Immunhistochemische Analyse von Msx1,Rankl und Sox 9 bei der terminalen Differenzierung von Osteoblastenunter Bisphosphonatgabe

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1 Aus der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgischen Klinik (Direktor: Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Dr. h.c. F. W. Neukam) der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg Immunhistochemische Analyse von Msx1,Rankl und Sox 9 bei der terminalen Differenzierung von Osteoblastenunter Bisphosphonatgabe eine experimentelle Untersuchung Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde an der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg 2011 vorgelegt von Cornelia Draschowski aus Hindenburg

2 Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Dekan: Referent: Prof. Dr. med. Dr.h.c. J. Schüttler Prof. Dr.med.Dr.med. dent.e.nkenke Korreferent: Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Dr. h.c. F. W. Neukam Tag der mündlichen Prüfung:

3 Für meine Eltern und Großeltern Unser Wissen ist ein Tropfen Was wir nicht wissen, ist ein Ozean Sir Isaac Newton ( )

4 Inhaltsverzeichnis 1. Zusammenfassung Hintergrund und Ziele Methoden Ergebnisse und Beobachtungen Praktische Schlußfolgerung 6 2. Summary Background and targets Methods Results and observations Practically conclusions 7 3. Einleitung und Problemstellung Klinischer Hintergrund Kenntnisstand Indikaton und Einsatz der Bisphosphonate Entwicklung der Bisphosphonate Klinisches Bild der Bishosphonatnekrose Osteoblasten- und Osteoklasteninteraktion Besonderheiten des Kieferknochens Zielsetzung Stand der Forschung Fragestellungen Material und Methoden Patientengut und histopathologische Befundung Immunhistochemische Nachweisreaktion Probenaufbereitung Etablieren der Färbemethode Immunhistochemische Färbung Färbeprotokol Qualitative und quantitative Analyseverfahren Qualitative und semiquantitative Expressionsbestimmung Statistische Analys 23

5 5 6. Ergebnisse Qualitative immunhistologische Ergebnisse Qualitative Ergebnisse der MSX-1- Expression Qualitative Ergebnisse der RANKL- Expression Qualitative Ergebnisse der SOX- Expression Quantitative immunhistologische Ergebnisse Expression von MSX Expression von RANKL Expression von Sox Diskussion Diskussion Probeentnahme und Probenaufbereitung Diskussion immunhistochemisches Verfahren Diskussion Ergebnisse Schlußfolgerung Ausblick Literaturverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Danksagung Lebenslauf 45

6 6 1. Zusammenfassung 1.1.Hintergrund und Ziele Seit 2003 wurde erstmals von Patienten mit bisphosphonat-assoziierter Osteonekrose (BONJ) im Zusammenhang mit Aminobisphosphonaten berichtet. In dieser Dissertation wird die Interaktion von Bisphosphonaten mit den Regulatoren des ossärenremodelings(msx-1, RANK(L), SOX-9) bei klinisch evidenter Bisphosphonatnekrose des Kieferknochens im Vergleich zum gesunden Kieferknochenuntersucht. Ziel ist die Beschreibung der osteogenen Differenzierung unter Bisphosphonateinfluss im Osteoblasten. 1.2.Methoden Im Zeitraum von 09/06-09/07 wurden Proben von 20 Patienten mit BONJ und von 15 Patienten ohne Bisphosphonatnekrose (gesunder Kieferknochen) intraoperativ zur Vergleichsanalyse gewonnen. Durch immunhistochemische Markierung der adressierten Transkriptionsfaktoren (SOX-9, MSX-1) und des Markers der Osteoklastenaktivität (RANK(L)) wurde die Auswirkung der Bisphosphonate auf das ossäreremodling im Kieferknochen beschrieben und durch Bestimmung der Labeling Indices semiquantitativ analysiert Ergebnisse und Beobachtungen ImAlveolarknochen mit BONJ fand sich ein signifikanter Expressionsverlust von MSX-1 (p=0,026)und RANK(L)(p=0,028) im Vergleich zumgesundenalveolarknochen. Die Expression war im Knochen und im umliegenden Bindegewebe gleichermaßen verringert. Die Expression von SOX-9war im Bisphosphonatknochensignifikanterhöht (p=0,031). 1.4.Praktische Schlussfolgerungen Der Einsatz von Aminobisphosphonaten führt zur Expressionsverminderung von MSX-1 und RANK(L).Die Expressionsverminderung von MSX-1 führt zur terminalen Differenzierung derosteoblasten und somit zu einer Hyperkalzifizierung.Die Suppression von MSX-1 zeigt die Wirkung der Bisphosphonate auf die Derivate der kranialen Neuralleiste und ist ein Indiz für die Entstehung der kieferspezifische Bisphosphonatnekrose.EinepersisterendeMsx-Expression wird im Alveolarknochen und im periodontalen Ligament, jedoch nicht im maturen Rumpf- und Extremitätenskelett gefunden. Dies ist ein Indiz für die lokale Wirkung der Bisphosphonate.RANK(L) ist ein essentieller Faktor der Osteoklastendifferenzierung. Die Suppression führt zur nicht Aktivierung von Osteoklasten und somit zu einem verminderten Remodeling. Dies ist ein Indiz für die Determinierung des Knochenturnover. SOX-9 wird als Marker derosteo- und chondrogenen Rekrutierung der Progenitorzellen mitgeführt. Er ist auch ein Marker der enchondralen Ossifikation.

7 7 2. Summary 2.1.Backgroundsandtargets Since 2003 there have been additionel reports about patients with osteonecrosis of the jaw in association with aminobisphosphonates. In this dissertation we examine the interaction of aminobisphosphonates with the modulators of the osseus remodeling(msx-1, RANK(L), SOX- 9)in clinical evident osteonecrosis of the jaw. At clinical evident samplesof osteonecrosis of the jawshallbe conducted a comperative study of the bone remodeling, refer to a hale bone of the jaw. Target is the description of the osteogenicdifferentationunderbisphophonat- influence on osteoblasts. 2.2.Methods At a period from 09/06 till 09/07 samples of 20 patients with osteonecrosis of the jaw and 15 patients with hale alveolar bone were gained intraoperativ for a comperative study. Through a immunohistochemical labeling of the adressedtranscriptionfactors (SOX-9, MSX-1) and the marker of the osteoclast activity(rank(l)) the effecst of bisphosphonates on osseus remodeling at alveolar bone was described and with labeling indices semiquantitativ analyzed. 2.3.Results and observations In alveolar bone with a bisphosphonat associated necrosis we found a significant expression leakage onmsx-1(p=0,026) and RANK(L)(p=0,028) in compare to healthy alveolar bone. The expression was at bone and the surrounding connective tissue comperablydecreased.theexpression of SOX-9were significant increased(p=0,031). 2.4.Practically conclusions The application of aminobisphosphonates leads to a decreased expression of MSX-1 and RANK(L). The decreased expression of MSX-1 leads to terminal differentation of osteoblasts and consequently to a hypercalcemia. A suppression of MSX-1 shows the influenceof the bisphosphonates on the derivates of the neural crest.this is an evidence for the cause of the bisphosphonate- related jaw necrosis. A persisting MSX-1 expression was found in the alveolar bone and the periodontal ligament but not in the mature body and extemityskeleton. This is an evidence for the local effect of the Bisphosphonates. The loss of RANK(L), as an essential factor of the osteoclast differentation leads to a no activation of osteoclasts. This leads to a diminish remodeling. This is an evidence for the determination of the bone turnover. SOX-9 is carried along as the marker of the osteo- and chondrogenic recruitment of progenitor cells. He is a marker of enchondral ossification, too.

