Mutation & Rekombination!
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- Caroline Baumhauer
- vor 6 Jahren
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1 Bakteriengenetik!
2 Mutation & Rekombination! Mutation:! - vererbte Veränderung der Nukleotidsequenz des Genoms! - selten, führen kaum zur Veränderung eines Genoms!! Rekombination:! - Gene aus 2 getrennten Genomen werden in einem DNA-! Molekül zusammengefügt! - führt zur Entstehung neuer Genkombinationen ohne Mutation! - häufig, bewirken grosse Veränderungen eines Genoms!! Mutation & Rekombination führen zu Evolution!! kein Sex bei Prokaryonten! aber: horizontaler Genfluss!
3 Genotyp & Phänotyp! Mutante unterscheidet sich vom Elternstamm (Wildtyp)! durch Genotyp (= Nukleotidsequenz des Genoms) und dadurch! veränderte Eigenschaften (Phänotyp)! Genotyp: hisc! Protein: HisC-Protein! Mutationen in hisc: hisc1, hisc2, etc.!! Phänotyp: His + His -!
4 Isolierung von Mutanten! - selektierbar: z.b. Antibiotikaresistenz! - nicht selektierbar: z.b. Farbverlust; Isolation durch Screening! Identifizierung über Replikaplattierung!
5 Isolierung von Mutanten! auxotrophe Mutanten: haben spezifischen Nährstoffbedarf stammen von prototrophen Eltern ab!! Penicillinselektion:! tötet nur wachsende Zellen! d.h. prototrophe Eltern werden getötet, auxotrophe Mutanten! reichern sich an!
6 Beispiele für Mutanten!
7 Beispiele für Mutanten!
8 Molekulare Basis der Mutation! Spontane Mutationen: Strahlung, Sauerstoffradikale, falsche!!basenpaarung während der Replikation!Punktmutation= Veränderung eines Basenpaars!! Transition: Purin (A oder G) ersetzt durch anderes Purin, oder! Pyrimidin (C oder T) ersetzt durch anderes Pyrimidin! Transversion: Purin ersetzt durch Pyrimidin oder umgekehrt!
9 Basenpaar-! substitutionen! & Effekte!
10 Leserasterwechsel! Val Pro Cys Val Pro Val Val Leu
11 Molekulare Basis der Mutation! grosse Insertionen oder Deletionen! Translokation, Inversion!! Reversion von Punktmutationen:!!an der gleichen Stelle = Wiederherstellung des Wildtyps!!an anderer Stelle = Suppressor-Mutation!! Insertionen können prinzipiell auch revertieren, aber: Leseraster grosse Deletionen nicht!
12 Mutationsraten! Errors in DNA replication:!! per generation pro Basenpaar!! The frequency of a mutation occuring in a given gene*!! per generation!! *~1000 bp!! missense häufiger als nonsense! stille häufiger als nonsense!! DNA-Polymerase-Fehler am häufigsten in repetitiven Sequenzen! = Mutations-Hot Spots!
13 Mutagenese! induzierte Mutationen durch Mutagene! (chemisch, physikalisch, biologisch)!
14 Mutationen bei DNA-Reparatur:! SOS-Antwort! nicht jede Mutation wird vererbt:! wenn DNA-Schäden vor der Zellteilung korrigiert werden wenn DNA-Schäden DNA-Replikation verhindern (Zelltod)!! DNA-Schäden induzieren SOS-Antwort =! Expression von Genen zur DNA-Reparatur!! LexA Repressor reprimiert SOS-System! DNA-Schaden aktiviert RecA Protease, die inaktiviert LexA!! führt zu Aktivierung von DNA-Polymerasen IV & V, die DNA! reparieren, aber Fehler machen = DNA-Mutasen!
15 SOS-Antwort nach UV!
16 Mutagenese & Carcinogenese:! Ames Test! mutagene Substanzen sind potentielle Krebserreger! Identifizierung mutagener Substanzen mit Hilfe von Bakterien! = Ames Test (Bruce Ames, UC Berkeley, 1972)!! Inkubation eines auxotrophen Stamms mit Substanz,! Detektion der Reversion zur Prototrophie!! verbesserte Version:! Mutatorstämme (sensitiver) + Leberextrakte (Konversion des Mutagens in physiologisch!!!!aktive Form)!!
