Vortrag von Philipp Nerke und Bruno Voigt

Transkript

1 Vortrag von Philipp Nerke und Bruno Voigt

2 Was war bekannt? Wirkung von Auxin Streckungswachstum Apicaldominanz Gravitropismus Laterales Wurzelwachstum Bekannte Gene der Auxin-Regulation AXR1 AXR4 AUX1 Protein, Ähnlichkeit mit Ubiquitin-activating enzyme (E1) Nicht weiter untersucht Membranprotein mit Ähnlichkeit zu Aminosäure-Permeasen SAR1 Epistatisch über AXR1, AXR4 ARF1 AUX/IAA AuxRE

3

4 Vorheriges Paper von Ruegger et al.: Screening nach Mutanten mit Resistenz gegenüber Auxin Transport Inhibitoren Auxin-transport inhibitors NPA (Naphthylphtalamic acid): CPD (2-Carboxyphenyl-3-phenylpropane-1,2-dione): Effekte: 1. eingeschränktes laterales Wurzelwachstum 2. gestörter Gravitropismus 3. Inhibierung Wurzelwachstum, Anschwellen der Wurzelspitze

5 TIR1 Mutantenscreen Screening Mutagenese EMS -NPA (Kontrolle) + NPA +NPA 16 TIR Mutanten gefunden Ziel: Identifizierung eines weiteren Gens im Auxin Pathway TRANSPORT INHIBITOR RESPONSE 1 (TIR1)

6 TIR1 Mutation Dominanz? Analyse der genetischen Basis für die Resistenz gegenüber CPD/NPA Beobachtung: 3 Phänotypen Vermutung: WT, heterozygot, homozygot tir1 (on 5 µm CPD) P tir1/tir1 x +/+ F 1 tir1/+ F 2 tir1/tir1 tir1/+ +/+ 1 : 2 : 1 Semidominanter Erbgang?

7 TIR1 Mutation Semidominanz Vergleich von Populationen homo- und heterozygoter TIR1 Mutanten Homozygote Mutanten weisen stärkste Resistenz auf Resistenzniveau heterozygoter Mutanten liegt zwischen dem homozygoter Mutanten und dem Wildtyp tir1-1 und tir1-3 ungefähr gleich stark, tir1-7 etwas schwächer Semidominanz

8 TIR1 Mutation Semidominanz Auxin Response oder Transport? Wichtigste Auswirkungen von CPD/NPA: Inhibierung Wurzelwachstum Anschwellen der Wurzelspitze Vermutete Ursache: Akkumulation von Auxin in dieser Region, durch Inhibierung des Auxin Transports weg von der Wurzelspitze Wirkung auf Auxin Transport oder Auxin Response?

9 TIR1 Mutation Semidominanz Auxin Response oder Transport? Einfluss der TIR1 Mutation auf die Auxin Response Wildtyp tir1-1 Mutante weist in Gegenwart von NPA stärkeres Wachstum als Wildtyp auf Mutanten sind resistenter gegenüber wachstumsinhibierenden Auxin- Konzentrationen Vermutung: TIR1 in Auxin Response involviert

10 TIR1 Mutation Semidominanz Auxin Response oder Transport? Auxin-transport assay Quelle: ( ) Modifiziert nach Nerke/Voigt

11 TIR1 Mutation Semidominanz Auxin Response oder Transport? Auxin-transport assay Wildtyp tir1-1 polarer Auxintransport ist in tir1-1 unverändert Auxin Response cpm = counts per minute

12 TIR1 Mutation Semidominanz Auxin Response Zellproliferation durch Auxin-transport Inhibitoren in tir1-1 Wildtyp Wurzeln zeigen erhöhte Proliferation tir1-1 Mutanten zeigen nur geringe Veränderung Auxin Response vermindert in tir1-1

13 TIR1 Mutation Semidominanz Auxin Response Auxinbehandlung induziert Bildung und Wachstum lateraler Wurzeln WT tir1-1 Auxin induziert Wurzelbildung in WT und tir1-1 Antwort von tir1-1 geringer Anzahl Lateralwurzeln steigt auch bei tir1-1 (entgegen der Erwartung) Behandlung von Wurzelsegmenten 5 Tage alter Keimlinge mit verschiedenen Konzentrationen IAA WT tir Tage alte Keimlinge auf 0,5 mm 2,4-D TIR1 Gen ist an Lateralwurzelbildung beteiligt Andere Vermutung: anderes Protein ist redundant mit Funktion von TIR1

