Methodik der Genomsequenzierung

Transkript

1 WS2012/2013 Genomforschung und Sequenzanalyse - Einführung in Methoden der Bioinformatik- Thomas Hankeln Methodik der Genomsequenzierung

2 Meilensteine Phi X bp λ Phage bp M. genitalium bp H. influenzae bp M. jannaschii bp S. cerevisae bp E. coli bp C. elegans bp D. melanog bp A. thaliana bp H. sapiens bp 2012 Geht die > 1000genomes Ära der Genomforschung project (human) zu soon Ende? > Genome 10K (vertebrates)

3 Methodik der Genomsequenzierung zu sequenzierende DNA muss zunächst in handliche Abschnitte zerlegt und dann vermehrt werden (beim Sanger-Verfahren durch Klonierung oder bei Next-Generation Sequencing (NGS) meist durch PCR) DNA kann mit dem klassischen Sanger-Verfahren in Teilabschnitten von Bp ( long reads ) sequenziert werden. NGS-Verfahren lesen derzeit meist kurz (z.b. 50 bis 250 Bp; = short reads ) oder auch mittel-lang ( Bp)

4 Re- vs. de novo-sequencing Martin JA, Wang Z, Nature Reviews Genetics 2011

5 Shotgun- Strategie

6 Shotgun-Methode: Wieviel? Lander and Waterman 1988, nach IMB Jena

7 Shotgun-Sequenzassemblierung Der klassische Ansatz de novo: ein Puzzle... Stücke anschauen, optisch vergleichen, > ausprobieren, wo sie denn passen passende Stücke zusammenfügen Overlap - Layout - Consensus

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9 Assemblierung der Gesamt- sequenz aus Einzel-Reads ATGGCCTCGTCAATGCATG CCGGTGCATGCATGGCCTCGTCAA Suche nach einander überlappenden Reads = local alignment ATGCGGTTGCTACGT ATCGGTGACCA ATTCATGCGGTTGC CGTCGTATCG GACCACGGTT TCATGCGG ACGTCGT TCGGTGACCACGGTT ATTCATG GGTTGCTAC CGTATCG ACCACGG ATTCATGCGGTTGCTACGTCGTATCGGTGACCACGGTT Rekonstruktion der Gesamtsequenz = multiple sequence alignment ( contig = contiguous sequence) sieht zunächst mal einfacher aus, als es ist.

10 Assemblierung von Sequenzen: suche den shortest common superstring Sequenz-Reads als Knoten Überlappung als Kanten Hamilton-Pfad passiert jeden Knoten nur einmal! Konsensus-String aus Hamilton-Pfad ergibt die gesuchte Gesamtsequenz. Aber: Dieses traveling salesman problem ist NP-schwer!!

11 HAMILTON PFAD: Probleme durch Repeats Repeat Repeat Repeat Jeder Sequenz-Read wird durch einen Knoten repräsentiert. Knoten aus Repeats sind mit vielen anderen Knoten assoziiert. Finde den Pfad, der jeden Knoten einmal passiert

12 Assemblierung von Sequenzen Aufgrund der zufälligen Orientierung der DNA-Integrate im Vektor bei der Klonierung (und der Sequenzierung eines Plasmids sowohl mit dem Forward-Primer als auch mit dem Reverse-Primer) werden beim shotgun-verfahren mal der Watson-DNA-Strang, mal der Crick-DNA-Strang sequenziert. Dies gilt im Prinzip auch für die per PCR hergestellten NGS-Reads. Da jeder Read von 5 nach 3 gelesen wird, haben die assemblierten Sequenzen unterschiedliche Pfeil-Orientierungen.

