Gefährden Botox Bakterien niedersächsische

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1 Prof. Dr. Christoph Tebbe Thünen Institut für Biodiversität Gefährden Botox Bakterien niedersächsische Biogasanlagen? Thünen Institut für Biodiversität, Braunschweig Seite Hannover, 0 den Verbundprojekt Abundanz und Vielfalt von Clostridien in landwirtschaftlichen Biogasanlagen unter besonderer Berücksichtigung von Clostridium botulinum gefördert durch Niedersächsische Ministerium für Ernährung, Landwirtschaft, Verbraucherschutz und Landesentwicklung Partner: Thünen Institut für Biodiversität, Braunschweig, Dr. Anja Dohrmann, Prof. Dr. Christoph Tebbe HAWK Fakultät Ressourcenmanagement, Göttingen, Ing. Meike Waltz, Prof. Dr. Löwen Dr. Anja Dohrmann, M. Eng. Meike Walz Zeitraum: Verbesserte Nachweisgrenzen erhöhte Sicherheit! Seite 1 christoph.tebbe@ti.bund.de 1

2 Prof. Dr. Christoph Tebbe Thünen Institut für Biodiversität Warum Clostridien? anaerobe Bakterien bilden Sporen überall verbreitet häufig dominante Bakterien in Biogasanlagen zersetzen Proteine und Kohlenhydrate (Hydrolyse & Säurebildung) bilden Acetat als Gärungsprodukt Acetat: wichtige Vorstufe für Methanbildung einige Clostridien bilden Gifte, andere sind pathogen Seite 2 Vielfalt der Clostridien Sammelbegriff für viele Bakterien ca. 152 gültige Arten ca. 72 Arten fallen in das sog. Cluster I, d.h. Clostridium sensu stricto Cluster I beinhaltet die pathogenen Clostridien Seite 3 Alle Tierärztliche Clostridien Hochschule Hannover christoph.tebbe@ti.bund.de 2

3 Prof. Dr. Christoph Tebbe Thünen Institut für Biodiversität Cluster I Vielfalt der Clostridien Sammelbegriff für viele Bakterien ca. 152 gültige Arten ca. 72 Arten fallen in das sog. Cluster I, d.h. Clostridium sensu stricto Cluster I beinhaltet die pathogenen Clostridien Wie hoch ist ihr Anteil in Biogasanlagen? Seite 4 Alle Tierärztliche Clostridien Hochschule Hannover Clostridien Abundanz in einer Praxis Anlage Neue Erkenntnisse dank Metagenomik Direkt extrahierte DNA aus Biogas Reaktoren DNA direkt sequenziert (alle Gene) 24,7% 0,3% Bacteria Clostridia Cluster I DNA Sequenzen mit Bioinformatik identifiziert und nach Verwandtschaft geordnet 75,0% Ein Viertel aller Gene kamen von Clostridien, aber nur 0,3% aus Cluster I Jaenicke et al., 2011, PLoS One Seite 5 christoph.tebbe@ti.bund.de 3

4 Prof. Dr. Christoph Tebbe Thünen Institut für Biodiversität Clostridium botulinum verursacht Botulismus durch Neurotoxine kann als Sporenbildner fast überall vorkommen: In Böden, Sedimenten, Pflanzenresten, in Tierexkrementen, Rinder oder Schweinegülle Sporen sind inaktiv Auskeimung bei guten Bedingungen C. botulinum ist nicht eine Art, sondern ein Sammelbegriff für Neurotoxin bildende Arten im Cluster I Seite 6 Clostridium botulinum Cluster I Gruppe II Nicht proteolytisch Typ B, E und F BoNT Symptome (Einzelfälle) Clostridium butryricum Clostridum baratii Gruppe III Nicht proteolytisch Typ C und D Gruppe IV Typ G Gruppe I Proteolytisch Typ A, B und F Sieben BoNT Typen A, B, C, D, E, F, G Seite 7 christoph.tebbe@ti.bund.de 4