8 8 3.Einleitung und Problemstellung 3.1.Klinischer Hintergrund Seit 2003 liegen in der Literatur mit ansteigender Prävalenz Fallberichte von Osteonekrosen unter Bisphosphonat-Medikation vor (45, 46), wobei ausschließlich der Kieferknochen betroffen ist. Die Erstbeschreibung dieser BONJ korreliert zeitlich mit der klinischen Einführung der Aminobisphosphonate (z.b. Zoledronat, Pamidronat), welche ihre Vorgänger in der Potenz um ein vielfaches übertreffen(50, 61, 66). Vergleichbare Phänomene wurden bei der oralen Osteoporosetherapie nicht beschrieben (50). Aminobisphosphonate werden in der adjuvanten Therapie bei malignombedingtenosteolysen (z.b. Knochenmetastasen bei Mamma- oder Prostatakarzinom, hämatologische Neoplasien) angewendet(36, 57). Sie inhibieren die Knochenresorption durch ihre Wirkung auf die Osteoklasten und damit auf den Knochenumsatz(,,boneremodeling )(38, 51, 53, 60). In 50 75% der Fälle wird diebonjals Folge vorangegangener zahnärztlicher oder kieferchirurgischer Eingriffe beschrieben(20).die BONJ ist schwierig zu therapieren, der Therapieverlauf ungewissundhoch rezidivbelastet(2, 32). Das Absetzen der Aminobisphosphonate führt zu keiner Verbesserung der Therapie aufgrund der langen Halbwertszeiten von mehr als 10 Jahren. Die Auswirkungen sind somit dosis- und zeitabhängig(21). Eine Standarttherapie der BONJ ist wegen der nicht vollständig geklärten Pathologie derzeit nicht verfügbar. DaBisphosphonate aufgrund ihrer klinischen Erfolge (signifikant verlängertes krankheitsfreie Überleben, reduzierte Schmerzsymptomatik und verringertes Frakturrisiko) immer häufiger in der adjuvanten Therapie eingesetzt werden und damit ein Ansteigen der Bisphosphonat spezifischen Nebenwirkungen zu erwarten ist, besteht die Notwendigkeit für weitere Forschungen.In der Zukunft sollen Bisphosphonate nicht nur bei Erkrankungen des Knochens eingesetzt werden, sondern auch bei Arteriosklerose (Einfluss auf Endothel- und glatte Muskelzellen), rheumatiodearthritits (Einfluss auf dentritische Zellen und T-Lymphozyten), Tumormetastasierung (Einfluss auf Stromazellen und Gefäße), Diabetes mellitus (Einfluss auf die Mikroangiopathie), bei denen auch das Osteoprotegerin/RANKL/RANK- Systems von Bedeutung ist. Ein Ansatz liegt in der entwicklungsgeschichtlichen Abstammung der Kieferosteoblasten. Diese entstehen aus Derivaten der kranialen Neuralleiste, während skelettaleosteoblasten ihren Ursprung im mesenchymalen Gewebe finden. Kieferosteoblasten sind neuroektodermaler Herkunft. Aufgrund der Neuralleistenabstammung der Kieferosteoblasten gibt es eine zusätzliche Regulation der Osteoproliferation und der Differenzierung über die MSX-1/ BMP- 2/4 Antagonisten bezüglich des Überwiegens von Osteoproliferation/Osteoklastogenese. Im vorliegenden Dissertationsprojekt soll festgestellt werden ob Bisphosphonate eine Auswirkung auf die Derivate des 1.Kiemenbogens MSX-1(Osteoproliferation im Kiefer) und RANK(L)(Marker der Osteoklastenstimulation) haben. SOX-9 wird als Marker der osteo- und

9 9 chondrogene Rekrutierung der Progenitorzellen mitgeführt. Die dargelegten pathogenetischen Überlegungen haben hypothetischen Charakter, und ein abschließendes formales pathogenetisches Konzept für die Entstehung von Osteonekrosen im Kiefer unter Bisphosphattherapie steht noch aus Kenntnisstand Indikation und Einsatz der Bisphosphonate Therapeutischer Schwerpunkt der Bisphosphonateistdie Behandlung von Osteolysen, Knochenschmerzen und hyperkalzämischen Situationen (Tumortherapie)sowie das Verhindern von pathologischen Frakturen(72, 7).Die Dosierung und die Therapiedauer richten sich dabei nach dem eingesetzten Bisphoshonat, seiner Potenz und der jeweiligen Erkrankung. Aminobisphosphonatehabeneinen antiproliferanten und proapoptotischen Effekt auf das Tumorwachstum(5,25).Sie inhibieren die Adhäsion der Tumorzellen an die Knochenoberfläche und verhindern deren Invasion durch die extrazelluläre Matrix. Eine Bisphosponattherapie erfolgt in der Regel über Jahre(5, 26, 25,36,37).In einer Fallserie von 7500 Patienten wurde ein Vorkommen der BONJ in 2-11% bei Myelompatienten, 1-7% bei Brustkrebspatienten, 6-15% bei Prostatakrebspatienten und 5% bei Osteoporosepatientengefunden (1). Tabelle 1. zeigt die drei Haupterkrankungen welche durch Bisphosphonatmedikation zur Osteonekrose führen(23): bei Männern bei Frauen Prostatakrebs 43% Brustkrebs 59,5% multiples Myelom 36,4% multiples Myelom 27,8% Nierenkrebs 8,5% maligne hämatologische Erkrankung 4% Tab1. Haupterkrankungen Dabei wurden die Patienten, dieeineosteonekrose entwickelten am häufigsten mit Zoledronat behandelt (82,4%)(23) Entwicklung der Bisphosphonate Ausganspunkt waren die Pyrophosphate mit ihrer zentralen P-O-P Bindung. Bei oraler Gabe wird die Phosphor-Sauerstoff- Verbindung enzymatisch und hydrolytisch gespalten. Bisphosphonate besitzen eine P-C-P Bindung, welche enzymatisch nicht gespalten wurde. Aus der allgemeinen Formel R1R2C(PO3H2)(PO3H2) wurden R1 und R2 in den verschiedensten Kombinationen von -H, -NH2, -OH, -CH3, längeren Alkyl-Gruppen, -Cl oder - NR3R4 gebildet(34). Prinzipiell werden drei Generationen von Bisphosphonaten entsprechend ihrer Potenz (notwendige Substanzmenge, die die Knochenresorption effektiv hemmt) unterschieden.

