 mg/ml BSA, Ovalbumin, Cytochrom C) verschiedene Werte. Des weiteren ist jede Proteinbestimmungsmethode störanfällig für Detergenzien oder bestimmte Ionen. Man gibt daher zum ermittelten Konzentrationswert auch den verwendeten Test und das Vergleichsprotein an. Die Methoden der Wahl sind Bradford-Test und BCA-Test. Für Membranproteine sollte man den BCA-Test verwenden, ansonsten ist der Bradford-Test vor allem wegen seiner Unempfindlichkeit gegenüber störenden Ionen und Reduktionsmitteln (DTT, Sorbitol) vorzuziehen. Bradford-Proteinassay von BioRad: Bei der Bindung von Coomassie brilliant blue G-250 an Proteine im sauren Milieu verschiebt sich das Absorptionsmaximum der Farbe (465nm ohne Protein, 595nm mit Protein). Die Zunahme der Absorption bei 595nm ist ein Maß für die Proteinkonzentration der Lösung. Der Bradford-Assay ist einer der einfachsten Proteinbestimmungstests; die käufliche, fertige Stammlösung bestehend aus Farbstoff, Ethanol und Phosphorsäure wird 1:5 mit Wasser verdünnt, zur Probenlösung hinzugegeben, und nach 10min bei Raumtemperatur wird die Absorption bei 595nm im Spektralphotometer gemessen.

3 Aufgabenstellung der Versuche: A. Anreicherung von Immunglobulinen aus Kälberserum durch Fällung mittels gesättigter Ammoniumsulfat- Lösung. B. Fällung von Kälberserum mit TCA Durchführung: A. Aussalzen mit Ammoniumsulfat Das Kälberserum (500µl in 2ml Eppendorf) wird zuerst mit 500µl gesättigter (NH 4 ) 2 SO 4 Lösung (=4.1M bei 25 C) versetzt. Dabei wird das Ammoniumsulfat langsam, unter ständigem Mischen am Vortex-Schüttler tropfenweise zugegeben, damit nicht eine lokale Überkonzentration von Ammoniumsulfat entsteht (wodurch unerwünschte Proteine ausfallen können). Nach vollständiger Zugabe wird eine Ammoniumsulfat-Endkonzentration von 2.05M (=50%) erreicht. Danach wird der Ansatz 5min bei g abzentrifugiert. Der das Albumin (und andere Serumproteine) enthaltende Überstand (~1ml) wird in ein neues 2ml Eppendorf überführt. Das die Immunglobulin-Fraktion enthaltende Pellet wird in 500µl Millipore Wasser gelöst. Beide Proben werden für die Proteinbestimmung (Punkt C) aufbewahrt. (!) Der Überstand und das gelöste Pellet müssen aufbehalten werden, die Proben werden im übernächsten Kurs nach erfolgter Entsalzung (nächster Kurs) über SDS- PAGE mit anschließender Coomassiefärbung analysiert.

4 B. Fällung mittels Trichloressigsäure (TCA) 100µl Kälberserum werden unter ständigem Mischen am Vortex-Schüttler tropfenweise mit soviel 10%-iger Trichloressigsäure versetzt, bis eine erste, bleibende Trübung sichtbar wird (ca. 3 Tropfen). Danach wird der Ansatz 5min. bei 4 C inkubiert und anschließend für 5min bei g abzentrifugiert. Überstand abpipettieren und aufbewahren, restl. TCA möglichst vollständig entfernen und Pellet 5min. offen trocknen lassen. Versuchen Sie das Pellet in 100µl Wasser zu lösen. Was beobachten Sie?

5 C. Bradford-Proteinbestimmung C1. Erstellen einer Eichgeraden Um anhand der gemessenen Absorptionswerte die Proteinmenge zu eruieren, wird eine Eichgerade mit BSA (Bovine Serum Albumin) erstellt. 2 Personen bereiten je eine Verdünnungsreihe (100µl pro Konzentration) aus einer 2mg/ml BSA-Lösung in Millipore Wasser vor: 200µl BioRad-Färbereagens (bereits fertig mit Wasser verdünnt) werden mit 10µl der BSA- Proteinverdünnung (je Konzentration 2 Ansätze) in einer 96well Mikrotiterplatte gründlich gemischt und 5min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Messung der Absorption erfolgt bei 595nm im Spektralphotometer. Als Referenz dienen 3 wells mit jeweils 200µl BioRad-Färbereagens. Das Photometer wird über das XFLOUR Menü in Excel gesteuert. Über den Menüpunkt Movements kann die Mikrotiterplatte ein- oder ausgefahren werden, mittels Start Measurement wird eine neue Messung gestartet. Errechen Sie den durchschnittlichen background aus den 3 background wells und ziehen Sie diesen Wert von den Meßwerten ab. Zeichnen Sie ein Diagramm mit der Absoption (Y-Achse) gegen die BSA Konzentration (X-Achse). Anhand dieses Diagramms läßt sich jetzt die Proteinkonzentration der unbekannten Proben ermitteln. BSA [mg/ml] (je 10µl messen) 2 OD(595nm) Messung 1 OD(595nm) Messung 2 Mittelwert OD(595nm)

6 C2. Bradford-Proteinbestimmung des Probenmaterials Je 10µl der Proben aus Fällung A werden analog zu Punkt C1 gemessen und anhand des Eichdiagramms die Proteinkonzentrationen Ihrer Proben ermittelt. Die Proben werden in Wasser verdünnt, so dass der Messwert im linearen Bereich der Standardkurve liegt. Es werden zwei verschiedene Verdünnungen ausgetestet und mit dem Messwert weitergearbeitet, der im optimalen Bereich der Eichgerade liegt. Der Messwert wird dann entsprechend dem Verdünnungsfaktor in die entsprechende Konzentration umgerechnet. Aus den Konzentrationen können Sie dann die Gesamtmenge an Ausgangsprotein im Serum und die Proteinmengen in den einzelnen Fraktionen berechnen, die zusammen eigentlich der Ausgangsmenge entsprechen müßten. Proben (je 10µl der Verdünung messen) Verdünnungsfaktor OD (595nm) Mittelwert Konzentration [mg/ml] Serum #1 1:100 #1 Gesamt Protein [mg] #2 1:200 #2 A. Pellet #1 1:20 #1 #2 1:50 #2 A. Überstand #1 1:20 #1 #2 1:50 #2 Die verbleibenden Proben aus Experiment A werden beschriftet und bei -20 C für die darauffolgenden Kursteile aufbewahrt. Sie brauchen auch die berechneten Konzentrationen Ihrer Proben für die späteren Kurse!

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