13 Assemblierung von Sequenzen Reads = { TTACTAC, TTTTATG, GCATGCC, TAAGGTT, ACCCCAG, GCATGCA } AACCTTACTACTGGGGTTTTATGCATGCATGCC TTGGAATGATGACCCCAAAATACGTACGTACGG Der Assembly-Algorithmus muss automatisch die Reads und ihre Reverse Complements vergleichen. Er schreibt dann allerdings nur einen Strang (wählbar) auf: AACCTTACTACTGGGGTTTTATGCATGCATGCC

14 Die Abdeckung der Gesamtsequenz erfordert eine Redundanz 3-fache Redundanz 8-fache Redundanz Ideal zur Absicherung der Sequenz an jeder Position ist eine Redundanz von 10x (Sanger) bzw x (NGS)! Problem: Aufwand, Kosten! (v. a. bei Sanger)

15 Umgang mit methodischen Fehlern ATGCCTTGACTGC-TT GAC-GCGTTGCTAAATGC CGTTGCGAAACGCTCGATGC GAAACGCTGGATGCAGTCGCGCGC ATGCCTTGAC t GCGTTGC GAAA CGCT sgatgcagtcgcgcgc Einzelsequenzen enthalten üblicherweise Fehler. Der Algorithmus muss also nach definierten Kriterien Reads alignen und danach eine Konsensus-Sequenz erstellen. > PHRED-Qualitätswerte benutzen!

16 Umgang mit Repeats Besonders problematisch, wenn > Repeats länger als Leseweite sind > Repeats fast identisch sind falsches alignment aufgrund starker Ähnlichkeit repetitiver Sequenzkopien 10 Überproportionale Redundanz im Alignment zeigt problematische Stellen mit Repeats an 20

17 Weitere Probleme des shotgun -Verfahrens physikalische Lücken : manche Sequenzbereiche lassen sich schlecht klonieren (Sanger!) andere Vektoren nehmen PCR statt Klonierung Sequenzierungslücken : manche Sequenzabschnitte (z.b. inverted repeats, stark GC-reiche DNA etc) lassen sich nicht sequenzieren andere Sequenziertechnik verwenden

18 Bitte umsteigen Roach, Genome Res. 5: 464 Die Kosten für das Schließen der letzten Lücken steigen exponentiell an!!! Umsteigen auf gerichtete Strategie (Primer Walking) ab 6-8x Redundanz bei Sanger-Projekten ab 100x Redundanz bei NGS

19 Weitere Probleme des klassischen shotgun -Verfahrens chimäre Matrizen: Beim Klonierungsprozess* werden eigentlich nicht-zusammenhängende Genomabschnitte artifiziell ligiert Wohin soll Sequenz 2 bei Assemblierung zugeordnet werden?? *nur relevant bei Sanger-Sequenzierung

20 Assemblierung: was tun? (OLC) 1. Vorprozessierung der Reads: Vektor-Anteile und ganz schlechte Abschnitte von Reads vorab entfernen > PHRED-Bewertung kontaminierende Sequenzen (z. B. aus E. coli) erkennen/ entfernen > z. B. BLAST gegen E. coli-sequenz

21 Assemblierung: was tun? > nicht alle Reads paarweise vergleichen (N 2 /2), d. h. paarweises SW-Alignment zu aufwändig > stattdessen ähnlich FASTA vorgehen (linearer Aufwand): 1. Erstellung eines k-mer-index jeder Sequenz 2. Sortieren der identischen k-mers: > häufige k-mers (repeats?) aussortieren > Reads mit mehreren passenden k-mers identifizieren > banded SW machen > falls Min-Score überschritten, ist paarweiser overlap für weiteres Assembly festgelegt

22 Assemblierung: was tun? Greedy algorithms beginnen mit besten Alignments, dann schrittweise die schlechteren (nutzerdefiniert) dazu nehmen. Kein richtiges MSA, sondern optimalen Pfad entlang der Reads suchen! (traveling salesman-graph)

23 Assemblierung: was tun? Assembly kontrollieren durch paired end -Information: Forward- und reverse-reads aus einem Klon oder einem PCR- Amplifikat (NGS) dürfen im Assembly nur in definiertem Abstand (= Insert- bzw. Amplikon-Größe) angeordnet sein!!! Passt dies nicht, so wird der Contig aufgelöst! Durch paired-end -Reads können zwei Contigs trotz Lücke dazwischen in korrekter Reihenfolge angeordnet werden (= scaffolding)!

24 Assemblierung: was tun? Chimäre Reads erkennen und auflösen: Chimärer Read Ein weiterer Read n existiert nicht > also Contig sicherheitshalber auflösen!!

