TCI. Arbeitskreis Beschichtungen. Franziska Sambale. Leibniz Universität Hannover. Callinstr Hannover Germany. Institut für Technische Chemie

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Erica Holzmann
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1 Arbeitskreis Beschichtungen Leibniz Universität Hannover Callinstr Hannover Germany

2 Gliederung 1. Optimierung des Screening-Systems mittels des Benchmark- Systems Morphologische Änderungen ECIS Realtime-PCR Expositionsformen: Beschichtung, Suspension, Extraktion 2. Ergebnisse des Pre-Screening der Zwischenprodukte SiO 2 mit Anatas AluC AluC85-Schicht 3. Zusammenfassung und Ausblick

3 Alle Materien Pre-Screening: Zelllinie: z.b. HepG2, A549 Viabilität: MTT/WST-1-Test Morphologie: Calcein-Färbung Signifikante Veränderung Fine-Screening: Zelllinie: z.b. HepG2, A549, NIH-3T3 Energiestoffwechsel: ATP-Gehalt Proliferation: BrdU-Markierung Genexpression: RT-PCR, Microarray Zelltod: Annexin V/PI Assay Signifikante Veränderungen Ausgewählte Materialien Komplexes Screening: Primäre Zellen Zellsysteme, mit denen in-vitro- Situationen simuliert werden können, z.b. Blut-Hirn-Schranke Material hat schädigen Einfluss Material hat keinen schädigen Einfluss Material ist nicht toxisch Signifikante Veränderungen

5 8 Konzentration [ppm] 1 15 2 25 3 35 4 nicht toxisch toxisch 1 75

4 Viabilität [%] Viabilität [%] Benchmark-System: Viabilitätstest Titandioxid Zinkoxid Titandioxid Zinkoxid Konzentration [ppm] nicht toxisch toxisch , Konzentration [ppm] nicht toxisch toxisch

5 Benchmark-System: Morphologische Änderungen Calcein/PI-Färbung Kontrolle 15 µg/cm² (ZnO,1 % Ru) A549-Zellen NIH-3T3- Zellen

6 Benchmark-System: DAPI-Färbung Kontrolle 15 µg/cm² (ZnO,1 % Ru) A549-Zellen

7 Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS)

8 Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS) Siedlung der Zellen Zugabe der NP- Suspension NIH-3T3-Zellen (Kontrolle) NIH-3T3-Zellen 2 ppm (ZnO,1 % Ru) Medium Medium mit 2 ppm (ZnO,1 % Ru)

Expressionsrate (IL-8) Fine Screening: Genexpression 14 12 1 8 6 4 2 Kontrolle ZnO 15 µg/cm² (S) TiO2 25 µg/cm² (S) Molekulare Marker

9 Expressionsrate (IL-8) Fine Screening: Genexpression Kontrolle ZnO 15 µg/cm² (S) TiO2 25 µg/cm² (S) Molekulare Marker Mitose-Marker (ser28) Hitze-Schock-Proteine (hsp32) Entzündungsmaker wie Interleukine (IL-6, IL-8) Zellzyklus/Tumorsuppressorprotein (p53, p38) Apoptosegene

10 Expositionsformen I.S. EN ISO (212): Biological evaluation of medical devices Suspension Extraktion Beschichtung Mediumzugabe 72 h Zelladhäsion und Wachstum 72 h Zelladhäsion und Wachstum 72 h Zelladhäsion und Wachstum 96 h 96 h NP-Zugabe NP-Zugabe 24 h Viabilitätstest 24 h Viabilitätstest Viabilitätstest

11 Viabilität [%] Vergleich verschiedener Expositionsformen A549-Zellen ZnO (,1 % Ru) Beschichtung IC 5 = 4 µg/cm² Extraktion IC 5 = 4 µg/cm² Suspension IC 5 = 21 µg/cm² Konzentration [µg/cm²] 1

12 Viabilität [%] 1. Teilprojekt: Beschichtete Multiwellplatte mit Siliciumdioxid und Titandioxid Eigenschaften Partikelgröße: 15 nm Siliciumdioxid 1 nm Titandioxid 1 A549-Zellen Dispergierzeit: Lackbestandteile:,5 h Ethylalkohol Ethylacetat Wasser Salpetersäure Essigsäure Nanopartikel: Anatas (TiO 2 ) Amorphes Siliziumdioxid Lackschicht: 7 % SiO 2 mit TiO 2 Substrat: Multiwellplatte Extraktionsbedingungen: 72 h, 37 C, 5 % CO 2 3 cm²/ml DMEM (1 % FKS) Kontrolle SiO2 mit Anatas (B) SiO2 mit Anatas (B, nach E) SiO2 mit Anatas (E) maximal theoretische Konzentration im Extraktionsmedium: 23 ng/cm² Faktor 1 höhere Konzentration als in-vivo B: Beschichtung E: Extraktion

