Transienter adenoviraler Gentransfer kutaner Epithelzellen

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1 Aus der Klinik für Plastische Chirurgie und Schwerbrandverletzte, Handchirurgiezentrum, Operatives Referenzzentrum für Gliedmaßentumore der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil- Universitätsklinik- der Ruhr- Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. H.U. Steinau 1 Transienter adenoviraler Gentransfer kutaner Epithelzellen Inaugural- Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr- Universität Bochum vorgelegt von Sebastian von Peter aus Köln 2005

2 2 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Juniorprofessor Dr. med. L. Steinsträsser Korreferent: Prof. Wildner Tag der mündlichen Prüfung:

3 3 Abkürzungen 4 1. Einleitung Hautgentherapie Vektorsysteme in der Hautgentherapie Nicht-virale Vektorsysteme Virale Vektorsysteme Retroviren Adeno-assoziierte Viren Herpesviren Adenoviren Reportergenkonstrukte Ziel dieser Studie Material und Methoden Isolation und Passage von primären Zellen und Zelllinien Isolation humaner Keratinozyten Isolation humaner Fibroblasten Passage der primären Zellen und Zelllinien Produktion des Adenovirus Präparation eines sterilen unpurifizierten Virusvorrats Titerverfahren Produktion eines hohen, purifizierten adenoviralen Titers Bestimmung der Transfektionseffizienz und der Zytotoxizität Transfektion der primären Zellen und Zelllinien Quantifikation der Genexpression und der Zytotoxizität Statistische Analyse Ergebnisse Bestimmung der GFP- Expression in den Kurzzeitmessungen Bestimmung der GFP- Expression in den Langzeitmessungen Zytotoxische Aktivität des adenoviralen Vektors Diskussion Literatur 50 Danksagung 63 Lebenslauf 64

4 Abkürzungen 4 AAV Adeno-assoziiertes Virus Ad Adenoviren C Grad Celsius CAR Adenovirus-Coxsackie-Rezeptor CcCl Cäsium-Chlorid CFTR Cystic fibrosis transmembrane regulator Da Dalton DMEM Dulbecco s modified Eagle s medium DNA Desoxyribonucleinsäure EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EGF Epidermal growth factor FACS Fluorescence activated cell sorting system FBS Fresh bovine serum FGF Fibroblast growth factor GFP Green fluorescent protein HEK Human embryonic kidney cells HSV Herpes-simplex-Virus HCL Hydrochlorid HFP Humane Fibroblasten HKC Humane Keratinozyten IGF Insuline like growth factor IL-1/ 10 Interleukin 1/ 10 kb Kilo- Basen ml Milliliter mm Millimol MOI Multiplicity of infection nm Nanometer NGF Nerve growth factor PBS Phosphat buffered saline PDGF Platelet derived growth factor SCID Severe combined immuno deficiency RV Retroviren RCA Replication competent andenovirus RLU Relative light unit RNA Ribonucleinsäure TGF Tumor growth factor U Units µg Mikrogramm µl Mikroliter VEGF Vascular endothelial growth factor

5 1. Einleitung Hautgentherapie Gentherapie bezeichnet man als eine Therapiemöglichkeit, bei der Veränderungen des Erbguts in Körperzellen eines Organismus vorgenommen werden [1]. Anstatt einer externen Medikamentenapplikation wird dem Körper die Erbinformation für das gewünschte Protein zugeführt. Dieser stellt dann daraus selber das Protein her, was im günstigsten Falle zur Heilung der Krankheit führt [2]. Wenn hierbei genetische Veränderungen an Keimbahnzellen (Ei- und Samenzelle) vorgenommen werden, werden diese Veränderungen auf die Nachkommen weitervererbt, was aus ethischen Gründen durch das am in Kraft getretene Embryonenschutzgesetz verboten wurde [3]. Im Gegensatz hierzu steht die Therapie von ausdifferenzierten Zellen, die somatische Gentherapie: die eingebrachten Gene werden hierbei nicht vererbt, so dass die Effekte der Therapie auf das behandelte Individuum beschränkt bleiben. Unsere Studie beschäftigt sich mit Möglichkeiten der somatischen Gentherapie, die von vielen Autoren als eine vielversprechende Option in der Behandlung akuter und chronischer Erkrankungen angesehen wird [4] prognostizierte der Nobelpreisträger Nirenberg: My guess is that cells will be programmed with synthetic messages within 25 years [5]. 23 Jahre später, am 4. September 1990 wurde zum ersten Mal ein Mensch mit gentherapeutischen Methoden behandelt: einem vierjährigen Mädchen mit der seltenen angeborenen Immunschwäche ADA (Adenosin-Desaminase-Mangel) wurden Lymphozyten entnommen und genetisch verändert, was zu einem raschen Anstieg der immunologischen Aktivität führte [6]. Mittlerweile befinden sich 1020 Versuche in der klinischen Anwendung, davon sind 83,5% in Phase I und II und 16,5 % in Phase II und III [7]. 66% dieser Studien untersuchen gentherapeutische Methoden für Krebserkrankungen, 9,1% für Erberkrankungen und 8,3% für Gefäßerkrankungen [7]. Vorteile eines therapeutischen Gentransfers im Gegensatz zu einer systemischen oder lokalen Applikation von Medikamenten liegen in einem kausalen Behandlungsansatz [2]. Darüber hinaus wird die bessere Zielgenauigkeit der Therapie, der Vorteil der länger anhaltenden

6 Wirkdauer und die Breite der Anwendung auf verschiedene Krankheiten angeführt [2]. 6 Bei gentherapeutischen Behandlungsmethoden wird zwischen in vivo- und ex vivo- Gentransfer unterschieden [2] (Bild 1). Beim ex vivo- Gentransfer werden dem Patienten Zellen durch Biopsie oder Spalthautentnahme entnommen und in vitro kultiviert. Der Gentransfer wird außerhalb des Körpers vorgenommen und anschließend werden die transfizierten Zellen in den Körper retransplantiert [3]. Alternativ kann eine Zellkultur von Spenderzellen in vitro etabliert und dann verwendet werden [2, 8]. Die ex vivo-technik hat den Vorteil eines effizienten Gentransfers durch die Möglichkeit der Zellpropagierung in vitro. Nachteile sind der Zeitaufwand und die Kosten der Zellkultivierung, Schwierigkeiten bei der Annahme des Transplantates und immunologische Probleme, wenn allogene Transplantate verwendet werden [2]. Im Gegensatz hierzu findet beim Vorgehen in vivo der Gentransfer direkt am Patienten statt, ist also nicht Patienten-spezifisch und erfordert demzufolge weniger Logistik und Kosten. Jedoch werden hier geringere Expressionslevel, kürzere Wirkungsdauern und die Inaktivierung der Vektoren durch immunologische Reaktionen beschrieben [3]. Abbildung 1: In vivo - und ex vivo- Gentransfer in der Anwendung auf die Haut Die Haut wird von vielen Autoren als ideales Zielorgan für die Gentherapie beschrieben [9, 10], und zwar für eine Anwendung sowohl in vivo als auch ex vivo. Zum einen lassen sich die Zellen der Haut schnell isolieren und in vitro