25 Assemblierung: was tun? Fehler der Einzel-Reads automatisch korrigieren oder Contig auflösen:

26 Ein klassisches OLC-Programm (ARACHNE, Genome Res. 12: , 2002) Test: Assembly des 120 Mb-Drosophila-Genoms aus Reads mit 10facher Abdeckung aus Sanger-Reads (ca 1.7 Mio) 98% Überdeckung, 678 Contigs > 99,99% accuracy (d.h > 1 Fehler / Bp) ca. 1 Assembly-Fehler pro 1 Mb

27 Illumina HiSeq2000 flowcell with 8 lanes 22. Dez 2010

28 Pevzner et al. (2001) PNAS 98: 9748 Der traveling salesman wird ein chinese postman Hamilton Geht einmal jede Kante (Strasse), darf aber Knoten mehrfach besuchen. (= Euler-Pfad: Haus vom Nikolaus ) de Bruijn Graph Hierfür gibt es effiziente Lösungen mit linearem Aufwand!

29 Euler-Pfad-Assemblierung

30 Euler-based Assembly Tools

31 Sequencing technology: A million-fold improvement! Nature 458: 719 my diploma thesis: 1kb Maxam-Gilbert, 4 weeks (day & night in the isotope lab)

32 NGS technology: How to... tedious cloning high chemical costs slow electrophoresis PCR or even single molecules extreme miniaturisation massively-parallel read-out

33 Current Technologies (2nd Gen) 454 Roche LifeTech Ion Torrent Illumina good ol Sanger DNA matrix emulsion PCR emulsion PCR bridge PCR plasmid clones, PCR sequencing method seq-by-synthesis: Pyrosequencing seq-by-synthesis: proton release seq-by-synthesis: reversible Dye- Terminators seq-by-synthesis Dye-terminator 96 capillaries read length av. 600 bp (up to 1000) up to x 100 bp (up to 2x 250) up to 1200 bp reads up to 1.5 Mio up to 11 Mio up to 6 Billion 96 per run data up to 600 Mbp up to 1 Gbp up to 600 Gbp 0.1 Mbp runtime 10 hrs 90 min 11 days 2 hrs

34 1st step: Template production Example: emulsion PCR (454, Proton/PGM & SOLiD) Fragmentation Adapter ligation Water-in-oil emulsion ~1 ssdna/bead PCR with primers A and B 28 um bead

35 2nd step: Sequencing without gel separation Example: 454 Pyro-Sequencing (Ronaghi et al. 1996, 1998) Add 1 of 4 dntps if correct > PPi release PPi + Adenosine-5- Phosphosulfate (APS) > ATP ATP > LIGHT WASHING: Apyrase cleaves dntp and ATP

36 Pyro-Sequencing: Flowgram cyclic addition of the 4 nucleotides (T > A > C > G) The sequence of this flowgram reads: 5 -TCAGTAACTTTCG.-3 Problem: homopolymer runs > 6-8 nt

37 Life Tech s Ion Torrent: Personal Genome Machine & Proton template production like 454 (emulsion PCR, beads, wells etc.) nukleotide incorporation > proton release semi-conductor chip measures change in ph advantage: no more light detection and optics

38 Ion Torrent: expected parameters PGM: Bp reads, 11 mio wells., 1 Gb, 90 min Proton I Chip: 100 Bp reads, 165 mio wells, 2 exomes, few hrs Proton II Chip: 660 mio wells, 1 human genome/day Problems: homopolymers & emulsion PCR (like 454)

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40 Illumina Sequencing - principle your DNA Library Preparation input: 500 ng DNA 1 ug total RNA bridge PCR on flowcell A G T T C C C G A G A G C T G T A C G A T C A C C C G A T C G A A Seq-by-synthesis light

41 Illumina Sequencing Add the 4 dye-terminators A C G T Cleave off fluorophore and terminator moiety Add fresh dye-terminators Round 1 Round 2 Signal detection 1 Signal detection 2

42 Illumina-Sequenzierung 1 Lane flowcell

43 Illumina-Sequencing 9 cycles shown, two cluster position marked... The sequence of each cluster is determined by consecutive images.