17 Ames Test:! misst Mutagentitätspotential von Chemikalien! Control Mutagen Disc contains mutagen His-auxotrophic mutant (His - ) of Salmonella enterica
18 Genetische Rekombination! = Austausch von Genen zwischen genetischen Elementen!! homologe Rekombination:! Austausch zwischen homologen DNA-Sequenzen aus 2! verschiedenen Quellen!! bei Bakterien: abhängig von Rec A! (homologe Proteine bei allen Prokaryoten, Archaea, auch in! Eukaryonten)!! Mechanismus:!
19 Einzelstrangbruch!! Helicasen trennen gebrochenen Strang!!vom anderen!! Einzelstrangbindeproteine binden!! Stranginvasion mit Hilfe von RecA! DNA-Basenpaarung!! Austausch homologer Regionen! Heteroduplexbildung!! Auflösung durch Nuclease & Ligase!
20 bei Prokaryonten: kein Sex, d.h. homologe DNA Stränge treffen! sich durch Einführen von homologen DNA Fragmenten in eine! Zelle! Demonstration of genetic recombination using selective medium
21 Genetischer Austausch bei Prokaryonten! durch!! Transformation: freie DNA wird von der Zelle aufgenommen!!! Transduktion: DNA-Transfer durch Bacteriophagen!!! Konjugation: DNA-Transfer zwischen Zellen über direkten!!!zell-zell-kontakt!
22 Genetischer Austausch bei Prokaryonten:! Transformation! natürlich möglich in gram+, gram- Bacteria, einigen Archaea! in der Natur Freisetzung von DNA durch Zelllyse & brechen des! Chromosoms!
23 DNA Transfer! in Bakterien!
24 DNA Transfer in Bakterien!
25 EM Prokaryoten-Chromosom!
26 Rekombinationsexperiment! mit Pneumococcus (F. Griffiths)! S-cells contain a capsule = pathogen
27 Transformation! von Bakterien! Natürlich: Azotobacter Bacillus Streptococcus Haemophilus Neisseria Transfektion mit ΦDNA Induziert: E. coli Doppelsträngige DNA (Plasmide)
28 Transformation! von Bakterien!
29 Allgemeine! Transduktion! E. coli P1 Pseudomonas Salmonella P22 Rhodobacter Staphylococcus Methanothermobacter
30 Spezielle! Transduktion! λdgal Phagen können mit Helferphagen vermehrt werden Reduktion der ΦDNA auf att, cos, ori
31 Spezielle! Transduktion!
32 Electron micrograph of a bacterial chromosome and plasmids Plasmids ~300 different plasmids were isolated from strains of E. coli
33 Plasmide & ihre biologische Bedeutung! Phänotyp Antibiotika Produktion Konjugation Abbau von Octan, Campher, Naphthalin Bildung von Aceton und Butanol Organismus Streptomyces Escherichia, Pseudomonas Rhizobium, Staphylococcus, Vibrio Pseudomonas Clostridium Knöllchenbildung, N 2 -Fixierung Rhizobium Antibiotikaresistenz Resistenz gegen Schwermetalle Bacteriozine: Colicin, Nisin Virulenz Invasion der Wirtszelle Coagulase, Hämolysin, Enterotoxin Tumorgenese in Pflanzen Enterobakterien, Neisseria, Staphylococcus Pseudomonas, Alcaligenes, Staphylococcus E. coli, Milchsäurebakterien Salmonella, Shigella, Yersinia Staphylococcus Agrobacterium
34 Genetic map of the F-(fertility) plasmid of E. coli Gene für konjugativen Transfer Start of transfer Gene für Replikation und Segregation Tn, Is are sequences involved in the in the integration into the host chromosome leading to Hfr-strains