10 10 Bisphosphonate der 1. Generation bilden mit Adenosinmonophosphat ein nicht hydrolisierbares ATP-Analog. Die Aminobisphosphonate der zweiten Generation hemmen kompetitiv die enzymatische Umsetzung von Dimethylallylpyrophosphat zu Geranyl-Pyrophosphat, während die der dritten Generation zusätzlich den nächsten Reaktionsschritt von Geranylpyrophosphat zu Farnesylpyrophosphat blockieren Klinisches Bild der Bisphosphonatnekrose Bisphosphonat-assoziierte Nekrosen werden ausschließlich im Kieferbereich und in 50-75% der Fälle in Folge dentoalveolärer Traumata bzw. zahnärztlich-chirurgischer Eingriffe gesehen. Die Mandibula ist im Verhältnis 2:1 häufiger betroffen als die Maxilla. Bereiche mit dünner Mukosa wie Knochenprominenzen und Exostosen,sind am häufigsten betroffen (66, 46, 47). EineBONJ besteht, wenn eine ossäre Läsion im Kieferbereich länger als acht Wochen persistiert und keine Tendenz zur Sekundärheilung zeigt. Voraussetzung ist, dass die erkrankte Läsion nicht einen chirurgischen Eingriffs oder einer Radiotherapie unterzogen wurde, noch das es sich um eine lokale Metastasierung handelt.röntgenologisch werden sklerotische Bezirke und mikrobiologisch ein unspezifisches Erregerspektrum nachgewiesen. In der histologischen Untersuchung findet man granulozytäre Infiltrate bei überwiegend fehlender Anfärbbarkeit von Osteozytenkernen, Rarefizierung des Gefäßnetzes und eine Fibrosierung(99). Desweiteren beobachtet man leere Osteozytenlakunen(63). Die BONJ imponiert klinisch als freiliegende, ossäre Läsion oder nicht heilende Extraktionsalveole mit entzündlicher Weichgewebebeteiligung (22). Desweitern können Fisteln entstehen welche die Mundhöhle mit den umliegenden Strukturen wie z.b. Nasenhöhle, Sinus maxillaris oder der äußeren Wangenhaut, verbinden(62). Abb.1. Klinisches Bild der Osteonekrose von der Mund-, Kiefer-, und Gesichtschirurgischen Klinik am Universitätsklinikum Erlangen zur Verfügung gestellt

11 11 Die Symptome ähneln einer Osteoradionekrose oder einer Osteomyelitis. Im Gegensatz zu einer Osteomyelitis ist bei Patienten mit einer Osteonekrose keine Sequesterbildung zu erkennen. Die Osteonekrose kann sowohl bei bezahnten als auch bei unbezahnten Patienten auftreten. Bei bezahnten Patienten ähnelt die Osteonekrose anfangs einer Parodontitis marginalis, wobei es nach Extraktion zu Wundheilungsstörungen mit fortschreitender Knochenexposition kommt.weiterhin differieren die Symptome von einer schmerzlosen Kieferläsion bis zu starken Kieferschmerzen die von einem Foetor ex ore begleitet werden. Röntgenologisch ist der Kieferknochen im Frühstadium häufig unauffällig. Im weitern Verlauf zeigt sich eine Verschattung und Verbreiterung des peridontalen Ligamentes. Abb.2. OPG eines Patienten mit Bisphosponattherapie. Das periodontale Ligament um Zahn 46 zeigt eine Verschattung. Von der Mund-, Kiefer-, und Gesichtschirurgischen Klinik am Universitätsklinikum Erlangen zur Verfügung gestellt Berichtet wird von einer Inzidenz, bei Onkologiepatienten mit einer hochdosierten intravenösen Bisphosphonattherapie, im Bereich von 1%-12% während einer Expositionsdauer von 36 Monaten(35). Osteonekrosenbei Osteoporosepatientenmit einer oralen Bisphosphonattherapieliegendagegen unter 1 Fall bei bis Jahren der Exposition(35, 31, 70, 71) Osteoblasten und Osteoklasteninteraktion Der Knochenauf- und umbau wird durch hochspezialisierten Knochenzellen aufrechterhalten: die auf deroberfläche des Knochens gelegenen Osteoklasten, Osteoblasten und dieintraossärenosteozyten(6,43). Die Schlüsselrolle spielt aber das RANK(L)/Osteoprotegrin- System für das Verständnis der Osteoklastogenese, der Steuerung der Knochenresorption und der lokalen Umbauvorgänge. RANK(L) ist ein homotrimeres, transmembranes Protein der tumornecrosisfactor (TNF) receptor-superfamily. RANK(L) ist der Hauptstimulus der Reifung der Osteoklasten.Die

12 12 Osteoblasten besitzen in ihrer Cytoplasmamembran das Protein RANK(L) wobei der Rezeptor für RANK sich auf den Osteoklasten und Osteoklasten/Makrophagen- Vorläuferzellen befindet. RANK ist ein homotrimerestransmembranes Protein der Osteoklastenprogenitormembran. Die Wirkung von RANK(L) wird von OPG gesteuert welches als löslicher endogener Rezeptorantagonist wirkt. OPG ist ein lösliches Mitglied der TNF receptor- superfamily. Es konkurriert mit dem Rezeptor RANK um die Bindung von RANKL und inhibiert so die Wirkung von RANKL. Eine Hochregulierung von RANKL geht mit einer Downregulierung von OPG einher (3, 12, 58,74) MSX-1 stimuliert die Osteoblastenproliferation während der Skelettentwicklung und Frakturheilung(38). Es ist ein wichtiger Faktor für die Knocheninduktion und das Remodeling(68, 70). Die terminale Osteoblastendifferenzierung im maturen Knochen wird von MSX-1 inhibiert (18). Eine persisterende MSX-Expression wird im Alveolarknochen und im periodontalen Ligament, jedoch nicht im maturen Rumpf- und Extremitätenskelett gefunden(59). Die postnatale, überschießende, pathologische Stimulation von MSX im Alveolarknochen ist mit polyzystischen, osteolytischen Resorptionszonen und einer Osteoklastenaktivierung, sowie einer verminderten Expression des osteoblastendifferenzierenden Transkriptionsfaktors Runx-2 (Cbfa1) und verminderter Kalzifizierung assoziiert(31). Die wichtigsten Transkriptionsfaktoren für die Bildung von Chondrozyten und Osteoblasten sind SOX-9 und CBFA-1 (Runx2).SOX-9 ist ein Transkriptionsfaktor der SOX-Familie aus der Gruppe der High Mobility Groupbox Gene.Es reguliert die frühe Differenzierung der kondensierenden Mesenchymzellen, welche sowohl der Chondro- als auch der Osteogenese vorangeht(54). Zusätzlich stimuliert SOX-9 zusammen mit weiteren Mitgliedern der SOX- Familie die Transkription einer Reihe von Matrix- Genen, darunter Typ-2- Kollagen und Aggrecan. EineHaploinsuffizienz des SOX-9- Gens manifestiert sich in einer vorzeitigen Ossifikation des Skelettsystems. Dies resultiert in einer meist letalen Erkrankung, der Kampomelen Dysplasie.Die Wirkungsmechanismen der Bisphosphonate sind zellulär und betreffen hauptsächlich die Osteoklasten und die Mineralisation der Knochenmatrix. Die an denhydroxylapatitkristallen der Matrixoberfläche gebundenen Bisphosphonate werden von den Osteoklasten zusammen mit der Matrix phagozytiert. Ruffledborders die mit Bisphosphonatenbeschichtet sind behindern das Anlagern von Osteoklasten an der Knochenoberfläche(4,5). Eine verminderte Produktion von Laktatsäure, Protonen und Protonen- ATPasen unter den ruffledborders, werden beobachtet. Mit Bisphosphonaten behandelte Osteoklasten wurden auf mineralisierte Substrate gegeben. Dies führte zu einer verminderten Anzahl der Resorptionslakunen, was einer reduzierten Knochenabbaufähigkeit entspricht und für einen intrazellulären Wirkungsmechanismus der Medikamente auf die Osteoklasten spricht (13).