44 Real data... quality...imaging and base calling are not trivial! 1 lane > on average mio paired-end reads

45 raw data (old chemistry) Real data... Typical Run Q30 Gb / flowcell 50 nt single read % Gb 100 nt paired end % Gb ALer quality trimming 0.1 % error (Q30) 1 % error (Q20)

46 Illumina Library-Preparation gdna, cdna, plasmids, amplicons... DNA fragmentation end-repair A-tailing adapter-ligation index index up to 96 indices size selection e.g bp enrichment flow cell

47 Illumina Library-Preparation Genom-DNA oder cdna ATTGCGTAGCATCGCGATACGACGTGCTAGATGACTGATCGTACGACGATGATGATCGAGTAGCATGCTCATTGCGTAGCATCGCGATACGACGTGCTAGATGACTGATCGT TAACGCATCGTAGCGCTATGCTGCACGATCTAGTGACTAGCTAGCTGCTACTACTAGCTCATCGTACGAGTAACGCATCGTAGCGCTATGCTGCACGATCTAGTGACTAGCA Fragmentierung ATTGCGTAGCATCGCGATACGA TAACGCATCGTAGCGCTATG CTGATCGTACGAC AGTGACTAGCTAGCTG AGTAGCATGCT TCATCGTACGAGTAACGCA CGTGCTAGATGA CTGCACGATCT GATGATGATCG CTACTACTAGC CATTGCGTAGCATCGCGATACGACGTGCTAGATGACTGATCGT TCGTAGCGCTATGCTGCACGATCTAGTGACTAGCA Nach Größe sortieren CATTGCGTAGCATCGCGATACGACGTGCTAGATGACTGATCGT TCGTAGCGCTATGCTGCACGATCTAGTGACTAGCA ATTGCGTAGCATCGCGATACGA TAACGCATCGTAGCGCTATG AGTAGCATGCT TCATCGTACGAGTAACGCA CTGATCGTACGAC AGTGACTAGCTAGCTG CGTGCTAGATGA CTGCACGATCT gewünschte Fraktion extrahieren (normalerweise 150 bis 200 bp) GATGATGATCG CTACTACTAGC

48 Illumina Library-Preparation Extrahierte Fraktion AGTAGCATGCT TCATCGTACGAGTAACGCA CTGATCGTACGAC AGTGACTAGCTAGCTG CGTGCTAGATGA CTGCACGATCT Enden behandeln AGTAGCATGCTA ATCATCGTACGA CTGATCGTACGACA AGACTAGCTAGCTG CGTGCTAGAA AGCACGATCT Fragmente mit Y-Adaptern ligieren 3 -TCTAGCCTTCTCGAGCATACGGCAGAAGACGAAC-5 CTGATCGTACGACA AGACTAGCTAGCTG PCR: Zyklus 1 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTGATCGTACGACAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG TGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGAGACTAGCTAGCTGTCTAGCCTTCTCGAGCATACGGCAGAAGACGAAC DNA-Strang mit 2 unterschiedlichen Enden (das reziproke Produkt des anderen Strangs ist nicht gezeigt)

49 Illumina Library-Preparation DNA-Strang mit 2 unterschiedlichen Enden ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTGATCGTACGACAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG TGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGAGACTAGCTAGCTGTCTAGCCTTCTCGAGCATACGGCAGAAGACGAAC PCR: Zyklen 2+ AATGATACGGCGACCACCGAGAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT > AATGATACGGCGACCACCGAGAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTGATCGTACGACAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG TTACTATGCCGCTGGTGGCTCTTGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGAGACTAGCTAGCTGTCTAGCCTTCTCGAGCATACGGCAGAAGACGAAC < TCTAGCCTTCTCGAGCATACGGCAGAAGACGAAC PCR: Zyklen 2+ einzigartiger Bereich des Adapters ROT zu sequenzierender Bereich einzigartiger Bereich des Adapters GRÜN AATGATACGGCGACCACCGAGAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTGATCGTACGACAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG TTACTATGCCGCTGGTGGCTCTTGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGAGACTAGCTAGCTGTCTAGCCTTCTCGAGCATACGGCAGAAGACGAAC durch PCR angehängt (enthält Multiplex-Tag) von Y-Adapter Sequenz, die in beiden Adaptern identisch ist