7 7 kultivieren. Publizierten Schätzungen zufolge lassen sich Keratinozyten einer Gewebsprobe mit einer Oberfläche von nur 1 cm 2 innerhalb von 14 Tagen auf eine Oberfläche von 1 m 2 vermehren [11, 12]. Dieses, wie auch die Möglichkeit einer leichten Gewebegewinnung, und die Tatsache, dass die Transplantationsmethoden klinisch etabliert sind, machen die Haut für einen Transfer ex vivo interessant. Beispielsweise können dem Patienten Keratinozyten entnommen werden, die dann ex vivo genetisch modifiziert, zu so genannten cell-sheets kultiviert und im Anschluss dem Patienten retransplantiert werden [13]. Zum anderen ist die Haut auf Grund ihrer guten Erreichbarkeit für einen in vivo- Gentransfer interessant [3]. Die modifizierten Hautareale können im Anschluss an einen solchen in vivo Gentransfer gut kontrolliert und beim Auftreten von Nebenwirkungen leicht wieder entnommen werden [14]. Die Hautgentherapie zur Behandlung von lokalen und systemischen Erkrankungen wurde erstmals von Morgan et al. [15] aufgezeigt. Anstatt einer externen Applikation von therapeutischen Substanzen wird mittels Vektoren das therapeutische Transgen in die Zelle geschleust. Dort wird es entweder in das Genom der Zielzelle eingebaut [16] oder verbleibt episomal und kann so am Ort des Bedarfs wirken [3]. Hierbei sind die für die Hautgentherapie interessanten Zielzellen vor allem Keratinozyten und Fibroblasten, aber auch andere Zellen der Dermis und Epidermis, wie glatte Muskelzellen, Melanozyten, Langerhans Zellen und Adipozyten [8, 17-20]. Die anatomische Lokalisation der transgenen Expression innerhalb der Hautschichten wurde in verschiedenen Studien beschrieben [21, 22]. Die Haut besteht aus Epidermis, Korium und Subcutis, wobei sich die Epidermis in ein basales Kompartiment der Proliferation und in eine suprabasale Schicht der Ausdifferenzierung aufteilt [23]. In der basalen Schicht und im Bereich der Haarbälge proliferieren und differenzieren die Zellen permanent und wandern hierbei an die Hautoberfläche, wo sie schließlich absterben und als Hornschicht abgestoßen werden [9]. Im Zuge gentherapeutischer Behandlungen werden Zellen unterschiedlicher Hautschichten transfiziert, wobei insbesondere die Stamm- und Haarbalgzellen für einen langfristigen Gentransfer sorgen sollen [22, 24].

8 8 Die therapeutischen Möglichkeiten der Hautgentherapie wurden für systemische und topische Erkrankungen in verschiedenen Studien untersucht. Die reiche Vaskularisierung der Haut und die Fähigkeit ihrer Zellen, Proteine in die Blutzirkulation zu sezernieren, macht zum einen eine Behandlung von systemischen Erkrankungen über kutanen Gentransfer möglich [3]. So ist in der Literatur unter anderem die erfolgreiche Sekretion von Erythropoietin [25], Transferrin [17], Apolipoprotein E [26], und Faktor IX [27] nach Geninduktion von Keratinozyten und Fibroblasten beschrieben. Die Haut dient somit als Bioreaktor und trägt zur Behandlung von kardiovaskulären und Stoffwechsel- Erkrankungen bei [28]. Darüber hinaus erwies sich die Hautgentherapie als hilfreich in der Behandlung lokaler Erkrankungen, wie Xeroderma pigmentosum [29], Epidermolysis bullosa [24] und Ichtthyosen [30, 31]. Neben diesen Anwendungen im dermatologischen Bereich soll die somatische Gentherapie nicht zuletzt in der Wundheilung neue therapeutische Ansätze bieten [21, 32-38]. Insbesondere der Einsatz bei Brandverletzungen und anderen Wunden, verursacht durch dekubitale, vaskuläre und diabetische Pathologien, wurde in diesem Bereich beschrieben [39]. Vielfach untersucht ist hier die Behandlung mittels Wachstumsfaktoren: Keratinozyten werden genetisch modifiziert und synthetisieren darauf folgend beispielsweise PDGF-A oder IGF-1 [11, 40], die in die molekularen Prozesse der Wundheilung eingreifen und sie hierdurch verbessern [34] Vektorsysteme Grundsätzlich unterscheidet man in der kutanen Gentherapie chemische, physikalische und virale Vektorsysteme, die jeweils typische Merkmale haben und für unterschiedliche Anwendungsbereiche geeignet sind [14]. Jedes der gebräuchlichen Vektorsysteme hat Vor- und Nachteile, keines ist optimal und entspricht allen klinischen Ansprüchen [6]. In den laufenden klinischen Studien nutzen derzeit 27% aller Untersuchungen retrovirale Vektoren, 26% Andenoviren, 15% Plasmide und 8,6% Lipofectamin; der Rest entfällt auf die Verwendung von AAV- und HSV-Vektoren, sowie andere Methoden [7]. Die Entscheidung, welcher Vektor zur Verwendung kommt, hängt von den Therapiezielen ab. So wird die Auswahl beispielsweise davon bestimmt, ob der Gentransfer in vivo oder ex vivo stattfinden soll, was unterschiedliche

9 9 Anforderungen an Sicherheit und Zielgenauigkeit des Vektors stellt [3]. Weitere Entscheidungskriterien betreffen die erwünschte Wirkdauer der transgenen Expression, die jeweilige Insertionskapazität des Vektors und den Aufwand der Produktion. In Tabellen 1 und 2 sind virale und nicht- virale Vektoren einander gegenüber gestellt. Verglichen werden Vor- und Nachteile der jeweiligen Systeme Nicht-virale Vektorsysteme Im Bereich der nicht-viralen Vektoren werden physikalische von chemischen Vektoren unterschieden. Zu den physikalischen Methoden gehört zunächst die direkte Injektion von Plasmid-DNA in das Zielgewebe, eine Methode mit geringen Risiken, betreffend Toxizität oder immunologischer Reaktionen [14]. Hengge et al. zeigten, dass vor allem in in vivo- Studiendesigns Plasmide erfolgreich in Gewebe verbracht und dort auch exprimiert wurden [2, 47-50]. Der Vorteil dieser Methode ist die wenig aufwendige und kostengünstige Herstellung von therapeutischen Plasmiden in Bakterien und das weitgehende Fehlen immunologischer Reaktionen des Organismus [49]. Nachteile liegen in der Effizienz des Gentransfers von lediglich etwa 20-50% [2], und in der nur kurzzeitigen Expression der vermittelten Transgene über einige Tage [47]. Die direkte Injektion von therapeutischen Plasmiden wurde zum Partikel-vermittelten Gentransfer weiterentwickelt. Einerseits wird hier mittels einer sogenannten gene gun auf mikroskopische Goldkugeln geladene DNA mit Luftdruck auf das Gewebe geschossen [21, 32, 50-55]. Andererseits wurde hier die Microseeding - Methode entwickelt, bei der oszillierende Mehrkanalpunktionsgeräte verwendet werden, um DNA in die Haut zu verbringen. Im Gegensatz zur Genpistole kann hier die Injektionstiefe besser kontrolliert und zugleich größere Areale transfiziert werden [56]. Die dritte und letzte Möglichkeit, DNA mittels physikalischer Methoden in die Haut zu verbringen ist die Elektroporation, bei der die Zielzellen in vitro einem elektrischen Feld ausgesetzt werden. Hierdurch wird transient die Durchlässigkeit der Zellmembranen erhöht, so dass die DNA in das Zytoplasma eindringen kann [2, 50, 57]. Gegenüber der Plasmid- Injektionsmethode ist das Verbringen von Plasmiden mittels Elektroporation um 100 bis 1000-fach effizienter [58], so dass beispielsweise in Gefäßendothelien die Transfektionsrate auf 90% gesteigert werden konnte [59, 60].