5 Prof. Dr. Christoph Tebbe Thünen Institut für Biodiversität Nachweis von Clostridium botulinum Nachweis über Mause Toxizitätstests, z.b. durch RIPAC Labor, Potsdam Für die umfangreiche Untersuchungen von Umweltproben ethisch nicht vertretbar Kulturelle Verfahren in Nährmedien technisch aufwendig und teuer: Anaeroben Kammer, Sicherheitslabor, etc. Alternative: Molekulare Verfahren kein Risiko, Hochdurchsatz, Identifizierung verdächtiger Proben Seite 8 Clostridium botulinum Einbindung molekularer Nachweisverfahren Extraktion von DNA aus Substraten und Gärresten dann PCR, d.h. Vervielfältigung von Genen PCR Analyse von Clostridium Cluster I 16S rrna Gene Cluster I vgl. m. XIVa Nachweis von Toxin Genen (A, E, B, F nicht C, D, G) Bei Verdacht auf C. botulinum: BoNT Nachweis im Mäuse Tests Seite 9 christoph.tebbe@ti.bund.de 5

6 Prof. Dr. Christoph Tebbe Thünen Institut für Biodiversität Projektaufbau Substrate Rinder und Schweinegülle, Hühner Trockenkot; k Mais Mi oder Ganzpflanzen Silage Fermentation 7 Batch Versuche, 3 Versuchen mit Quasi kontinuierliche Anlagen im Technikum 9 Praxis Anlagen in Niedersachsen Nachgärung bei 4 Praxis Anlagen Cluster I, Cluster XIVa, pathogene Clostridien 16S rrna Gene qpcr, DNA Sequenzierung BoNT Gene Was geht rein? Was ist drin? Was geht raus? Seite 10 Substrate Substrat Wdh. Anteil an den Gesamten Bakterien (16S rrna Gene, qpcr) Cluster XIVa Cluster I Rindergülle (RG) Schweinegülle (SG) Maissilage (MS) Ganzpfl.silage (GPS) Zuckerrüben Silage (ZR) 2 0,005 0,03 Hühnertrockenkot (HTK) 6 0,05 0,05 Clostridium Cluster XIVa und I sind überall weniger in ZR und HTK zwischen beiden Clustern gibt es keine quantitative Beziehung Seite 11 christoph.tebbe@ti.bund.de 6

7 Prof. Dr. Christoph Tebbe Thünen Institut für Biodiversität Batchversuche Wichtige Ergebnisse Fermentation unter standardisierten Bedingungen Gleiche Substrate unterschiedlicher Herkunft, verschiedene Mischungen nach EEG2012, Hühnertrockenkot Cluster I niemals mehr als 10% der Bakterien Batch Fermentationen bei der HAWK Göttingen Mit Zuckerrübe signifikant mehr Cluster I als beim Einsatz von Rindergülle Abundanz variiert in Abhängigkeit der Substrate Im Vergleich zu den Ausgangsmischungen keine Zunahme von Cluster I in der Fermentation Seite 12 Quasi Kontinuierliche Anlage wichtige Ergebnisse kontrollierte Variation der Prozessbedingungen 3 Parallelen Mischungen: MS+HTK, MS+ZR, RG+MS Überlastungstest Cluster I: Abundanz variiert nach Substraten MS+HTK mit Störung : Zunahme von Cluster I DNA Sequenzierungen in Vorbereitung MS+ZR: Abnahme von Cluster I MS+RG: Cluster I konstant bei ca. 20% Seite 13 christoph.tebbe@ti.bund.de 7

8 Prof. Dr. Christoph Tebbe Thünen Institut für Biodiversität Praxis Anlagen aus Niedersachsen Vorstellung der Anlagen (anonym), Substratvielfalt, Umfang der analysierten Proben Substrate Biogasanlage Nachwachsende Rohstoffe Exkremente Säuger Exkremente Geflügel Segment Anlage Maissilage Ganzpflanzenlilage Futterreste Zuckerrübe Rindergülle Rindermist Schweinegülle Sweinemist Rindergülle, Schweinegülle Schweinemist, Rindermist P P P P P P P P P Hühnertrockenkot Legehennenkot Hühnertrockenmist Fermenter Nachgärer Gärrestlager Seite 14 Auswirkung von Rindergülle? Praxis Anlagen P1 und P2 Baugleiche Anlagen mit zwei Fermentern in Reihe (A und B) Anlage 1: Pflanzen Silage (MS + WPS) plus Ringergülle (cattle manure; CM) Anlage 2: nur MS + WPS A B A B Clostridium Cluster XIVa und I immer dabei Cluster XIVa besonders hoch in Rindergülle Immer Abnahme von A zu B In B: Cluster I > 1 % der gesamten Bakterien Anlage 1 Anlage 2 Seite 15 christoph.tebbe@ti.bund.de 8