14 TIR1 Mutation Semidominanz Auxin Response Temperaturabhängigkeit des Hypokotylwachstums Verlängerung des Hypokotyls bei erhöhter Temperatur primär durch Verlängerung der Epidermiszellen Hypokotyl bei tir1-1 nur unerheblich verlängert gleiche Beobachtung für iaalys-transgene Pflanzen (verminderte IAA-Konzentration) bei Gibberellinsynthese- und Ethylenantwort- Mutanten normale Reaktion Hypokotylwachstum bei erhöhter Temperatur auxinabhängig 9 Tage alte Keimlinge von WT und tir1-1: 4,5-fache Verlängerung bei WT 2,6-fache Verlängerung bei tir1-1 TIR1 in Hypokotylwachstum verwickelt

15 TIR1 Mutation Semidominanz Auxin Response Interaktion AXR1-TIR1? Interaktion zwischen AXR1 und TIR1 AXR1 benötigt für Auxin Response Generierung von homozygoten Pflanzen für axr1-12 und tir1-1, testen auf Auxin Response wt tir1-1 axr1-12 tir1-1 axr1-12 axr1-12 tir1-1 Keimlinge resistenter gegen 2,4-D als axr1-12 Keimlinge tir1-1 alleine bringt bei diesen Auxinkonzentrationen keine Resistenz hervor Effekt ist synergetisch

16 TIR1 Mutation Semidominanz Auxin Response Interaktion AXR1-TIR1 Interaktion zwischen AXR1 und TIR1 Morphologie der Doppelmutanten wt tir1-1 axr1-12 tir1-1 axr1-12 tir1-1 Rosette und Infloreszenz wie bei Wildtyp tir1-1: kleiner, etwas mehr sekundäre Infloreszenzen (Einfluss auf Apikaldominanz?) nach 12 Tagen auf 1µM 2,4-D axr1-12 und tir1-1 axr1-12: kleiner und eingeschränkte Apikaldominanz Funktion von TIR1 in aerial structures? 35 Tage nach Keimung TIR1 involviert in AXR1- vermittelten Prozessen?

17 TIR1 Mutation Semidominanz Auxin Response Interaktion AXR1-TIR1 Isolation TIR1 Isolation des TIR1 Gens Plasmid aus Agrobacterium tumefaciens, wird in Pflanzengenom inseriert und tumorartiges Wachstum aus Anwendung: T-DNA Abschnitt kann mit beliebiger DNA- Sequenz ausgetauscht werden, diese wird dann in pflanzliches Genom inseriert Herstellung einer Population T-DNA transformierter Pflanzen Griffiths, Introduction to Genetic Analysis, 10. Auflage, 2011

18 TIR1 Mutation Semidominanz Auxin Response Interaktion AXR1-TIR1 Isolation TIR1 Griffiths, Introduction to Genetic Analysis, 10. Auflage, 2011 Genetische Analyse: Single T-DNA Insert cosegregiert mit tir1-9 Mutante

19 TIR1 Mutation Semidominanz Auxin Response Interaktion AXR1-TIR1 Isolation TIR1 Plasmid Rescue Method 1. Plasmid in Genom inserieren 2. DNA isolieren und mit Restriktionsenzym verdauen 3. Fragment mit Ligase circularisieren Electroporation Methode zum Einbringen fremder DNA in eine Zelle. Durch Anlegen einen kurzen elektrischen Impulses wird die Membran durchlässig und die DNA kann in die Zelle diffundieren. 4. Neue Plasmide in E.coli übertragen (z.b. durch Electroporation) und auf Selektionsmedium wachsen lassen Quelle: ( )

20 Vorgehensweise DNA extrahieren SalI Restriktionsenzym Ligation mit T4 DNA ligase EcoRI Electroporation in JS4 E. coli Ausplattieren auf Selektionsmedium 4 colonies recovered (L1-L4) > 100 colonies recovered 5,5-kb Fragment von L3 = RFLP zwischen Wildtyp und tir1-9 Analyse Plasmid DNA (Ausschluss reiner T-DNA) L1-L4 R1-R14 Verwendung als Sonde in Southern Blot L3 und L4 gleiche restriction digest patterns

21 TIR1 Mutation Semidominanz Auxin Response Interaktion AXR1-TIR1 Isolation TIR1 Polymorphismus zwischen Wildtyp und tir1-9 T-DNA Insert liegt neben Gen Isolierung von cdna-klonen: Extrahieren von RNA; Reverse Transkriptase Screening mit 5,5-kb Fragment als Sonde cdna Library längste erhaltene cdna: 2,2 kb Sequenzierung: ORF (Open Reading Frame), kodiert für Protein mit 594 Aminosäuren Verifizierung: Vergleich mit zwei tir1 Allelen (tir1-1 und tir1-2) mittels RT-PCR (Reverser Transkriptase PCR) Außerdem: Sequenzanalyse von genomischem Klon Gen enthält 2 Introns, T-DNA Insert liegt in Intron 1

22 TIR1 Mutation Semidominanz Auxin Response Interaktion AXR1-TIR1 Isolation TIR1 Analyse TIR1 Die Aminosäuresequenz des kodierten Proteins TIR1 tir1-1: G147D tir1-2: G441D