13 13 Aminobisphosphonate blockieren den RANK-Liganden(65).In höherer Dosis kommt es zur Induktion einer Apoptose in den Osteoklasten(16). Bisphosphonateentfalten ihre Wirkung über die Hemmung des Schlüsselenzyms des Mevalonsäureweges (Farnesyldiphosphatsynthetase) und verhindern so die posttranslationellephenylierung GTP-bindender Moleküle, die für die Funktion des Zytoskelettes notwendig sind(11, 19, 40, 65). Die apoptotische Wirkung der stickstoffhaltigen Bisphosphonatewird durch ihren inhibitorischeneinfluß auf den Stoffwechselweg der Mevalonsäure erklärt(64). Während Aminobisphosphonate die Proliferation, Differenzierung und Migration von Osteoklastenvorstufen hemmen, wirken Bisphosphonate ohne Aminogruppe nur auf reife Osteoklasten (63).Zusammenfassend kommt es zu einer Hemmung der Osteoklastenadhäsion, Abnahme der Osteoklastenzahl und zu einer vorzeitigen Induktion der Apoptose der Osteoklasten(30, 67, 14).Osteoblasten werden von Bisphosphonaten in ihrer Wirkung direkt und indirekt gehemmt. Sie hemmen indirekt über die Osteoblasten die Osteoklastenaktivierung und rekrutierung ( Osteoclastresorptioninhibitor, ORJ). Ebenso wurde gezeigt, dass Bisphosphonate indirekt über die Osteoklastenhemmung auch einen Effekt auf die Knochenbildung haben. Dabei kommt dem RANK/ RANKL/OPG- System eine bedeutende Rolle zu. Eine Eingriffsmöglichkeit in das RANK/RANKL/OPG-System bietet der humane monoklonale Antikörper Denosumab. Dieser wird zur Verhütung von Frakturen bei postmenopausaler Osteoporose erprobt. Denosumab ist ein Antikörper der mit hoher Affinität an RANKL bindet. Es imitiertdemnach funktionell die Rolle von OPG.Die Entwicklung und die Aktivität der Osteoklasten werden gehemmt. Bei der Anwendung gegen die Osteoporose wurden keine Fälle von einer BONJbeschrieben(73). Allerdings wurde von einem Fall von Osteonekrose des Kieferknochens bei einem Tumorpatienten der Denosumab erhielt berichtet. Der Einsatz von Denosumab beimetastatischen Knochenerkrankungen wird derzeit erforscht. Ein Ansteigen von Fällen einerosteonekroseist zu erwarten(73). Solltensich die Fälle häufen, liegt der Verdacht nahe, dass die Nekrose des Kiefers durch die Anti- RANKL Behandlung induziert wird Besonderheiten des Kieferknochens Der Gesichtsschädel ist ektodermalen Ursprungs, während das Rumpf- und Extremitätenskelettmesodermalen Ursprungs ist. Aus dem Ektoderm differenziert sich das Oberflächenektoderm, das Kopfmesektoderm (Schädelknochen) und das Neuroektoderm (Neuralleiste).Die Neuralleistenzellen sind pluripotent und können sich in verschiedene Zelltypen und Gewebsverbände spezifizieren, wobei die Neuralleistenzellen des Kopfes dabei das größte Differenzierungspotential besitzen. Sie bilden z. B. Teile der Zähne, Knorpelelemente des Kiefers, Strukturen des peripheren Nervensystems (23), Blutkapillare und Osteoblasten.

14 14 Für die weitere Differenzierung der pluripotenten kranialen Neuralleistenzellen werden MSX- I und MSX-II benötigt, welche an der Entwicklung des Gesichtsschädels, der Kiemenbögen, der epithelialen und mesenchymalen Organogenese einschließlich der Zahnentwicklung, beteiligt sind (33). Die kranialen Neuralleistenzellen bilden unter anderem die Pharyngealbögen- und Schlundtaschen. Aus dem 1. Kiemenbogen entsteht der Kieferknochen. Durch intramembranöse (desmale) Ossifikation bilden die kranialen Neuralleistenzellen Knochen. Der Knochen entwickelt sich direkt aus dem mesenchymalen Bindegewebe. Undifferenzierte Mesenchymzellen entwickeln sich zu Osteoblasten und beginnen Osteoid- Matrix zu bilden Zielsetzung Ziel der vorliegen Dissertation ist die vergleichende in- vivo Analyse der Interaktion von Bisphosphonaten mit den Regulatoren des ossärenremodelings bei klinisch evidenter Bisphosphonatnekrose im Kieferknochen (RANK(L), MSX-1, Sox-9). An klinischen Proben Bisphosphonat- assoziierter Nekrosen soll eine vergleichende Anaylse des Knochenremodelings (MSX-1, RANK(L), Sox9) zum gesungen Kieferknochen durchgeführt werden. In dieser Studie soll untersucht werden, ob Bisphosphonate zur Expressionssuppression von MSX-1 und RANK(L) beitragen.msx-1 ist ein essentieller osteoinduktiver Faktor der Zahnund Kieferentwicklung( 1. Kiemenbogen ) während der Embryonalphaseund hat Einfluß auf RANK(L).Ein möglicher Pathomechanismus der BONJ könnte der Msx-1 Verlust bei Zahnextraktion sein. Somit sind ein Proliferationsstop und ein Überwiegen der terminalen Differenzierung in denosteoblasten im Einklang mit der klinischen Beobachtung der Sklerosierung der Extraktionsalveole. Klinisch ist die Affinität von Bisphosphonaten zu Derivaten der Neuralleiste belegt(44). Da für osteoporotischen Knochen eine reduzierte Kalzifizierung mit möglicher MSX-1-Überexpression ursächlich ist, wären vergleichende Untersuchungen zu Expression und Supprimierung (RANK(L), Msx-1, BMP 2/4, Cbfa1) zum Verständnis der Bisphosphonat-Knochen-Interaktion sinnvoll. Es liegen keine Daten zur differenziellen Interaktion von Bisphosphonaten mit Osteoblastenmesenchymaler Herkunft und Osteoblastenkranialer Neuralleisten Abstammung vor. Da bis jetzt die Suppression von RANK(L) gezeigt wurde, sind möglicherweise Kiefernekrosen durch den RANK(L)- Verlust verursacht oder setzt schon mit der Suppresion von MSX-1 ein. Der Einsatz von Denosumab in der Onkologie und das Auftreten von Osteonekrosen des Kiefers bei der Behandlung könnten diese Theorie erhärten. Dieser Mechanismus wird in vitro überprüft und liefert damit eine Möglichkeit zur Klärung der Pathogenese der Osteonekrose des Kieferknochens. Die Transkriptionsfaktoren für den Knochenaufbau bearbeitet Mitdoktorantin Michaela Fitz.