50 Illumina Library-Preparation Bindestelle für Sequenzierprimer (Runde 1) AATGATACGGCGACCACCGAGAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTGATCGTACGACAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG TTACTATGCCGCTGGTGGCTCTTGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGAGACTAGCTAGCTGTCTAGCCTTCTCGAGCATACGGCAGAAGACGAAC Tag Bindestelle für Sequenzierprimer Runde 2 Multiplex-Tag ist also nicht in der Sequenz enthalten Für Tags gibt es einen separaten Sequenzierlauf ausgehend vom Primer DUNKELROT

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52 Achtung: Cleavage-Punkt des roten Primers liegt weiter oben und lässt Großteil der roten Primerseq in der flowcell intakt. Nach Seq-Runde1 kann man also erneut eine Bridge-PCR machen, dann den Strang grünen Strang durch Cleavage entfernen und den verbleibenden roten Strang mit dem grünen Primer sequenzieren (= paired end -Sequenzierung; Runde 2)

53 Next-next generation Helicos Visigen Pacific Bioscience Complete Genomics DNA matrix single-mol single-mol single-mol amplification: DNA nano balls sequencing method seq-by-synth: nt with cleavable fluorophores seq-by-synth. FRET transfer Pol > γ-phosphate modified Nt seq-by-synth: labeled hexaphosphate- Nt s seq-by-lig read length 40 bp 580 bp kb short data 2 Gb/day (1 Mb/sec > 86 Gb/day?) today: 3 Bp/sec (1 Gb/min) (20 k human genomes in 2010) (projected)

54 single-molecule detection sequencing-by-synthesis DNA shearing 2 detection of molecule positions... 6 reagent wash 810 polya tag addition..by fluorophore at polya. (then cleaved off) signal detection Hybridization to chip... 4 DNA synthesis: + datp 8 incorporated da with fluorophore fluorophore cleaved off then next rounds of DNA synthesis: + dgtp, + dttp, +dctp...at ultra-high density

55 1 Mb/sec!!! single-molecule, real-time sequencing γ FRET from engineered DNA-Pol to modified γ-phosphates of incoming nucleotides > nt-specific light emission

56 Pacific Biosciences has developed Single Molecule Real Time (SMRT ) DNA sequencing technology. This technology enables, for the first time, the observation of natural DNA synthesis by a DNA polymerase as it occurs. This approach is based on eavesdropping on a single DNA polymerase molecule working in a continuous, processive manner. This transformative technology delivers long reads, fast time to result, and built-in flexibility, enabling a new paradigm in genomic analysis. 56

57 Zero-Mode Waveguides Are the Observation Windows DNA sequencing is performed on SMRT Cells, each containing tens of thousands of zero-mode waveguides (ZMWs) A ZMW is a cylindrical hole, hundreds of nanometers in diameter, perforating a thin metal film supported by a transparent substrate The ZMW provides a window for observing DNA polymerase as it performs sequencing by synthesis 57 Individual ZMW Laser light illuminates the ZMW

58 DNA Polymerase as a Sequencing Engine A single DNA polymerase molecule is attached to the bottom of the ZMW A single incorporation event can be identified against the background of fluorescently labeled nucleotides ZMW with DNA polymerase ZMW with DNA polymerase and phospholinked nucleotides 58

59 Processive Synthesis with Phospholinked Nucleotides Enzymatic incorporation of the labeled nucleotide creates a flash of light, which is captured by the optics system and converted into a base call with associated quality metrics using optimized algorithms To generate consensus sequence from the data, an assembly process aligns the different fragments based on common sequences 59

60 Real-Time Detection of ZMWs in a Multiplex Array Tens of thousands of polymerase molecules monitored immobilized in the bottom of the ZMWs > 1 base incorporated per second 60

61 NANOPORE SEQUENCING Aus: Church, GM (2006) Sci Am