23 TIR1 Mutation Semidominanz Auxin Response Interaktion AXR1-TIR1 Isolation TIR1 Analyse TIR1 Northern Blot Analyse In WT, tir1-2 und tir1-7, Transkript mit Länge ca. 2,2 kb In tir1-9 kein Transkript Kein Protein

24 TIR1 Mutation Semidominanz Auxin Response Interaktion AXR1-TIR1 Isolation TIR1 Analyse TIR1 Wiederherstellung des Wildtyps? TIR1 cdna wurde an CaMV 35S Promotor gekoppelt und in tir1-1 eingebracht In 4 von 5 Mutanten konnte der Wildtyp-Phänotyp wieder hergestellt werden! DNA stammt tatsächlich vom TIR1 Gen

25 TIR1 Mutation Semidominanz Auxin Response Interaktion AXR1-TIR1 Isolation TIR1 Analyse TIR1 TIR1 - Sequenzvergleich mit anderen Proteinen Analogien zu bekannten regulatorischen Proteinen aus Säugetieren und Hefe Gemeinsamkeit: F-box Binden an SKP1 SKP2, Cyclin F Cdc4, Grr1 UFO Mensch Hefe Arabidopsis bindet an SKP1-Orthologe ASK1 und ASK2

26 TIR1 Mutation Semidominanz Auxin Response Interaktion AXR1-TIR1 Isolation TIR1 Analyse TIR1 Sequenzvergleich mit anderen Proteinen TIR1 besitzt 16 leucinreiche repeats (LRR) Ähnlichkeit vielen weiteren Proteinen Allerdings große Unterschiede in Sequenz, Häufigkeit, Länge

27 TIR1 Mutation Semidominanz Auxin Response Interaktion AXR1-TIR1 Isolation TIR1 Analyse TIR1 Sequenzvergleich mit anderen Proteinen Homologien zwischen TIR1, C02F5.7, SKP2 und Grr1 C02F5.7, SKP2 und Grr1 binden an SKP1 SCF-Komplex (SKP1-Cdc53-F-box) als Ubiquitin-Proteinligase-Komplex vermutet Fungiert TIR1 im Ubiquitinpathway?

28 TIR1 Mutation Semidominanz Auxin Response Interaktion AXR1-TIR1 Isolation TIR1 Analyse TIR1 TIR1 - Sequenzvergleich mit anderen Genen Sequenzvergleiche liefern außerdem TIR1-ähnliche Gene in Arabidopsis LEUCINE-RICH REPEAT F-BOX (LRF) LRF1 und LRF2 als ESTs identifiziert (Expressed Sequence Tags) cdna-analyse ergab keine vollständige kodierende Sequenz bekannt: Transkripte von LRF1, LRF2 und TIR1 gleich groß Schätzung: 50 Nukleotide fehlen am 5 -Ende beider cdnas Übereinstimmung mit TIR1: LRF1 69 % LRF2 60 % LRF3 34 % ebenfalls große Ähnlichkeiten mit EST in Reis

29 Diskussion tir1 Defekte in auxinvermittelten Prozessen Hypokotylverlängerung Auxinhemmung bei Wurzelwachstum CPD-vermittelte Zellproliferation in der Wurzelspitze Lateralwurzelbildung Zellelongation (Hypokotylverlängerung) und Zellteilung (Zellproliferation in Wurzelspitze) betroffen Allgemeine Rolle in Auxinantwort TIR1 scheint in tir1-9 ganz zu fehlen TIR1 nicht essentiell für Auxinantwort Semidominanz der Mutation LRF redundant mit TIR1 Arabidopsis sensitiv für TIR1 Gendosis

30 F-Box-Proteine binden an SKP1 und bilden einen Ubiquitin-Protein-Ligase-Komplex (SCF) in Arabidopsis zwei SKP1- und ein CDC53-Homologe gefunden TIR1 könnte als Teil des Ubiquitin-Protein-Ligase-Komplexes in Ubiquitinpathway involviert sein E3 im Ubiquitinpathway zur Erinnerung: AXR1 könnte mit anderem Protein interagieren, das aktiven Cysteinrest enthält aktiviert als E1-Dimer Ubiquitin oder ubiquitinähnliches Protein AXR1 und TIR1 könnten als Teile der E1- bzw. E3-Komplexe bei der Ubiquitinierung von Proteinen fungieren

31 Modell AXR1 SCF-Komplex Hypothese TIR1 Auxin Response abhängig von ubiquitinvermitteltem Abbau von regulatorischen Proteinen Mögliches Zielprotein: Produkt von SAR1

32 Weitere Fragen Was ist die genaue Funktion der Ubiquitinierung? Welches ist das Zielprotein? Welche sind die weiteren Komponenten des Signalweges?