15 Stand der Forschung Seit 2003 liegen wiederholt in der Literatur mit steigender Prävalenz Fallberichte vor, die über Patienten mit aseptischen Knochennekrosen in Ober- und Unterkiefer berichten (17, 45, 46). Die Erstbeschreibung dieser BONJkorrelliert zeitlich mit der klinischen Einführung der intravenös applizierten Aminobisphosphonate mit antiresporptiver Potenzsteigerung um Faktor (Alendronat, Zoledronat, Pamidronat) (17,24, 45, 46). Aktuell sind nur nitrogenhaltige Bisphosphonate bekannt, die eine Kiefernekrose verursachen (46). Aseptische Osteonekrosen des Kiefers sind eine Komplikation von Bisphosphonaten. Sie treten vor allem bei Tumorpatienten auf, wurden aber vereinzelt auch während der Therapie einer Osteoporose beobachtet (72).Während der Bisphosphonattherapie wurde eine Abnahme von RANK(L)exprimierenderOsteoblasten gezeigt (15, 65). Der Verlust von RANK(L) auf Osteoblasten als essentiellen Faktor der Osteoklastendifferenzierung, führt zur Nichtaktivierung der Osteoklasten (41) und damit zur Störung des Knochenumbaus. 4.Fragestellungen Ziel der vorliegen Dissertation ist die vergleichende in- vivo Analyse der Interaktion von Bisphosphonaten mit den Regulatoren des ossärenremodelings des Knochenumbaus bei klinisch evidenter Bisphosphonatnekrose im Kieferknochen (RANK(L), MSX-1, Sox-9, Cbfa-1, BMP2/4). An klinischen Proben bisphosphonat- assoziierter Nekrosen soll eine vergleichende Anaylse des Knochenremodelings (MSX-1, RANKL, Sox9, Cbfa-1, BMP 2/4) zum Normalknochen durchgeführt werden.da sich Material und Methoden zur Klärung der Fragen gleichen, werden die jeweiligen experimentellen Ansätze ohne Berücksichtigung ihrer chronologischen Reihung parallel beschrieben. 1.Bestehen qualitative und quantitative Expressionsunterschiede für MSX-1 und RANKL beim Normalknochen und Knochen mit Bisphosphonatnekrose? 2.Bestehen qualitative und quantitative Exprssionsunterschiede bezüglich derosteogenen Differenzierung im osteonekrotischen und im gesunden Alveolarknochen? 3.Bestehen quantitavie und qualitative Expressionsunterschiede bezüglich der osteogenen Differenzierung (Sox- 9) im osteonekrotischen und gesunden Alveolarknochen? 4.Bestehenquantitative und qualitative Expressionsunterschiede im Vergleich zu den Faktoren Cbfa-1, BMP2/4 im osteonekrotischen und gesunden Alveolarknochen? 5.Liefert die Hypothese, dass Kieferosteoblasten aus Derivaten der kranialen Neuralleiste entstehen, einen Klärungsansatz für die Entstehung der Kiefernekrose im Alveolarknochen?

16 16 5. Material und Methode 5.1. Patientengut und histopathologischebefundung Im Zeitraum von 09/06 09/07 wurden 20 Patienten mit BONJ und 15 Patienten ohne Bisphosphonatnekrose untersucht. Die Patienten stammen aus dem Patientengut der Mund- Kiefer- Gesichtschirurgie Erlangen und aus dem Institut für Pathologie, Klinikum der FAU- Erlangen. Bei den Normalpatienten waren 7 weiblich (Durchschnittsalter: 41,2 ±18,7) und 8 männlich (Durchschnittsalter: 38,3 ±10,3). Die Proben wurden bei Routineeingriffen, wie Zahnextraktion, Dysgnathieoperation oder Mittelgesichtsfraktur gewonnen. Patienten mit BONJ, davon waren 11 weiblich (Durchschnittsalter: 66,7± 7,4) und 9 männlich (Durchschnittsalter: 71,3± 5,7) bekamen intravenös Bisphosphonate zur Behandlung von Brust- und Prostatakrebs, Multiples Myelom oder Osteoporose. Davon erhielten 14 Patienten Zoledronat und 5 Patienten Pamidronat. Ein Patient bekam eine Kombination von beiden. Die Bisphosphonattherapie erfolgte 33± 12 Monate bevor ein chirurgischer Eingriff folgte. Keiner der Patienten entwickelte eine Nekrose 12 Monate vor der Bisphosphonatapplikation. In 9 von 20 Fällen entwickelte sich eine Nekrose in der Maxilla und bei 11 Patienten in der Mandibula. Tabelle 2. zeigt eine Übersicht der Normalpatienten und Tabelle 3. eine Übersicht der Bisphosphonatpatienten. Nr. Geschlecht Alter in Jahren Chirurgischer Eingriff bei Probeentnahme 1 W 30 Retinierter Weisheitszahn Probenlokalisation Mandibula 2 M 45 Dysgnathie Mandibula 3 W 29 Dysgnathie Mandibula 4 M 44 Zahnextraktion Mandibula 5 W 91 Fraktur Mandibula Mandibula 6 M 62 Zahnextraktion Mandibula / Maxilla 7 M 18 Dysgnathie Mandibula 8 M 44 Zahnextraktion Mandibula 9 W 55 Metallentfernung nach Bimax Mandibula 10 M 41 Zahnextraktion Maxilla 11 M 51 Zahnextraktion Processusmuscularis

17 17 12 W 40 Zahnextraktion Mandibula 13 W 58 Mittelgesichtsfraktur Maxilla 14 M 23 Zahnextraktion Mandibula 15 W 20 Zahnextraktion Mandibula Tab.2 Nr. Geschlecht Alter in Jahren Diagnose Medikament Dauer der BP Applikation in Monaten Probe 1 W 67 Mammakarzinom Zolendronat 48 Maxilla 2 M 62 Multiples Myelom Zolendronat 24 Maxilla 3 M 78 Multiples Myelom Pamindronat 32 Mandibula 4 M 71 Prostatakarzinom Zolendronat 36 Mandibula 5 W 75 Mammakarzinom Zolendronat 24 Mandibula 6 M 76 Multiples Myelom Zolendronat 96 Mandibula 7 W 46 Mammakarzinom Zolendronat 12 Maxilla 8 M 81 Prostatakarzinom Pamindronat 24 Maxilla 9 W 61 Multiples Myelom Zolendronat 24 Maxilla 10 W 69 Mammakarzinom Pamindronat; 32 Mandibula Zolendronat 11 W 65 Mammakarzinom Zolendronat 12 Mandibula 12 W 70 Mammakarzinom Zolendronat 36 Maxilla 13 W 57 Mammakarzinom Zolendronat 12 Mandibula 14 M 72 Prostatakarzinom Zolendronat 32 Maxilla 15 M 62 Prostatakarzinom Zolendronat 12 Mandibula 16 W 72 Mammakarzinom Zolendronat 34 Mandibula 17 W 83 Mammakarzinom Pamindronat 20 Mandibula

18 18 18 M 64 Prostatakarzinom Pamindronat 60 Maxilla 19 W 56 Mammakarzinom Pamindronat 12 Mandibula 20 M 92 Prostatakarzinom Zolendronat 23 Maxilla Tab.3. Ein Teil jeder gewonnenen Probe wurde der pathologischen Routinediagnostik zugeführt in Zusammenarbeit mit Prof. Dr.med. Amann, welche weitere Proben zur Verfügung stellte(institutfür Pathologie, Klinikum der FAU Erlangen-Nürnberg, Direktor: Prof. Dr. med. A. Hartmann). Die Proben wurden intraoperativ gewonnen und anteilig für die immunhistochemische Untersuchung (4%-p-Formaldehyd)asserviert. ImLabor der Mund- Kiefer- Gesichtschirurgie wurden von uns etablierte immunhistochemische Analysen der klinischen Proben durchgeführt. 5.2.Immunhistochemische Nachweisreaktion Probenaufbereitung Zu Untersuchungsbeginn lag das Probenmaterial bereits formalinfixiert und paraffineingebettet vor, allerdings war es mit unbekannter Formalinkonzentration und bei unterschiedlicher Fixationsdauer uneinheitlich vorbehandelt worden. Die immunhistochemischen Nachweisreaktionen wurden an diesem Material von uns etabliert. Als Optimum erwies sich bei der Fixation eine 4%-ige Formaldehydlösung (phosphatgepuffert, ph 7,4 bei 4 C) bei einer Fixationsdauer von 6-24 Stunden.Die Fixationsdauer richtete sich nach der Größe des Probenmatrials.Das Entkalken der Knochenstücke erfolgte mittels EDTA. Die formalinfixierten Proben wurden dehydriert und in Paraffin eingebettet. Gewebeschnitte wurden als Längsschnitte (3µm Schichtdicke, Schlittenmikrotom Jung HN 40, Leica, Nussloch, Deutschland) durch den fixierten Knochen geführt Etablieren der Färbemethode Die immunhistochemischen Färbungen für Sox-9, RANK(L), MSX-1, BMP-2/4 und Runx-2 wurden in einem Vorversuch etabliert (5 Patienten). Die Vorversuche wurden per Hand durchgeführt. Durch immunhistochemische Markierung der regulierenden Zytokine (BMP2/4), der adressierten Transkriptionsfaktoren (SOX-9, MSX-1, Cbfa-1) und des Markers der Osteoklastenaktivität (RANK(L)) wurde die Auswirkung der Bisphosphonate auf das ossäreremodeling im Kieferknochen beschrieben. In den Vorversuchen wurde eine Abnahme RANK(L)- positiver und eine Zunahme BMP-2/4-positiver Osteoblasten/Osteozyten in den Randbereichen bisphosphonat- assoziierter Knochennekrosen gesehen. Weiterhin fand sich ein fast vollständiger Expressionsverlust für MSX-1.Für die weitere Durchführung wurden die