10 10 Chemische Methoden nutzen Substanzen, die positiv geladen sind und damit die negativ geladene DNA des Therapiegens binden. DNA und Substanz werden dann als Komplex, wahrscheinlich über endozytotische Vorgänge, in die Zelle aufgenommen [11]. Verschiedene kationische Lipid-DNA-Komplexe gaben bisher vor allem in ex vivo und in vitro gute Transfektionsergebnisse [61-63]. Staedel et al. beispielsweise untersuchten die Transfektionseffizienz verschiedener polykationer Lipide, die das Reportergen Beta-Galaktosidase in humane Keratinozyten verbrachten und zeigten, dass die beiden effizientesten Substanzen, Lipopolyamin und Polybrene, 20-30% der Zellen transduzierten [64]. Zu einem ähnlichen Ergebnis kamen Chen et al., die mit einem Lipofectamin-mediatisierten Transfektionssystem in vitro etwa 30% der Keratinozyten transfizierten [65]. Jedoch reicht die Transfektionseffizienz chemischer Substanzen in vivo meist nicht aus, was ihre Verwendung in in vivo- Studiendesigns limitiert [66, 67] Virale Vektorsysteme Die Vorteile von nicht-viralen im Vergleich zu viralen Vektorsystemen sind die geringere Immunogenität, die geringere Toxizität und die leichtere Ausführbarkeit [2]. Jedoch sorgen sie vor allem in vivo, aber auch in vitro für geringere Transfektionsergebnisse und haben hauptsächlich Bedeutung für die transiente Expression von transgenen Substanzen [2]. So werden derzeit für in vivo-versuche virale Vektoren am häufigsten verwendet [7]. Die Verwendung von Viren als Vektoren macht sich deren evolutionär erworbene Fähigkeit zu Nutze, Gene bei der Infektion in die Wirtszelle einzubringen. Das Verbringen von Transgenen in die Zelle und die darauf folgende Produktion von therapeutischen Proteinen geschieht hierbei auf unterschiedliche Arten. Entweder werden die Transgene in den Zellkern geschleust und dort unabhängig von der chromosomalen DNA abgelesen [68]. Diese sogenannten Episome gehen nach einigen Zellteilungen verloren und sorgen dadurch lediglich für eine transiente Genexpression [69]. Die andere Möglichkeit ist die Integration des Transgens in das zelleigene Chromosom, so dass das Therapiegen von Zellgeneration zu Zellgeneration weitergegeben wird, was zu einer langfristigen Genexpression führt. Nachfolgend und in Tabellen 1 und 2 werden die wesentlichen Unterschiede der viralen Vektorsysteme beschrieben.

11 11 Die Transfektionseffizienzen und die Angaben der Dauer der transgenen Expression sind auf in vitro Studien bezogen. Zudem beziehen sie sich auf Transduktionen von Keratinozyten und Fibroblasten von Mensch und/ oder Tier, mit der Ausnahme der Werte für das Herpes simplex-virus, die Gehirnzellen betreffen. Tabelle 1: Vor- und Nachteile viraler und nicht-viraler Vektorsysteme. Vergleich von Konstruktion und Eigenschaften der Vektoren. Konstruktion Maximale Titer Insertionskapazität Durchmesser AD Etabliert Bis kb 90 nm AAV Schwierig Bis 10 9 < 4-5 kb 20 mm RV Etabliert Bis 10 7 Ca. 10 kb 80 nm HSV Schwierig Bis Ca. 15 kb 200 nm Lentiviren Schwierig Bis 10 6 Ca. 9 kb 70 nm Nicht-virale Vektoren Entfällt Entfällt Unbegrenzt Entfällt Tabelle 2: Vor- und Nachteile viraler und nicht-viraler Vektorsysteme. Vergleich der Transfektionseigenschaften der Vektoren. Zelltropismus Transduktionseffizienz in vitro Verbleiben des Vektors Dauer der Genexpression in der Zelle AD Breit 60-82% Episomal 2-3 Wochen AAV Breit 50-70% Episomal 3-5 Wochen RV Beschränkt 30%- 40% Integriert Wo.- Monate HSV Beschränkt 30-40% Persistierend Ca. 1 Woche Lentiviren Breit 20-92% Integriert Bis zu 40 Mo. Nicht-virale Vektoren Breit 20-30% (chemische) 20-90% (physikalische) Episomal Mehrere Tage Retroviren (RV) Retroviren sind die am besten untersuchten viralen Vektoren. Durch das Enzym reverse Transkriptase wird die einzelsträngige RNA der Retroviren in doppelsträngige DNA umgeschrieben. Diese virale DNA wird darauf folgend in die chromosomale DNA der Wirtszelle integriert und sorgt hierdurch für eine Langzeit-Expression des genetischen Materials [16, 70-73]. So wurde von Kolodka et al. beispielsweise der erfolgreiche retrovirale Gentransfer in Maus-

12 12 Keratinozyten in vitro beschrieben: 25-27% der transduzierten Zellen zeigten eine Expression des Transgens und behielten diese nach Retransplantation auf die Maus für 40 Wochen bei [71]. Allerdings infizieren Retroviren lediglich proliferierende Zellen, da die Viren die Kernmembran nur in der Mitose passieren können. Darüber hinaus ist die Produktion von hohen Titern und die Lagerung derzeit noch eine Herausforderung [36]. Durch die zufällige Integration der viralen DNA in die Chromosomen der Zielzelle ist zudem eine Aktivierung von Proto-Onkogenen oder Desaktivierung von Tumorsupressorgenen möglich, so dass maligne Zelltransformationen beschrieben wurden [3, 36, 74]. Insbesondere immundefiziente SCID- Patienten entwickelten auf diese Weise Leukämien nach allerdings erfolgreicher retroviraler Therapie ihrer Erkrankung [75]. Dieser potentiell mutagene Charakter, wie auch die ausschließliche Wirkung auf proliferierende Zellen und die rasche Inaktivierung durch das Komplementsystem [76] limitieren den Gebrauch in vivo, so dass die Vektoren vor allem in ex vivo und in vitro Studiendesigns angewendet werden [3]. Neue Ansätze verwenden Lentiviren, wie HIV und SIV, die die Fähigkeit besitzen, neben proliferierende auch postmitotische Zellen zu transfizieren [77-79]. Ein solcher Lentivirus wurde auch in einer Studie von Chen et al. verwendet, in der über eine in vitro Transfektionseffizienz von 94% für Fibroblasten und 96% für Keratinozyten über drei Wochen hinweg berichtet wird [65] Adeno- assozierte Viren (AAV) Das AAV ist ein humanes, natürlich Replikations-defizientes und nichtpathogenes Virus, welches ebenfalls das Potential zur Integration besitzt [81], jedoch auch nicht-teilungsfähige Zellen transfiziert [3]. So ist es für den Einsatz in- und ex vivo geeignet, vermittelt außerdem eine lange Expression und löst weitgehend keine immunologischen Reaktionen im Zielgewebe aus [82, 83]. Descamps et al. zeigten, dass durch AAV-Vektoren vermitteltes Erythropoietin in vivo für einen Monat von Maus-Keratinozyten exprimiert wurde [84]. In vitro zeigten Braun et al., dass transduzierte Zellen das Beta Galactosidase-Gen bis zu 50 Tagen nach Transfektion exprimierten [85]. Probleme bieten die, im Vergleich zu anderen viralen Vektorsystemen, geringe Insertionskapazität lediglich 4,5 kb exogene DNA können in das Virus gepackt werden. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die systemische Applikation von AAV in vivo