9 Prof. Dr. Christoph Tebbe Thünen Institut für Biodiversität Clostridien Vielfalt mit Bioinformatik Praxis Anlagen P1 und P2: Hochdurchsatz DNA Sequenzierung Spezifischer Nachweis für Clostridien (PCR) ca rrna Gene von Clostridium Cluster I sequenziert Diese teilen sich auf ca Arten (OTU) auf 300 Arten so dominant, dass sie > 98 % der gesamten Clostridien repräsentierten keine eng verwandt mit C. prefringens, C. tetani oder C.chauvoei aber einige OTU mit enger Verwandtschaft zu C. botulinum Seite 16 C. botulinum aus P1 und P2? insgesamt 174 Sequenzen entspricht 0,04 % aller Cluster I Sequenzen 150 in Maissilage (Gruppe III) 4 Sequenzen in Rindergülle (Gruppe II) 17 Sequenzen aus Fermentern (Gruppe I) 2 Sequenzen (MS, Ferm.) aus Gruppe IV 3 Proben mit C. botulinum Sequenzen zum BoNT Test (Ripac Labor) direkt und nach Anreicherung keine Toxizität kein C. botulinum! Seite 17 christoph.tebbe@ti.bund.de 9

10 Prof. Dr. Christoph Tebbe Thünen Institut für Biodiversität Clostridium botulinum (16S rrna Gene) In Praxisanlagen Analysen noch nicht abgeschlossen Seite 18 Direkter Nachweis von Botulinum Toxin Genen Praxisanlagen: hier BoNT A und E Immer negativ (< 0,3 Genkopien ng DNA) Substrate Biogasanlage Nachwachsende Rohstoffe Exkremente Säuger Exkremente Geflügel Segment Anlage Maissilage Ganzpflanzenlilage Futterreste Zuckerrübe Rindergülle Rindermist Schweinegülle Sweinemist Rindergülle, Schweinegülle Schweinemist, Rindermist Hühnertrockenkot Legehennenkot Hühnertrockenmist Fermenter Nachgärer Gärrestlager P P P P P P P P P Seite 19 christoph.tebbe@ti.bund.de 10

11 Prof. Dr. Christoph Tebbe Thünen Institut für Biodiversität Direkter Nachweis von Botulinum Toxin Genen Praxisanlagen: hier BoNT F Immer negativ (< 3 Genkopien ng DNA) Substrate Biogasanlage Nachwachsende Rohstoffe Exkremente Säuger Exkremente Geflügel Segment Anlage Maissilage Ganzpflanzenlilage Futterreste Zuckerrübe Rindergülle Rindermist Schweinegülle Sweinemist Rindergülle, Schweinegülle Schweinemist, Rindermist Hühnertrockenkot Legehennenkot Hühnertrockenmist Fermenter Nachgärer Gärrestlager P P P P P P P P P Seite 20 Zusammenfassung Clostridien aus Cluster I in allen Substraten und Biogas Anlagen Rindergülle hat keinen besonders hohen Beitrag zur Cluster I Abundanz Im Vergleich zu anderen Clostridien, hat Cluster I eher eine untergeordnete Rolle Mit molekularen Nachweisverfahren können Proben zum definitiven Nachweis von C. botulinum effektiv ausgewählt werden (und Mäuse geschont werden) Einige Proben im Projekt wiesen Sequenzen von C. botulinum auf im Mäusetoxizitätstest zeigten dies bisher analysierten Proben aber keine Symptome Das heißt: Bakterien mit identischen 16S rrna Genen von C. botulinum müssen nicht unbedingt pathogen sein, ihre Gene könnten fehlen oder inaktiv bleiben. Seite 21 christoph.tebbe@ti.bund.de 11

12 Prof. Dr. Christoph Tebbe Thünen Institut für Biodiversität Schlussfolgerungen Insgesamt weist kein Ergebnis des Projektes auf Risiken durch eine mögliche Anreicherung und damit Gefährdung von Biogas Anlagen oder deren Substrate und Gärungsprodukte durch C. botulinum Störungen des Biogasprozesses können die Abundanz von Cluster I erhöhen Ob damit auch eine Zunahme von C. botulinum verknüpft ist, wird zur Zeit untersucht Dank an Anja Dohrmann, Meike Walz, Astrid Näther, Karin Trescher, BrittaMüller und Jana Usarek sowie an das Niedersächsische Ministerium für Landwirtschaft für die finanzielle Unterstützung Seite 22 christoph.tebbe@ti.bund.de 12