19 19 Färbungen mit dem Färbeautomaten für Immunhistochemie vorgenommen. (DAKO Autostainer) Immunhistochemische Färbung LSAB-Methode Zur Lokalisation einer Expression von MSX-1, RANK(L) und SOX-9 erfolgte der spezifische Nachweis mit Hilfe der indirekten Streptavidin-Biotin-Methode. Nach spezifischer Bindung eines Primärantikörpers an das nachzuweisende Epitop wurde ein biotinylierter Sekundärantikörper eingesetzt, der spezifisch für die Bindung an den Primärantikörper ist. Anschließend erfolgte die Inkubation mit der StreptavidinAlkaline Phosphatase (AP). Bei der LAB- Methode erfolgt das Auftragen eines direkt mit dem Enzym (AP) gebundenen Avidins. Das Biotin wird direkt an das Streptavidin gebunden (direkt markierter Komplex).Um die Reaktion sichtbar zu machen wurde mit einer Substat- Chromogenlösunginkubiert. Avidin Biotin Peroxidase Methode sek. Antikörper Avidin Biotin prim. Antikörper Peroxidase Epitop Abb.3.Schemazeichnung der Avidin-Biotin-Meerettichperoxidase-Methode(75) Die Lokalisation der Farbreaktion repräsentiert das mit dem Primärantikörper gesuchte Antigen. Die angefertigten Schnitte wurden nach dem Dako Real Kit/AP für spezifische Epitope von MSX-1, RANK(L) und SOX-9 gefärbt. In der vorliegenden Arbeit kamen alle gesuchten Epitope von MSX-1, RANK(L) und SOX-9 durch diese Methode zur farblichen Darstellung.

20 Färbeprotokoll Als Vorbereitung für die immunhistochemische Färbung wurden die Schnitte in Xylol 3x15 Min. entparaffiniert und danach über die absteigende Alkoholreihe (Propanol 100 %, 95 %, 90 %, 70 % je 2 x 5 Min.) in PBS gebracht. Im PBS erfolgte die Hydrierung (PBS, ph 7,2-7,6, Gibcophosphatbufferedsaline, 3x2 Min., RT). Für die Desintegration der benötigten Epitope wurde Citratpuffer zur Hitzedemaskierung verwendet (ph6,0 30 Min. kochen, Min. abkühlen). Die Epitopmarkierung erfolgte mit polyklonalen P-AK im Dako- Autostainer unter Verwendung der angebenen AK-Verdünnungen. Verdünnungsmedium war Antibody- Diluent (Dako, Glostrup, Dänemark). Die verwendeten Antikörper greifen an Epitopen auf den, MSX-1, RANK(L),Cbfa-1, BMP und SOX- 9 Isoformen an. Als Sekundär AK wurde ein biotinylierter, polyklonaler AK eingesetzt (15 min, RT). Verdünnt wurde mit Antibody- Diluent (Dako). Die Inkubation erfolgte mit der StreptavidinAlkaline Phosphatase (AP) (DAKO, Glostrup, Dänemark, 15 min, RT). Sichtbar gemacht wurde die Reaktion mit dem RED Chromogen (Dako Real Tm Detection System). Anschließend erfolgte eine Kernfärbung mit Haemalaun (Dako S 3301, Glostrup, Dänemark). Verwendete Primärantikörper Antikörper Bindungslokalisation Antikörper- Verdünnung Hersteller an gesuchten Protein Spezies MSX1 Aminosäuren Kanninchen Anti-human, Sigma M :100 Sigma- Aldrich Chemie GmbH, Deutschland RANKL N- terminalesende Ziege Antihuman, sc :100 Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, Kalifornien, USA SOX9 C- terminales Ende Kanninchen, Anti-human, sc :50 Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, Kalifornien, USA Tab. 4. Zeigt die im Immunoblot eingesetzten primären Antikörper.

21 21 Verwendete Sekundärantikörper gesuchtes Spezies Antikörper Verdünnung Hersteller Protein MSX1 Kaninchen Lösung A, Dako Real Kit (K5005) Lösung A Dako, Glostrup, Dänemark RANKL Ziege BiotinyliertKannic hen Anti-Ziege 1:200 Dako, Glostrup, Dänemark SOX9 Kanninchen Lösung A, Dako Real Kit (K5005) Lösung A Dako, Glostrup, Dänemark Tab.5. zeigt die bei den Immunoblot-analysen verwendeten sekundären, biotinmarkierten Antikörper. In vergleichenden Vorversuchen wurde die Stabilität und Spezies-Spezifität der sekundären Antikörper geprüft und optimiert, um Fehlbanden zu eliminieren. Von jeder Gewebeprobe wurde ein konsekutiv gewonnener Schnitt auf einem Objektträger prozessiert. Ein Gewebeschnitt diente als Negativkontrolle. Dieser Schnitt wurde identisch behandelt, jedoch der Inkubationsschritt mit dem Primärantikörper durch Inkubation mit PBS ersetzt. In jeder Färbeserie wurde als Positivkontrolle ein bekannt positives Präparat mitgeführt. 5.3.Qualitative und quantitative Analyseverfahren Qualitative und semiquantitative Expressionsbestimmung Durch die immunhistochemische Markierungder adressierten Transkriptionsfaktoren (MSX-1, SOX-9, Cbfa-1,BMP2/4) und des Markers der Osteoklastenaktivität (RANK(L))wurde die Auswirkung der Bisphosphonate auf das ossäreremodeling im Kieferknochen beschrieben. Im Hellfeldmikroskop (Axioskop, Zeiss, Jena, Deutschland) wurde bei 200-facher Vergrößerung Lokalisation und Verteilung des jeweilig dargestellten Proteins im exprimierendenosteoblasten,osteoklasten, Osteozyten im Knochen und am Übergang Knochen/ Bindegewebe beurteilt.die verwendeten Proben erfolgten nur aus der Kieferregion der Patienten. Kiefernekrose und gesunde Patienten wurden getrennt betrachtet und aufgelistet. Es wurden je 3 Gesichtsfelder bei 200-facher Vergrößerung je Gewebeschnitt, Probenlokalisation und Gruppe mit einer CCD- Kamera digitalisiert (Kappa, Gleichen, Germany). Grundlage ist ein randomisiertes, systematisches Subsampling (64). Dazu wurde das SoftwaresystemOptimas 6,5(Stemmer, Puchheim, Germany)verwendet. Die Zellzählung erfolgte je cm 2 unter Zuhilfenahme eines Gitternetzes.Es ergaben sich Median Zellzahlen von Zellen je Gesichtsfeld, Gesamtzellzahl ausgewerteter Zellen je Gewebeschnitt.Die Zellzahlbestimmung wurde jeweils dreifach durchgeführt.

