Molekulare Mechanismen der p16-vermittelten Anoikisinduktion in humanen Pankreaskarzinom-Zellen

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1 Aus der Medizinischen Klinik mit Schwerpunkt Hepatologie und Gastroenterologie der Charité - Universitätsmedizin Berlin Campus Virchow-Klinikum Leiter: Prof. Dr. Bertram Wiedenmann Arbeitsgruppe Prof. Dr. Bertram Wiedenmann, Prof. Dr. Stefan Rosewicz Molekulare Mechanismen der p16-vermittelten Anoikisinduktion in humanen Pankreaskarzinom-Zellen Inauguraldissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Naturwissenschaften am Fachbereich Biologie, Chemie und Pharmazie der Freien Universität Berlin vorgelegt von Anja Rabien aus Berlin Berlin 2003

2 1. Gutachter: Prof. Dr. Bertram Wiedenmann 2. Gutachter: Prof. Dr. Volker A. Erdmann Tag der Disputation:

3 INHALTSVERZEICHNIS 1. EINLEITUNG Pankreaskarzinome Der Zellzyklusinhibitor p16 INK4a Das p16 INK4a -Protein als Tumorsuppressor Anoikis Anoikis-Signaltransduktion Die Ras-Familie Ras-Funktionen und Ras-Signaltransduktion Ras als Onkogen Fragestellung MATERIAL UND METHODEN 2.1. MATERIAL Eukaryotische Zellen und Lösungen für die Zellkultur Prokaryotische Zellen und ihr Nährmedium Antibiotika Antikörper Enzyme und Enzympuffer Rekombinante Proteine Größenstandards Kits Mono- und Oligonukleotide Vektoren und Plasmide Chemikalien und Radiochemikalien Sonstige Materialien Geräte

4 2.2. METHODEN Zellbiologische Methoden Durchlicht-Fotografie Anoikis-Test FACS-Analyse Transfektion von Oligonukleotiden Stabile Transfektion Koloniebildungstest Tumorbildung in der Nacktmaus Allgemeine Methoden der Zellkultur Nukleinsäuretechniken Konzentrationsbestimmung von DNA und RNA Agarosegelelektrophorese Klonierungstechniken Gelextraktion von DNA-Fragmenten Isolierung von Plasmid-DNA RNA-Isolierung Nuclear Run-Off RT-PCR Proteintechniken Herstellung von Zelllysaten Konzentrationsbestimmung von Proteinen Diskontinuierliche SDS-PAGE nach Lämmli Western Blot Kopräzipitation von Proteinen Ras-Aktivitätsassay Pulse-Chase Experiment Statistische Auswertung der Ergebnisse 32

5 3. ERGEBNISSE P16-Reexpression restituiert die Anoikissensibilität in Capan-1 Zellen Inhibition Anoikis-relevanter Signalwege in Capan-1 Zellen K-Ras Regulation durch p16 in Capan-1 Zellen P16-Reexpression führt zum Verlust der K-Ras Aktivität in Capan-1 Zellen P16-Reexpression in Capan-1 Zellen reduziert die Expression von K-Ras signifikant K-Ras Inhibition in Capan-1 Zellen K-Ras in Capan-1 Zellen ist nicht durch den Ras-Inhibitor FTS zu inhibieren Ras-Inhibition durch Antisense-Oligonukleotide restituiert die Anoikis in Capan-1 Zellen K-ras Restitution in Capan-1/p16 Zellen Klonierung der K-rasV12 Sense Konstrukte Semi-stabile Transfektion von K-ras2A und K-ras2B in Capan-1/p16 Zellen Stabile Transfektion von K-ras2A und K-ras2B in Capan-1/p16 Zellen Charakterisierung der Capan-1/p16/K-ras Klone K-ras Substitution in Capan-1/p16 Zellen restituiert die Anoikissensitivität signifikant K-ras Substitution in Capan-1/p16 Zellen restituiert klonales Wachstum in Soft-Agar Der p16-vermittelte Verlust der Tumorigenität wird durch die K-ras Reexpression in Capan-1/p16 Zellen nicht beeinflusst Mechanismus der K-Ras Regulation durch p16 in Capan-1 Zellen K-ras scheint nicht transkriptionell reguliert in Capan-1 Zellen -/+p16 Die K-Ras Regulation durch p16 in Capan-1 Zellen ist posttranslational Onkogenes K-Ras wird auch in anderen Zellsystemen durch p16 reguliert 62

6 4. DISKUSSION Anoikis-relevante Signalwege Negative Regulation von K-Ras durch den Tumorsuppressor p16 INK4a in Capan-1 Zellen Onkogenes K-Ras vermittelt Anoikisresistenz in Capan-1 Zellen Onkogenes K-Ras bestimmt den Transformationscharakter von Capan-1 Zellen Der p16-bedingte Verlust der Tumorigenität von Capan-1 Zellen bleibt trotz onkogener K-Ras Aktivität bestehen P16 reguliert K-Ras in Capan-1 Zellen posttranslational Die Bedeutung der Negativ-Regulation von onkogenem K-Ras durch p16 INK4a Weiterführende Fragestellungen ZUSAMMENFASSUNG SUMMARY LITERATURVERZEICHNIS EIGENE VERÖFFENTLICHUNGEN ABKÜRZUNGEN Lebenslauf Danksagung 92 93

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