13 13 Lebernekrosen induziert [86]. Die Herstellung erfordert zudem den Gebrauch von Helfer-Viren, was zu geringen Titern (10 9 ), hohen Kontaminationsraten und dadurch zu aufwendigen und kostenreichen Produktions- und Purifikationsprozessen führt. Erst kürzlich wurden neue, Helfervirus-freie Techniken entwickelt, die auch höhere Titer erbringen [81, 87, 88] Herpesviren (HSV) Herpesviren befinden sich ebenfalls bereits in der gentherapeutischen Anwendung [73]. Der Vorteil ist, dass HS-Viren die Fähigkeit besitzen, auch post-mitotische Zellen zu transfizieren und zudem über große Insertionskapazitäten (15 kb) für exogene DNA verfügen. HSV können eine große Anzahl unterschiedlicher Zelltypen infizieren, wie Zellen aus Muskel [89] und Leber [90], werden aber von verschiedenen Autoren vor allem als ein günstige Vektoren für die Behandlung neurologischer Erkrankungen beschrieben [73, 91]. Das liegt an der Fähigkeit der Herpesviren, eine Latenz in neuronalen Zellen zu evozieren, die die ansonsten sehr kurzfristige Expression von ca. einer Woche auf ein Vielfaches verlängert [91]. Jedoch schränkt die lediglich kurzfristige Expression in nicht-neuronalen Zellen, wie auch die hohe Toxizität der Herpesviren [91] ihre Verwendung in in vivo und ex vivo Studiendesigns ein Adenoviren Infektionen mit Adenoviren sind weit verbreitet in der Bevölkerung; weltweit sind etwa 60% der Menschen infiziert [92]. Klinische Symptome reichen von leichten Konjunktividen und Pharyngitiden bis zu schweren Dysenteritiden, die tödlich enden können [93]. Das Genom von Adenoviren enthält eine doppelsträngige DNA von ca. 38 kb Länge und ist von einem Kapsid umgeben, von dessen 12 Eckpunkten sich lange Fibern erstrecken (Bild 2). Das Kapsid selber besteht aus 20 dreieckigen Facetten, ist etwa 90 nm groß und etwa 150 x 10 6 Da schwer, wovon 22,6 x 10 6 Da auf die virale DNA entfallen [94]. Abbildung 2: die doppelsträngige DNA der Adnoviren ist von einem 20-flächigen Kapsid umgeben, von dessen 12 Eckpunkten sich lange Fibern erstrecken.

14 14 Über 51 Serotypen von Adenoviren wurden bislang aus verschiedenen Säugetieren isoliert, die in sechs Untergruppen (A-F) eingeteilt werden können [94]. Für den therapeutischen Gentransfer werden fast ausschließlich die Serotypen 2 und 5 der C- Untergruppe verwendet [94]. Denn diese Typen haben die Fähigkeit, eine große Auswahl von proliferierenden als auch ruhenden Zellpopulationen zu transfizieren, wie Zellen aus Lunge, Leber, Gehirn, Blut und Haut [95]. Zur Aufnahme in die Zelle bindet das Adenovirus an den in humanen Zellen vielfach vorkommenden Adenovirus-Coxsackie- Receptor (CAR). Dieser Rezeptor befindet sich bei epithelialen Zellen vor allem im Bereich der tight junctions und dient dort vermutlich der Zell-Adhäsion [96]. Es folgt eine Rezeptor-vermittelte Endozytose des Virus [97], die nach neueren Studien von der Aktivierung spezifischer Integrine reguliert werden soll [96]. Hiernach wird das Adenovirus durch einen bis dato ungeklärten Mechanismus in das Zytosol der Wirtszelle freigegeben und gelangt von hier aus in den Nucleus [96] (Bild 3). Im Zellkern verbleiben die durch den Virus vermittelten genetischen Informationen epichromosomal, werden also nicht in die Wirtszell- DNA integriert, was letztendlich zu der lediglich transienten Expression der Transgene über Tage bis Wochen führt [98, 99]. Abbildung 3: Die Adenoviren binden an den CAR- Rezeptor und werden endozytotisch aufgenommen. Im Zytosol wird die adenovirale DNA freigegeben, die dann zum Zellkern wandert und dort episomal verbleibt. Die Expression adenoviraler Gene findet in zwei Phasen statt. Die Gene, die in der frühen Phase der Expression transkribiert werden, sind in vier Einheiten unterteilt, E1 bis E4 (E für early genes ). Sie kodieren für regulative Proteine und vermitteln das lysierende Wachstum des Virus in Zellkulturen [95]. Die spät abgelesenen L(ate)-Transkripts werden von einem einzelnen Promoter transkribiert und kodieren für die strukturellen Proteine des Virus,

15 15 wie beispielsweise die Kapsid-Hexone [92] (Bild 4). Da insbesondere die E1- Region für die Produktion von Replikations-fähigen Adenoviren und hierdurch für deren Zytotoxizität zuständig ist, wurde der ersten Generation der verwendeten Adenoviren dieses Areal entnommen [100]. Dieses führte jedoch dazu, dass die Adenoviren aus sich heraus vermehrungsunfähig wurden, so dass für ihre Propagation mit dem fehlenden Gen transfizierte Helferzellen notwendig wurden. Die menschliche embryonale Nieren- Zelllinie ( human embryonic kidney / HEK-Zelllinie) 293 ist stabil mit dem E1- Gen transfiziert und lässt demzufolge eine Vermehrung der E1-defizienten Adenoviren zu. Diese Helfer-abhängige Propagation der Adenoviren ist heutzutage der Standard und führt zu hohen Titern. Bis zu Kopien des Adenovirus können auf diese Weise hergestellt werden [92]. Abbildung 4: Transkription adenoviraler DNA; E- Gene werden frühzeitig abgelesen und kodieren für regulative Proteine. Das Ablesen der L- Gene führt zur Produktion struktureller Proteine. Die Verminderung des adenoviralen Genoms um lediglich die E1-Region brachte jedoch auch die Entwicklung von sogenannten RCAs ( replication competent adenovirus ) mit sich [92]. Durch die Überschneidung der in die HEK-293-Zellen integrierten genetischen Sequenzen und des Genoms der Adenoviren entstanden unerwünschte Rekombinationen bei der Produktion des Virus, die die Zytopathogenität der Vektoren erhöhten [101]. Zudem bildete beim gentherapeutischen Einsatz in vivo die Provokation immunologischer Reaktionen des Wirtsorganismus das Hauptproblem dieser ersten Generation adenoviraler Vektoren [52, 102, 103]. So wurde nach