22 Statistische Analyse Zur Beschreibung des quantitativen Ausmaßes der Expression im zeitlichen Verlauf wurde der Labeling Index je Gesichtsfeld, je Probe und Untersuchungsgruppe gesondert bestimmt. Weiterhin wurde im erkrankten und im gesunden Kieferknochen der Übergangsbereich zwischen Knochen, Bindegewebe und Zellen im Knochen gesondert bestimmt. Anschließend erfolgte der Vergleich der Faktoren für den Knochenaufbau (BMP2/4, Cbfa-1, SOX-9)mit den Faktoren für den Knochenabbau (MSX-1, RANK(L)).Grundlage ist ein randomisiertes, systematisches Subsampling (9). Die Daten aus mehreren Schnitten je Probe und Untersuchungsgruppe sowie aus gleichartigen Proben je Patient/ Zellkultur werden aggregiert. Zur Darstellung der quantitativen Daten wurdenohne Annahme einer Normalverteilung der Median, der Interquartilsbereich (IQR) sowie die 75- bzw. die 25-Perzentile verwendet. Die Überprüfung auf Unterschiede zwischen den Gruppen wurde mit dem nicht-parametrischen Kruskal-Wallis-Test und dem Mann-Whitney-U-Test durchgeführt. Zweiseitige p-werte 0,05 wurden als signifikant angesehen. Alle Berechnungen erfolgten mit dem Programm SPSS V.15 für Windows (SPSS Inc., Chicago, USA). Zur statischen Absicherung wurde der Anova- Test durchgeführt.

23 23 6. Ergebnisse 6.1.Qualitative immunhistologische Ergebnisse im Knochen Die Expression der Faktoren MSX-1 und RANK(L) waren im nekrotischen Knochen signifikant verringert. Eine Expression wurde auf den Proben aller untersuchten Gruppen gesehen. Die Spezifität der immunhistologischen Färbung der Faktoren MSX-1, RANK(L) und SOX-9 wurde durch die für jedes Präperat mitgeführte Negativkontrolle und die für jede Färbung mitgeführte Positivkontrolle belegt Qualitative Ergebnisse der MSX-1- Expression 100µ Abb.4. und Abb.5. Knochen mit Bisphosphonatnekrose und eingefügter Negativkontrolle. 200-fache Vergrösserung Die Msx1-Expression ist im Knochen mit bisphosphonat- assoziierter Nekrose signifikant eingeschränkt. Teilweise kam es zu einem Expressionsverlust. Die Expression zeigte sich im Zytoplasma. In Abb.4. sieht man insgesamt weniger Zellen im Vergleich zum gesunden Knochen. Die Struktur des Knochens ist deutlich ausgeprägter. An den Übergangsbereichen zwischen Knochen und Bindegwebe ist keine oder eine eingeschränkte Expression sichtbar.

24 24 100µ Abb. 6. und Abb.7. Gesunder Alveolarknochen mit eingefügter Negativkontrolle. 200-fache Vergrösserung Im gesunden Alveolarknochen in Abb.6. ist eine deutliche Expession von MSX-1 zu sehen. Eine Msx-1Expression ist am Randbereich des Knochens gut nachzuweisen. Im Bindegewebe ist eine eindeutige MSX-1 Expression sichtbar.die Zellanzahl ist sowohl im Knochen, sowie auch im Bindegewebe und am Übergangsbereich zwischen Knochen und Bindegewebe im Vergleich zum nekrotischen Knochen deutlich erhöht.

25 Qualitative Ergebnisse der RANKL- Expression Eine Expression von RANK(L) wurde auf den Proben aller untersuchten Versuchsgruppen gesehen. 100µ Abb. 8. und Abb.9. Bisphosphonatnekrose mit eingefügter Negativkontrolle. 200-fache Vergrösserung Die Expression von RANK(L) ist bei der Bisphosphonatnekrose in Abb.8.signifikant verringert. Die Anzahl RANK(L)-positiver Osteozyten ist gegenüber dem gesunden Knochen vermindert. Besonders auffällig ist eine geringere Anzahl an Zellen im Übergangsbereich. Im Randbereich des Knochens sind nur wenige Zellen gefärbt.die ausgeprägte Struktur des Knochens ist hier deutlich ausgeprägt.

26 26 100µ Abb.10. und Abb.11. Gesunder Knochen mit eingefügter Negativkontrolle. 200-fache Vergrösserung Im gesunden Alveolarknochenwie in Abb.10.sieht man eine deutliche Expression von RANK(L) sowie eine höhere Zellanzahl. Sowohl im Bindegewebe als auch im Übergangsbereich zwischen Knochen und Bindegewebeist die Expression gesteigert. Die Expression zeigte sich im Zytoplasma.

27 Qualitative Ergebnisse der Sox- 9- Expression Sox9 wird im Bisphosphonatknochen stärker exprimiert im Vergleich zum gesundenknochen. 100µ Abb.12. und Abb.13. Bisphosphonatknochen mit eingefügter Negativkontrolle. 200-fache Vergrösserung Die Expression von Sox-9 ist in Abb.12. deutlich sichtbar. Der Randbereich des Knochens und des Bindegewebes weisen eine starke Expression auf. Die geringe Zelldichte im Knochen, wie in Abb.12. dargestellt, ist auffällig. Die Expression von SOX-9 zeigte sich grundsätzlich im Kern.

28 28 100µ Abb.14. und Abb.15. Gesunder Alveolarknochen mit eingefügter Negativkontrolle. 200-fache Vergrösserung Im gesunden Knochenkam es ebenfalls zu einer Expression,jedoch ist die Expression deutlich schwächer ausgeprägt im Vergleich zum Bisphosphonatknochen.Wie in Abb. 14. dargestellt ist die Zellanzahl im Knochen höher als im Knochen mit bisphosphonat-assoziierter Nekrose.

29 Quantitative Ergebnisse Quantitative Expression von MSX-1 P = 0,026 P =0,026 Abb.16. Msx-1 Expression im Knochen und im Bindegewebe mit Bisphosphonatnekrose und im gesunden Gewebe Der Expressionsverlauf ist für MSX-1 im Knochen und im Bindegewebe in Abb.16. dargestellt. Im Alveolarknochenentsprach die Expression einem Labeling Index median von 35 (IQR 30-51). Der Knochen mit Bisposphonatnekrose hatte einen deutlichen Expressionsverlust. Der Labeling Index betrug hier median 14 (IQR 10-15). Das gesunde Bindegewebe hatte eine Expression median von 75 (IQR 55-86). Die Expression sank im Bindegewebe mit Bisphosphonaten median auf 19 (IQR 16-25). Der Expressionsgrad für MSX-1 im gesunden Gewebe unterschied sich signifikant von dem Gewebe mit Bisphosphonatnekrose (p=0,026).

30 Expression von RANKL P =0,028 P =0,028 Abb.17.RANKL- Expression im Vergleich zwischen gesundem und bisphosphonatnekrotischem Knochen und Bindegewebe Der Expressionsverlauf von RANKL ist in Abb.17. dargestellt. Die Expression war im gesunden Knochen bei einem medianen Wert bei 54 (IQR 53-73). Der Alveolarknochen mit Bisphosphonatnekrose wies einen LabelingIndex von 23 (IQR 14-28) auf. Das den Knochen umgebende gesundebindegewebe hatte einen Labeling Index von 60 (IQR 48-68). Eine Expressionsverminderung zeigte sich in denpräperaten mit Bisphosphonatnekrose. Hier sank die Expression auf einen LabelingIndex Wert von median 23 (IQR 18-30). Auch bei RANK(L) unterschied sich der Expressionsgrad signifikant zwischen dem gesunden Gewebe und Gewebe mit Bisphosphonatnekrose (p=0,028).