35 Gentransfer durch Konjugation!
36 Genetic map of the conjugative resistance plasmid R100 Transferfunktionen Ori des konjugativen Transfers conjugation transpostion Wirte: Escherichia, Klebsiella, Salmonella, Proteus, Shigella
37 Contact between two bacteria via a pilus F - F + Following the contact via a pilus, there is retraction of the pilus within the donor cell
38 Plasmidtransfer durch Konjugation!
39 Plasmidtransfer! durch Konjugation!
40
41 TABLE 9.3 Some phenotypes conferred by plasmids in prokaryotes Phenotype class a Organisms b Antibiotic production Conjugation Physiological functions Degradation of octane, camphor, naphthalene, Degradation of herbicides Formation of acetone and butanol Lactose, sucrose or urea utilization and nitrogen fixation Streptomyces Escherichia, Pseudomonas, Rhizobium, Staphylococcus, Streptococcus, Sulfolobus, Vibrio Pseudomonas Alcaligenes Clostridium Enteric bacteria Nodulation and symbiotic nitrogen fixation Rhizobium Pigment production Erwinia, Staphylococcus Resistance Antibiotic resistance Resistance to cadmium, cobalt, mercury, nickel, and / or zink Bacteriocin resistance (and production) Virulence Host cell invasion Coagulase, hemolysin, enterotoxin Enterotoxin, K antigen Tumorigenicity in plants Campylobacter, Enteric bacteria, Neisseria, Staphylococcus Acidocella, Alcaligenes, Listeria, Pseudomonas, Staphylococcus Bacillus, Enteric bacteria, Lactococcus, Propionibacterium Samonella, Shigella, Yersinia Staphylococcus Escherichia Agrobacterium
42 F-Plasmid-Integration ins Chromosom! Hfr
43 Hfr-strain: Beginn der Übertragung auf den Empfänger Replication occurs during transfer. F-plasmid >3 % of the E. coli chromosome.
44 Übertragung chromosomaler DNA durch Konjugation
45 Bildung verschiedener Hfr-Stämme durch Insertion des F-Plasmids an spezifischen Stellen
46 Experiment for the detection of conjugation
47 Rate of formation of recombinants by interrupted mating
48 Circular linkage map of the chromosome of E. coli K-12 Genes of the maltose regulon 84.3 min Integragation of Lambda bp 4288 ORFs without F-Plasmid and λ Copy of IS3 element 88% ORFs, ~1% of the genome codes for trnas und rrnas, 0,5% repet. sequences, and ~10% are regulatory sequences such as promoter, operator, oris etc. 10 different IS-elements. By convention 0 min and 0 kbp are at the thr locus.
49 Komplementations-Analyse
50 Komplementations-Analyse
51 Maps of the transposable elements IS2 and Tn5 Transposase 1327 bp Nonsensemutation im Transposasegen 5,7 kbp Resistance genes Kanamycin, Streptomycin and Bleomycin. Tn5 is used for the generation of Tn-mutants in E. coli and other Gram-negative bacteria.
52 Transposon Mutagenese
53 TABLE 9.4 Prokaryote Transposable elements Eukaryote Insertion sequence: IS Transposon: Tn Virus: Mu Yeast: sigma Yeast: Ty Fruit fly: copia, P Maize: Ac Retrovirus: Rous sarcoma, human immunodeficiency virus (HIV)
54 Gene disruption using cassette mutagenesis
55 Genklonierung Der Vektor kann ein Plasmid sein, oder ein virales Genom.
56 Locusspezifische Mutagenese
57 Locusspezifische Mutagenese
58 Genfusionen
59 Plasmid puc19
60 Klonieren mit puc19
61 Klonieren mit puc19
62 Klonierungswirte
63 Klonieren mit E. coli Phage lambda
64 Klonieren mit E. coli Phage lambda EcoRI
65 ~20 kb
66 Klonieren mit E. coli Phage M13
67 Klonieren grosser DNA Fragmente: Bacterial Artificial Chromosomes (BAC) bis zu 300 kb Inserts
68 Klonieren grosser DNA Fragmente: Yeast Artificial Chromosomes (YAC) bis zu 800 kb Inserts
69 Klonieren grosser DNA Fragmente: Yeast Artificial Chromosomes (YAC) bis zu 800 kb Inserts
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