16 16 Transfektion mit adenoviralen Konstrukten die Produktion neutralisierender Antikörper und zytotoxischer T-Zellen gegen virale Epitope nachgewiesen [52, 102, 103], die unter anderem für den Verlust der transgenen Langzeitexpression von Transgenen verantwortlich gemacht wurden [31, 104]. Dieses führte zu der Entwicklung einer neuen Generation von Helferabhängigen, sogenannten gutless Adenoviren. Die adenovirale Struktur wurde weiter modifiziert und die Viren dadurch von weiteren Proteinkodierenden Sequenzen befreit [99, 101]. Durch die Deletion der E3-Region und später der E2- und E4-Region wurde das Auftreten der RCAs vermindert. Zudem wurde hierdurch die Immunogenität adenoviraler Vektoren signifikant vermindert und im Vektor Platz geschaffen für bis zu 37 kb Therapiegen [74, 105, 106]. Die Produktion dieser neuartigen Vektoren ist jedoch schwieriger und die Transfektionseffizienz in vitro und in vivo geringer [99]. Zudem wird in der Literatur inzwischen bezweifelt, dass die kurzfristige Expression transgener Produkte in vivo vor allem durch immunologische Reaktionen gegen das Adenovirus bedingt ist [31, 104]. Insbesondere Lusky et al. zeigten, dass die Immunantwort in vivo nicht adenovirale Epitope, sondern vor allem transgene Produkte anvisiert [105]. Sie führten an, dass Studien, die eine reduzierte Immunogenität von adenoviralen gutless Vektoren im Gegensatz zu lediglich E1-verminderten Vektoren zeigten, vor allem das Reportergen Beta-Galaktosidase nutzten, welches sich bekanntermaßen durch seine starke Immunogenität auszeichnet. Es sei deshalb zu diskutieren, inwieweit die Immunreaktion durch virale oder doch eher transgene Produkte provoziert würde. So scheint es vielmehr von Bedeutung zu sein, ein wenig immunogenes Reporter-Gen- Konstrukt zu verwenden. Adenoviren wurden in verschiedenen in vivo und ex vivo Modellen verwendet. In der systemischen Anwendung wurden sie vor allem in der Therapie der zystischen Fibrose eingesetzt [67, 73, 107]. So kommen seit nunmehr bereits zwei Dekaden verschiedene Aerosole zur Anwendung, die Adenovirus-vermittelt das fehlenden CFTR-Gen applizieren, das die Ursache des Krankheitsprozesses ist [108]. Eine weitere systemische Anwendung fanden Adenoviren in der Therapie von soliden Tumoren [103, ]. In

17 17 diesem Feld werden vor allem Behandlungsansätze für die Therapie von Leber [112], Pankreas- [113] und Hirntumoren [114] erforscht. Im Gegensatz hierzu untersuchten andere Studien die Möglichkeiten der lokalen Anwendung von adenoviralem Gentransfer. Sie zeigten hier vor allem den Nutzen adenoviraler Vektoren für die Wundheilung [35, 36, 119]. Adenoviren sind fähig, Zellen der Epidermis und Dermis zu transduzieren, wie Keratinozyten, Fibroblasten und Adipozyten [62, ], so dass adenoviraler Gentransfer der Haut möglich ist. Liechty et al. beispielsweise zeigten eine transgene Expression von PDGF nach Transfektion mit adenoviralen Vektoren über zwei Wochen hinweg, sowie eine konsekutiv verbesserte Reepithelialisierung ischämischer Wunden bei Hasen [119, 120]. Di Peppe et al. beobachteten eine signifikant höhere Rate von Gefäßneubildungen, sowie eine verbesserte Wundheilung bei Mäusen mit Diabetes-induzierten Wunden nach Transfektion von Adenoviren, die für VEGF kodierten [121]. In diesem Zusammenhang könnte nach Chrombleholme auch die adenoviral vermittelte Transduktion von IGF, FGF und TGF in der Wundheilung von Nutzen sein [40] Reportergenkonstrukte Die Transfektion eines Vektorsystems kann mit Hilfe von Reportergenen lokalisiert und quantifiziert werden. Reportergene sind Aminosäure- Sequenzen, die für leicht detektierbare Proteine kodieren [122]. Diese Marker-Proteine werden entweder als singuläres Produkt exprimiert oder sie werden als Fusionsproteine an andere Proteine gekoppelt und im Zusammenhang mit diesen produziert [122]. Durch Reportergene kann die Stärke unterschiedlicher Promotoren oder Vektorsysteme evaluiert werden [21]. Zum anderen ist es durch sie möglich, das intra-organismische oder intrazelluläre Schicksal eines Genproduktes darzustellen und zu lokalisieren [123]. Reportergene können in intrazellulär wirkende und an der Zelloberfläche wirkende Markerproteine unterteilt werden [123]. Der Vorteil externer Marker ist, dass sie nicht mit intrazellulären Prozessen interagieren. Intrazelluläre Reportergene hingegen unterliegen nicht der Gefahr der Interaktion mit dem körpereigenen Immunsystem.

18 18 Im Zusammenhang mit viralem Gentransfer werden häufig drei verschiedene Reportergen-Systeme verwendet: die Enzyme Beta-Galaktosidase und Luciferase und das in dieser Arbeit verwendete grüne fluoreszierende Protein, kurz GFP [123]. Das Gen Lux mit dem Bauplan für das Enzym Luciferase wird aus Leuchtbakterien und dem Glühwürmchen gewonnen [54]. Luciferase oxidiert Luciferin, was zu einer Emission von Photonen führt, die sich wiederum autoradiographisch messen lässt [54]. Der Vorteil dieser Technik ist die schnelle und einfache Detektionsweise und die hohe Sensitivität des Testes, sowie seine kostengünstige Durchführung [54]. Das zweite, häufig verwendete Reportergen ist das Gen lacz, das für das Enzym Beta-Galactosidase kodiert [123]. Dieses Enzym spaltet durch eine hydrolytische Reaktion Lactose. Durch diese Reaktion angeregt, bildet ein histochemisches Substrat ein blaues Prezipitat, das mit der Menge an nachzuweisendem Protein korreliert. Nachteil dieses Reportergens ist seine hohe Immunogenität, die in vivo für die Provokation immunologischer Reaktionen sorgt [105]. In der vorliegenden Arbeit wurde das Reportergen GFP ( green fluorescent protein ) verwendet, das 1962 erstmalig von Shimomura et al. beschrieben wurde [124]. Nach seiner Einführung als Marker-Gen wurde GFP zunehmend in der Gentherapie-Forschung eingesetzt [125]. Das Protein besteht aus 238 Aminosäuren und emittiert, angeregt durch Licht mit einer Wellenlänge von nm, eine grüne Fluoreszenz von nm mit einem Emissionsgipfel bei 508 nm. Der Mechanismus der Autofluoreszenz wird folgendermaßen beschrieben [126, 127]: die für die Fluoreszenz entscheidende Aminosäurensequenz des GFPs besteht aus einer repetitiven Folge von Serin, Tyrosin und Glycin. In der Sekundärstruktur befindet sich diese Sequenz im Inneren des Proteins [125]. Durch die Exitation mit Blaulicht bindet Glycin an Serin und bildet dadurch eine Ringstruktur, welche spontan dehydriert. Es folgt eine länger andauernde Reaktion von Sauerstoff mit einer Seitenkette des Tyrosins. Dieses führt zu einer Doppelbindung, wodurch letzten Endes das fluoreszendierende Chomophor entsteht [125] (Abbildung 5).