13 Viability [%] 1. Teilprojekt: Beschichtete Objektträger mit Siliciumdioxid und Titandioxid Dispergierzeit [h] Partikelgröße in der Lacksuspension [nm] Ultraschallspektroskopie Dynamische Lichtstreuung, Beschichtung Extraktion h (PK-1-1) 24h (PK-NBP11) 25 (I) (II) Partikelgröße [nm] 25 (I) 25 (II) Extraktionsbedingungen: 72 h, 37 C, 5 % CO 2 3 cm²/ml DMEM (1 % FKS) A549-Zellen maximal theoretische Konzentration im Extraktionsmedium: 23 ng/cm² Faktor 1 höhere Konzentration als In-vivo

14 Viabilität [%] 2. Teilprojekt: Aluminiumoxid (AluC, Evonik) Eigenschaften 12 Beschichtung Extraktion Firma Partikelgröße: Suspension AluC, Evonik 11 ± 2 nm (REM) AluC in Ethanol 5 nm (DLS) AluC in Wasser 13 nm (DLS) Beschichtung 1 % (w/w) 2 Substrat Glas-Objektträger Extraktionsbedingungen: 72 h, 37 C, 5 % CO 2 3 cm²/ml DMEM (1 % FKS) K A549-Zellen Al 2 O 3 (H 2 O) Al 2 O 3 (EtOH) Aluminiumoxid, AluC-Pulver (REM)

15 Viabilität [%] 2. Teilprojekt: Aluminiumoxid (AluC85, Evonik) Abk. Verhältnis Gelcoat: Styrol Partikelgröße [nm] Konz. in der Schicht [%] Max. Konz. im Medium µg/cm² S11.1 8: ,1 S11.4 8: ,5 S.11 Ref 1 S11. Ref 2 1: - - 8:2 - - S12.2 8: ,1 S12.3 8: ,1 S12.1 8: ,1 Extraktionsbedingungen: 72 h, 37 C, 5 % CO 2,2 g-schicht /ml DMEM (1 % FKS) maximal theoretische Konzentration im Extraktionsmedium: 3,1 µg/cm² Partikelgröße (REM): 1 ± 2 nm Aluminumoxid mit Trimethoxyoctylsilan K A549 Zellen Gelcoat/Styrol 5 % 3 % 185 nm 22 nm 267 nm

16 Zusammenfassung Optimierung des Screening-Systems mittels des Benchmark-Systems Etablierung weiterer Methoden des Fine-Screenings (Realtime-PCR, ECIS) Pre-Screening folgender Zwischenprodukte Siliciumdioxid mit Anatas Aluminiumoxid (AluC, Evonik) Aluminiumoxid (AluC85, Evonik) keine signifikante Unterschiede zwischen Extraktion und Beschichtung weitere Untersuchung im Fine-Screening erforderlich

17 Ausblick Alle Materien Pre-Screening: Zelllinie: z.b. HepG2, A549 Viabilität: MTT/WST-1-Test Morphologie: Calcein-Färbung Signifikante Veränderung Fine-Screening: Zelllinie: z.b. HepG2, A549, NIH-3T3 Energiestoffwechsel: ATP-Gehalt Proliferation: BrdU-Markierung Genexpression: RT-PCR, Microarray Zelltod: Annexin V/PI Assay Signifikante Veränderungen Ausgewählte Materialien Komplexes Screening: Primäre Zellen Zellsysteme, mit denen in-vitro- Situationen simuliert werden können, z.b. Blut-Hirn-Schranke Material hat schädigen Einfluss Material hat keinen schädigen Einfluss Material ist nicht toxisch Signifikante Veränderungen

18 Ausblick und Ziele Fine-Screening mit Zwischenprodukten (Realtime-PCR) Protokolle zur Herstellung von Beschichtungen Vergleichbare Schicht mit ZnO wie vorher mit AluC85

19 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit. Fragen?

20 Prozessmodelle Zelllinie A549-Zellen (Lunge) NIH-3T3-Zellen (Haut) HepG2 (Leber) PC-12 (Niere) Caco-2 (Darm) Expositionsformen Suspension Beschichtung Extraktion oder Oberflächenwachstum Kulturbedinungen Statisch Dynamisch Statisch Dynamisch Zellwachstum 2D 3D 2D 3D 2D 3D 2D 3D

21 Statisch vs. dynamische Kultivierung Statisch Dynamisch 2D 3D 2D 3D Kontinuierliche Kultivierungsmethode Durchmischung und Zirkulation des Kulturmediums

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