31 Expression von Sox-9 P =0,031 P =0,031 Abb.18. SOX-9 Expression im Vergleich zwischen Gesunden und bisphosphonatnekrotischen Knochen und Bindegewebe Der Expressionsverlauf ist in Abb.18. dargestellt. Im Gegenteil zu den vorhergehenden Faktoren war die Expression bei SOX-9 im Gewebe mit BONJ erhöht. Der gesunde Alveolarknochen hatte median einen Labeling Index von 18,5 (IQR 12-27). Der Knochen mit Bisphosphonatnekrose dagegen wies eine Expressionssteigerung auf. Der Labeling Index betrug hier 27 (IQR 20-33). Auch im Bindegewebe war die Expression gesteigert. In gesunden Präperaten betrug der Labeling Index median 38 (IQR 28-40). In Proben mit Bisphosphonatnekrose stieg die Expression auf einen Wert von 63 (IQR 51-69). Der Expressionsgrad unterschied sich signifikant zwischen dem gesunden Gewebe und Gewebe mit Bisphosphonatnekrose (p=0,031).

32 32 7.Diskussion 7.1.Diskussion Probenaufbereitung Bei Dissertationsbeginn lag das Probenmaterial der Gruppen zum Teil fixiert und paraffineingebettet vor.die Fixation auf para-formaldehydbasis wurde gewählt, da bei diesem Verfahren Proteine quervernetzt, nicht jedoch denaturiert werden. Antigene und Enzyme bleiben strukturell erhalten (12). In Abhängigkeit von Formaldehydkonzentration, Temperatur und Fixationszeit kommt es zur Proteinquervernetzung in unterschiedlichem Ausmaß, so dass eine Fixation bei geringstmöglicher para-formaldehydkonzentration und Fixationsdauer anzustreben ist. Es erwies sich das im Methodenteil beschriebene Vorgehen bei der Fixation als optimal. Da die Größe der Proben unterschiedlich war, galt eine Eindringgeschwindigkeit von ca.1mm/std. Sie ist abhängig von Konzentration, Temperatur und Gewebekonsistenz. Dabei nimmt die Geschwindigkeit mit der zurückgelegtenstrecke ab aufgrund der Wechselwirkung mit dem verfestigtem Gewebe(36). Durch die Quervernetzung kam es zu einem Verlust der Immunreaktivität, der sogenannten Maskierung. Mit einer hitzeinduzierten Antidemaskierung(Wasserbad) kam es zu einer Wiederherstellung der Immunreaktivität. Aufgrund der unbekannt uneinheitlichen Probenvorbehandlung kam esan einigen der Präperate zu Überfärbung des Hintergrundes. Das Herstellen der Paraffinschnitte und Aufziehen der Präparate auf Objektträger gestaltete sich problemlos Diskussion immunhistochemisches Verfahren Die ABC-Methode wurde zur Etablierung der Färbungen eingesetzt und dann auf die sensitivere LSAB-Methode umgestellt. Für den immunhistochemischen Nachweis wurde die LSAB- Methode(LabelledStrept-Avidin-Biotin-Methode) gewählt, da sie sich gegenüber anderen indirekten Methoden (PAP, APAAP) durch eine vier- bis achtfach höhere Sensitivität auszeichnet (27, 56). Der Vorteil gegenüber der ABC-Methode war, dass die Reaktionskomplexe bei der Avidin- Biotin-Anlagerung kleiner sind. Bekannt ist, dass bei den ABC-Komplexen-Methoden mitunter sehr große Moleküle entstehen, die zu sterischen Behinderungen führen können. Das positive Signal wird undeutlich (56). Bei der Wahl der Primärantikörper wurde auf die sogenannte Paraffingängigkeit geachtet, d. h. es sollte am entparaffinierten Gewebe nach enzymatischer Antigendemaskierung eine Epitopmarkierung bekannter Positivkontrollen erfolgen. Als Positivkontrolle wurden Proben mit gesundem Knochen je Färbung mitgeführt (8, 25, 26).

33 Diskussion Ergebnisse Es folgt die Diskussion der Expression von MSX-1,RANK(L), Cbfa-1, BMP2/4 und SOX-9. Die Faktoren Cbfa-1 und BMP2/4 wurden von Mitdoktorandin Michaela Fitz untersucht. Es wird der Zusammenhang der Faktoren miteinander dargestellt. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dassmsx-1 im Knochen mit einer bisphosphonat-assoziierten Nekrose eine signifikant verminderte Expression aufwies (p=0,026). MSX-1 stimuliert die Osteoblastenproliferation während der Skelettentwicklung und Frakturheilung (38).Es ist ein wichtiger Faktor für die Knocheninduktion und das Remodeling(67, 69). MSX-1 inhibiert im gesunden Knochen die terminale Osteoblastendifferenzierung (18). Durch die Wirkung der Bisphosphonate aufmsx-1 kommt es zu einem Expressionsrückgang, wodurch die Hemmung der Osteoblastendifferenzierung aufgehoben wird. Die Osteoblasten werden vermehrt gebildet und dies führt zu einer vermehrten Hyperkalzifizierung. Diese Erkenntnis zeigt sich röntgenologisch in sklerotischennicht heilenden Extraktionsalveolen und einer periapikalen Hypermineralisierung um die Zahnwurzel. MSX-1 ist ein entscheidender Faktor für die Cbfa-1 Expression (28)und damit für die Osteoblastenproliferation. Beim Cherubismus wurde eine postnatale,überschießende, pathologische Stimulation von MSX-1 im Alveolarknochen beschrieben. Es zeigten sich polyzystische, osteolytische Resorptionszonen und eineosteoklastenaktivierung, sowie eine verminderte Expression des Osteoblasten differenzierenden Transkriptionsfaktors Cbfa-1 und eine verminderte Kalzifizierung(31). Es kamzu einer Hyperproliferation, wabenartigen, zystischen und knöchernen Auftreibungen. Die Ergebnisse dieser Dissertation sind molekularbiologisch und immunhistochemisch vergleichbar mit einer Osteopetrose. Die Bisphosphonatnekrose wurde schon früher mit einer Osteopetrose verglichen(22, 45). Die Tatsache, daß die Bisphosphonatnekrose ausschließlich im Kieferknochen entsteht, könnte auf die Expressionsverminderung bzw. den Expressionsverlust von MSX-1 zurückzuführen sein.untersuchungen zeigten postnataleine persistierende Expression von MSX-1 im Kieferknochen jedoch nicht im Rumpf-, und Extremitätenskelett(59, 60). Es wurde dokumentiert, dass in 50-75% der bisphosphonat-assoziierten Nekrosen eine Zahnextraktion mit Verlust des periodontalen Ligaments vorausgeht (20). Untersuchungen ergaben im periodontalen Ligament die höchste endogene Konzentration von MSX-1 im Kieferknochen. Der MSX-1 Verlust bei Zahnextraktionen führt demnach zu einem Proliferationsstopp und einem Überwiegen der terminalen Differenzierung derosteoblasten. Dieser Pathomechanismus würde die klinische Beobachtung der Sklerosierung der Extraktionsalveole bestätigen. Allerdings wurde beobachtet, dass MSX-2 im periodontalen Ligament und im Alveolarknochen postnatal persistiert. MSX-1 und MSX-2 kommen aus der gleichen Homeobox (8).Daher