19 19 Abbildung 5: Spontante Dehydrierung der Ringstruktur des GFPs mit nachfolgender Oxidation des Tyrosins, was zu der Doppelbindung und schließlich zur Fluoreszenz führt. Die Vorteile der Detektion von Genexpression mittels GFP sind vielfältig: da der oben beschriebene Prozess auto-katalytisch abläuft, ist die Methodik unabhängig von potentiell schädigenden, exogenen Substraten oder Kofaktoren, wie sie bei den enzymatischen Methoden notwendig sind [128]. Somit ist die Detektion mittels GFP nicht-invasiv und wird zudem als weitgehend frei von Interferenzen mit Zellwachstum und -funktion beschrieben [129]. So führt die Enzym-unabhängige Detektionsweise dazu, dass sich GFP insbesondere für die Verwendung in in vivo Studiendesigns eignet [130]. Außerdem liegt das fluoreszierende Chromophor im Inneren der Sekundärstruktur des GFPs, so dass es weitgehend geschützt ist gegen denaturierende Prozesse in Form von Hitzeeinwirkung und Proteasen [129]. Zudem ist GFP mit seinen 283 Aminosäuren ein verhältnismäßig kleines Protein und passt so in die meisten der aktuell verwendeten viralen Vektorsysteme [115].

20 20 2. Ziel dieser Studie Der transiente adenovirale Transfer von therapeutischen Genen in epitheliale Zellen bildet einen vielversprechenden Ansatz in der lokalen Behandlung von Hautkrankheiten und Wundheilungsstörungen. Ziel dieser Arbeit war es herauszufinden, ob ein solcher adenoviraler Gentransfer kutaner Zellen in vitro möglich ist. So wurde die in vitro Transfektionsfähigkeit und Zytotoxizität eines adenoviralen Vektorsystems untersucht, das GFP exprimierte. Zielzellen für die Transduktion waren primäre humane Keratinozyten und Fibroblasten, sowie die spontan imortalisierte, humane Zellinie HaCat. Als Positivkontrolle diente uns die Helferzelllinie HEK 293. Hierbei war es zum einen wichtig, Grundlagendaten für die spätere Verwendung adenoviraler Konstrukte in in vivo Studiendesigns zu erstellen. Zum anderen haben die Ergebnisse direkte Relevanz für eine Anwendung in ex vivo Studiendesigns. So können einem Patienten Zellen entnommen und diese in einer Zellkultur amplifiziert werden. Hiernach werden die Zellen mit Hilfe des adenoviralen Vektorsystems mit einem therapeutischen Gen transduziert, gefolgt von der Retransplantation der Zellen auf den Patienten.

21 21 3. Material und Methoden 3.1. Isolierung und Passage von primären Zellen und Zelllinien Isolation humaner Keratinozyten Frische menschliche Haut (Bergmannsheil, Bochum, Deutschland/ Registernummer der Ethikkomission: 2501) wurde in PBS (PAA Laboratories, Linz, Österreich) gewaschen. Die Haut wurde in sterile Petri-Schalen (Greiner, Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland) gegeben und mittels Skalpell (Aeskulap, Tuttlingen, Deutschland) die Hypodermis abgetrennt. Die übergebliebenen Schichten wurden in Stücke von 2 cm² geschnitten und mit PBS gewaschen. Anschließend wurden sie in neue Schalen mit der epidermalen Seite nach oben gelegt, vollständig mit 0,2%iger Dispase- Lösung (4,7 U/ ml, Gibco, Paisly, USA) überdeckt und bei 4 C über Nacht inkubiert (Liebherr, Biberach, Deutschland). Die Epidermis wurde vorsichtig abgetrennt und als kleine Stücke in Trypsin/ EDTA-Lösung (0,05%/ 0,02%, Gibco, Paisly, USA) gegeben. Die übrig gebliebene Dermis wurde zur Isolation von Fibroblasten verwendet. Nach Inkubation der Epidermis- Stücke für fünf Minuten bei 37 C in einem Schüttelbad ( rpm), wurde die Suspension gevortext und anschließend das Trypsin mit FBS in 10%iger Konzentration (Hyclone, Logan, USA) gestoppt. Die Suspension wurde in einem Zell-Abscheider (Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) gefiltert und bei 400 x g und 4 C für 5 Minuten zentrifugiert. Die Zellen wurden in 5 ml Keratinozyten-Medium resuspendiert (3:1 DMEM (Gibco, Paisly, UK), Ham s F12 (Gibco, Paisly, UK), 10% FBS (HyClone, Logan, USA), 1% Penicillin/ Streptomycin (ICN, Aurora, USA), 4mM L- Glutamin (ICN, Aurora, USA), 24,3 µg/ ml Adenin (Calbiochem., Darmstadt, Deutschland), 5 µg/ ml Insulin (Sigma, St. Louis, USA), 0,4 µg/ ml Hydrocortison (Calbiochem., Darmstadt, Deutschland), 1,36 ng/ ml Triiodthyronin (Sigma, St. Louis, USA), 10/ -10 M Cholera Toxin (Sigma, St. Louis, USA), 10 ng/ ml EGF (Sigma, St. Louis, USA)) und in einem elektronischen Zytometer (CASY- 1, Schärfe System, Reutlingen, Deutschland) gezählt. Sie wurden in einer Menge von Zellen/ cm 2 in Kollagen Typ 1- beschichtete Kulturflaschen (Becton Dickinson Falcon, , Heidelberg, Deutschland) eingesät und bei 37 C und 5% CO2- Gehalt kultiviert.

22 Isolation humaner Fibroblasten Die Dermis wurde in kleinen Stücken mehrmals in PBS gewaschen und anschließend in sterile Petrischalen gegeben. Eine sterile Kollagenase-Typ- 2- Lösung (Gibco, Paisly, USA) wurde in PBS präpariert mit 3000 U/ ml (3 ml Kollagenase-Lösung pro Gramm Gewebe). Die Präparation wurde über Nacht in einem Rotor-Ofen (Becton Dickinson, Heidelber, Deutschland) bei 37 C inkubiert. Die entstandene Zellsuspension wurde im Zell-Abscheider gefiltert, bei 400 x g 10 Minuten zentrifugiert (Suprafuge, Haereus, Langsenbold, Deutschland) und anschließend in Fibroblasten-Kultur-Medium aufgenommen (DMEM (Gibco, Paisly, USA), 10% FBS (HyClone, Logan, USA), 1% Penicillin/ Streptomycin (50U/ 50ug/ ml; ICN)). Die Zellen wurden mit dem elektronischen Zytometer gezählt und unter dem Lichtmikroskop in einer Neubauer-Zählkammer auf den Gehalt an Granulozyten und roten Blutzellen geprüft. Sie wurden in einer Dichte von Zellen/ cm² eingesät und bei 37 C und 5% CO2 kultiviert. Das Medium wurde jeden zweiten Tag gewechselt Passage der primären Zellen und Zelllinien Bei Kulturen mit nahezu konfluenten Zellen wurde das Medium abgenommen. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und anschließend wurde ein Trypsin- EDTA-Gemisch von 0,05%/ 0,02% (bei 293-Zellen 0,025%/ 0,01%ig) hinzugegeben. Die Flaschen wurden bei 37 C solange inkubiert, bis die Zellen von der Kulturflasche gelöst waren (bei 293-Zellen ca. nach 2-5 Minuten, bei primären Keratinozyten ca. nach 20 Minuten). Das Trypsin wurde mit FBS abgestoppt, die Suspension in ein 50 ml Falcon- Röhrchen übertragen und bei 400 x g (1400 rpm) und 4 C für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen in 1 ml Medium aufgenommen. Für die Lösung der Zellen wurde für die primären Keratinozyten Keratinozyten-Medium, für die Fibroblasten und Zelllinien DMEM mit 10% FBS und 1% Penicillin/ Streptomycin verwendet. Anschließend wurde die Zellzahl durch Auszählen in einer Neubauer- Kammer bestimmt und die Zellen entsprechend neu eingesät.

23 Produktion des Adenovirus Präparation eines sterilen, unpurifizierten Virusvorrats 293- Zellen wurden in einer 25 cm²- Flasche mit DMEM, 10% FCS und 1% Penicillin/ Streptomycin so eingesät, dass sie am folgenden Tag nahezu konfluent waren. Nach Austausch des Mediums gegen DMEM, 2% FCS, 1% Penicillin/ Streptomycin wurde die Kultur mit dem Virus (der Virus wurde freundlicherweise von The Vector Core, Gene Therapy Program, Division of Medical Genetics, Department of Medicine der University of Pennsylvania, School of Medicine, USA zur Verfügung gestellt) infiziert. Die infizierten Zellen wurden bei 37 C und 5% CO2- Gehalt für 48 Stunden inkubiert. Bereits nach 24 Stunden waren durch die Replikation des Virus erste zytopathische Effekte sichtbar (abgerundete, tote Zellen, zellkernlose Zellen und Lysehöfe im Zellrasen etc.), nach 48 Stunden waren diese ausgeprägt. Nun wurden die Zellen geerntet, d.h. durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren des Mediums wurden die Zellen gelöst. Sie wurden dreimalig zunächst in flüssigem Stickstoff gefroren und in einem 37 C- heißem Wasserbad aufgetaut, um die Zellen zu lysieren und das sich intrazellulär befindende Virus freizusetzen. Zur Säuberung des Lysats wurde es bei 4 C und 3300 x g 10 Minuten zentrifugiert, der Überstand wurde verwendet, der Debris verworfen. Nahezu konfluente 293- Zellen auf einer Fläche von 1000 cm² (entspricht ca. 5 ½ 185 cm²-kulturflaschen) wurden mit dem Überstand der vorherigen Präparation infiziert. Dabei wurde die gereinigte Viruslösung gleichmäßig auf alle Kulturflaschen aufgeteilt. Nach 48 Stunden wurden die Zellen geerntet und 5 Minuten bei 4 C und 250 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen und die Zellen in 20 ml PBS aufgenommen. In obengenannter Weise wurden die Zellen durch dreimaliges Auf- und Abtauen zunächst lysiert und dann zentrifugiert. Dem Überstand wurde 10%iges, steriles Gycerol hinzugegeben. Er wurde anschließend aliquotiert und bei -80 C gefroren.

24 Titerverfahren Es wurden vier konfluent besiedelte 6-well-Zellkulturplatten (Corning, Costar, Wiesbaden, Deutschland) mit HEK 293 Zellen herangezogen. Die Virusprobe wurde in DMEM mit 2% FBS und 1% Pencillin/ Streptomycin gelöst. Es wurde eine Verdünnungsreihe von 10-1 bis 10-9 hergestellt und mit dieser jeweils drei Zellkulturen mit 900 µl per well infiziert. Die transfizierten Kulturen wurden 12 Stunden inkubiert und hiernach pro well je 1 ml DMEM mit 2% FBS und 1% Pencillin/ Streptomycin hinzu gegeben. 36 Stunden nach Infektion wurde das Medium durch 1 ml PBS ersetzt und die Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop ausgezählt. Alle Ausführungen erfolgten in Dreifachbestimmung, wobei die Anzahl der fluoreszierenden Zellen zu der Gesamtzahl der im well vorhandenen Zellen in Relation gesetzt wurden. Jede infizierte Zelle zählte hierbei für ein infektionskompetentes Virus. Die Titerbestimmung umfasste somit den Gesamtgehalt an infektionskompetenten Viren in den Proben und wurde im Anschluss durch die Messung der optischen Dichte bei 260 nm (Untersuchung auf Doppelstrang DNA) in einem Spektrophotometer (BioPhotometer, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) überprüft. Zur weiteren Kontrolle wurde ein Plaque Assay mit der oben genannten Verdünnungsreihe ausgeführt. HEK 293 Zellen wurden mit einem das Medium enthaltenen Agar bedeckt. Nach 48 Stunden und fünf Tagen wurden die Platten auf sich bildende Plaques untersucht, wobei jeder Plaque einem kompetenten viralen Vektor zugerechnet wurde Produktion eines hohen, purifizierten adenoviralen Titers Die Zellkulturen wurden mit dem sterilen, aber ungereinigten Virusvorrat der Zellkulturen in einer MOI von ungefähr transfiziert. MOI meint multiplicity of infection und stellt die hinzu gegebene Viruszahl pro Zelle der Kultur dar. Sie repräsentiert die Anzahl der infektiös-kompetenten Viruspartikel in der Präparation und nicht die totale Anzahl an Viruspartikel, im Sinne einer PFU ( plaque forming units ) oder einer PU ( particle units ). Die Zellen wurden für ca. 50 Stunden bei 37 C und 5% CO2- Gehalt inkubiert und dann geerntet. Die gelösten Zellen wurden anschließend auf 50 ml Falcon- Röhrchen aufgeteilt und auf Eis gelagert. Es folgte ein

25 25 Zentrifugationsschritt bei 250 x g, 4 C für fünf Minuten. Das Zellpellet wurde in 20mM Tris/ HCL, ph 8.0 (Sigma, St. Louis, USA) resuspendiert, wobei das Volumen dieser Resuspensionslösung von der initialen Größe der Zellkultur abhing. Im Allgemeinen gebrauchten wir ml TrisHCL bei einer anfänglichen Zellkulturgröße von 1900 cm². Der Überstand wurde im Autoklaven bei 121 C für 20 Minuten sterilisiert und dann verworfen. Die gelösten Zellen wurden in drei Auf- und Abtau-Reaktionen nach obigem Prinzip lysiert. In einigen Präparationen wurde beim letzten Gefrierschritt innegehalten und das gefrorene Zelllysat über Nacht bei - 80 C gelagert, um am nächsten Tag mit den folgenden Schritten fortzufahren. Nach einer weiteren Zentrifugation bei 3300 x g und 4 C für 10 Minuten wurde der die Viren enthaltende Überstand gesammelt. Der zurückbleibende Zelldebris wurde mit 5-10 ml Tris/ HCL, ph 8.0 gewaschen, gevortext und erneut zentrifugiert. Der hierbei entstehende Überstand wurde mit dem vorherigen gemischt und der Zelldebris nach Sterilisation im Autoklaven verworfen. Der Überstand mit dem Virus wurde durch einen Cäsium Chlorid- Gradienten (Sigma, St. Louis, USA) von Proteinen und Zelldebris gereinigt. Hierfür wurde die virale Suspension mit CsCl auf ein Gewicht von 1,1 g/ ml, die Gradienten mit Tris/ HCL, ph 8.0 und CsCl auf 1,3 mg/ ml und 1,4 mg/ ml abgewogen (Zeiss, GmbH, Karlsruhe, Deutschland). Die virale Suspension wurde gleichmäßig auf 50 ml Falcon- Röhrchen (je 15 ml) verteilt. Mit einer Pasteur- Pipette wurde sie vorsichtig zunächst mit 4 ml des 1,3 mg/ ml und dann mit 3 ml des 1,4 mg/ ml CsCl- Gradienten unterlegt. Die klar abgrenzbare Grenze zwischen beiden Gradienten wurde mit einem Stift markiert und, wenn notwendig, für die Zentrifugation das Gewicht der Röhrchen auf einer Waage mit Hinzugabe von 1,1%iger CsCl- Lösung ausgeglichen. Der Gradient wurde für 4 Stunden bei x g und 20 C in einem swinging bucket - Rotor einer Ultrazentrifuge (Suprafuge 22, Haereus, Langsenbold, Deutschland) zentrifugiert. Mittels einer 5 ml- Spritze und einer 21 gauge- Nadel wurde das nunmehr gereinigte Virusband geerntet und in Falcon-Röhrchen gesammelt. Im Allgemeinen war die Viruslösung transparent bis leicht weißlich-trübe, wohingegen die übrig

26 26 gebliebenen Gradienten eine rötliche Farbe vom Phenol-Rot des Mediums hatten. Letztere wurde autoklaviert und verworfen. Im Anschluss wurde die Präparation entsalzt mittels einer Gel- Filtration mit Sepharose CL-4B (Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK). Es handelte sich hierbei um eine size-exclusion-chromatography mit dem Ziel, das Virus vom CsCl zu trennen. Hierbei wurde eine Glassäule von 50 cm Länge und 3 cm Durchmesser (Econo-Colums Chromatography Column, BioRad, München, Deutschland) benutzt, die in einem 4 C Kühlraum installiert war. Das zur Konservierung notwendige Ethanol im Sepharose Cl- B4-Gel wurde durch das 10fache Volumen an PBS Puffer heraus gewaschen. Das im dreifachen Puffervolumen seiner ursprünglichen Menge gelöste Gel wurde portionsweise in die Säule gegossen, wobei die untere Öffnung der Säule geschlossen war. Nach dem Absetzen des Gels wurde die Säule geöffnet und der Puffer abgelassen. Dieses wurde solange wiederholt, bis sich das komplette Gel in der Säule befand. Nach erneutem Waschen des Gels mit Puffer wurde die purifizierte Viruslösung geladen. Vorsichtig wurde die Probe bei geschlossenem Säulenausgang auf das Gel gegossen und dann mit Puffer aufgefüllt. Anschließend wurde die Säule geöffnet und in Fraktionen in Kryoröhrchen (Cryogenic vials, Nalgene Comp, Rochester, New York, USA) gesammelt. Die Säule wurde über Nacht mit einer konstanten PBS-Puffer-Perfusion gespült und konnte dann, im verschlossenen Zustand, für die nächste Präparation aufbewahrt werden. Die nun konzentrierten und entsalzten Protein-Komponenten der verschiedenen Fraktionen wurden anschließend mit einem Photometer (BioPhotometer, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) mit Hilfe von Quarzküvetten (UVette, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) bei 260 nm auf ihren doppelsträngigen DNA- Gehalt, sowie auf den Grad der Verunreinigung (260/ 280 Ratio) gemessen und diejenigen Fraktionen einbehalten, die das Virus enthielten. Wir haben im Allgemeinen ein Endvolumen von Virusenthaltenden Fraktionen von ca. 30 ml erhalten. Dieses Volumen wurde mit Hilfe von einem Zentrifugalfilter (Centricon Centrifugal Filter Devices, Millipore Schwalbach, Deutschland) auf 2 ml konzentriert, um einen

27 27 möglichst hochkonzentriert Viren für die anstehende Verwendung zu erhalten. Die Probe wurde in den Behälter gefüllt und bei 3300 x g in einem schwingenden Rotor für 12 Minuten bei 4 C zentrifugiert. Wenn das Volumen 20 ml überstieg, wurde die Probe sukzessive in mehreren Aliquots konzentriert. Der Durchfluss wurde hierbei jeweils verworfen. Die konzentrierte Viruslösung wurde in ein Eppendorff-Röhrchen gegeben und die Konzentrationsmembran dreimalig gewaschen durch Auffüllen mit jeweils 300 µl PBS und anschließender Zentrifugation. Das Eluat wurde gesammelt und mit der ersten Probe gemischt. Die Viruslösung wurde mit 10%igem, sterilem Glycerol vermengt und auf geeignete Volumen alliquotiert. Die nunmehr konzentrierten Vierenaliquots wurden beschriftet und bei -80 C gefroren Transfektion der Zellen und Bestimmung der Transfektionseffizienz und Zytotoxizität Transfektion der primären Zellen und Zelllinien Die Zellen wurden am Vortag in 12- well Platten derart eingesät, dass sie am darauf folgenden nahezu konfluent waren. Dieses entsprach in etwa einer Zelldichte von Zellen/ cm 2 für primäre Fibroblasten, / cm 2 für primäre Keratinozyten, Zellen/ cm 2 für HaCat-Zellen (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Fusenig, Universität Heidelberg, Deutschland), und / cm 2 für 293- Zellen. Das Adenovirus wurde in Medium mit 2% FBS verdünnt. Wir transfizierten die Zellen mit einer MOI von 0,1, 1, 10 und 100, wobei die verschiedenen MOIs in einer Verdünnungsreihe hergestellt wurden. Die Platten wurden bei 37 C und 5% CO2 inkubiert und während der ersten vier Stunden im halbstündigen Abstand geschwenkt, um die gleichmäßige Verteilung des Virus über allen Zellen zu gewährleisten. Danach ersetzten wir das mit Virus versetzte Medium durch frisches Medium, die Platten wurden inkubiert und das Medium jeden zweiten Tag gewechselt. Alle Ansätze wurden dreifach bestimmt, sodass sich pro Zelltyp die folgende Anzahl von 12- well Platten ergab: 4 (MOIs) x 3 (Messzeiten) x 3 (Dreifachbestimmung)= 36 wells + 3 (Dreifachbestimmung) x 3 Negativkontrollen= 9 = 4 x 12- well Platten.

28 Quantifikation der Genexpression und Messung der Zytotoxizität Die Transfektionseffizienz wurde 12, 24 und 48 Stunden und 3, 10, 20 und 30 Tage nach der Transfektion ermittelt. Die Expression des GFPs wurde mit einem Fluorimeter (Bio-Teck, Flx-800, Winooski, USA) und einem FACS- Zellzähl-System (Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) bestimmt. Pro Messzeit wurden die vier MOIs in Dreifachbestimmung gemessen. Als Negativkontrolle dienten nicht transfizierte Vergleichszellen. Als Positivkontrolle die transfizierten HEK 293 Zellen. Zunächst wurde zur Dokumentation bei jeder Messung pro MOI eine Aufnahme im Fluoreszenz- Mikroskop (Axiovert 2000, Zeiss, Jena, Deutschland) erstellt und gespeichert (Abbildungen 5-7). Anschließend wurde das Medium durch PBS ersetzt und die Fluoreszenz im Fluorimeter bei einer Sensitivität von 50, 70 und 100 gemessen. Die gemessenen Werte wurden in einem Microplate-reader (Bioteck, Elx-800, Winooski, USA) relativiert mittels des BCA Protein- Assay- Reagenz- Kits (Pierce, Rockford, USA). Dann wurden die Zellen mit Trypsin/ EDTA trypsiniert und in 1 ml PBS resuspensiert. Anschließend wurden 10 µl dieser Suspension mit 20 µl Trypan- Blau (1:3) versetzt und in der Neubauer Kammer unter dem Mikroskop ausgezählt. Für die Messung im Durchflusszytometer wurde die Probe soweit verdünnt, dass auf 100 µl ca Zellen kamen. Diese 100 µl wurden mit 400 µl Verdünnungslösung versetzt und im Zytometer ausgezählt. Abbildungen 5-7: Mit GFP transduzierte HaCat- Zellen nach 12, 24 und 48 Stunden, MOI 100, gezeigt im Fluoreszenz- Mikroskop.