Einführung in die Chromatographie

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1 Einführung in die Chromatographie Vorlesung WS 2007/2008 VAK AnC2-1 Johannes Ranke Einführung in die Chromatographie p.1/36

2 Programm Trennmethoden im Überblick und Geschichte der Chromatographie Thermodynamik der Stofftrennung Stofftransport und intermolekulare Wechselwirkungen Präparative Chromatographie und Dünnschichtchromatographie Kenngrößen für die Säulenchromatographie Gaschromatographie: Probenaufgabe und Trennsäulen Gaschromatographie: Detektoren und Quantifizierung Flüssigkeits-Chromatographie: Trennsäulen und Laufmittel Flüssigkeits-Chromatographie: Gradienten und Detektion Charakterisierung von Analyten in der Chromatographie Ionenchromatographie Gelpermeationschromatographie Trenntechniken für die Probenvorbereitung Beispiele aus Akademie und Praxis Einführung in die Chromatographie p.2/36

3 Literatur J. Silberring et al. Size-exclusion chromatography. In: Chromatography, 6th edition Journal of Chromatography Library, Vol 69A Elsevier, Amsterdam (2004). Polymer Laboratories Kursunterlagen Varian (2007). Viskothek Kursunterlagen Viskothek (2007). C. F. Poole The Essence of Chromatography Elsevier, Amsterdam (2003). Einführung in die Chromatographie p.3/36

4 Überblick Allgemeines und Theorie Einführung in die Chromatographie p.4/36

5 Überblick Allgemeines und Theorie Detektion und Kalibration Einführung in die Chromatographie p.4/36

6 Allgemeines zur Gel-Permeations-Chromatographie Einführung in die Chromatographie p.5/36

7 Definition Die Gel-Permeations-Chromatographie (GPC) oder auch Größenausschluss-Chromatographie (englisch Size Exclusion Chromatography, SEC) trennt gelöste Moleküle nach ihrem hydrodynamischen Volumen auf. Einführung in die Chromatographie p.6/36

8 Definition Die Gel-Permeations-Chromatographie (GPC) oder auch Größenausschluss-Chromatographie (englisch Size Exclusion Chromatography, SEC) trennt gelöste Moleküle nach ihrem hydrodynamischen Volumen auf. Wird mit einem wässrigen Laufmittel gearbeitet, so verwendet man auch häufig den Begriff Gelfiltrations-Chromatographie (GFC) Einführung in die Chromatographie p.6/36

9 Definition Die Gel-Permeations-Chromatographie (GPC) oder auch Größenausschluss-Chromatographie (englisch Size Exclusion Chromatography, SEC) trennt gelöste Moleküle nach ihrem hydrodynamischen Volumen auf. Wird mit einem wässrigen Laufmittel gearbeitet, so verwendet man auch häufig den Begriff Gelfiltrations-Chromatographie (GFC) Die stationäre Phase besteht im Allgemeinen aus einem hochvernetzten Polymer. Einführung in die Chromatographie p.6/36

10 Ziel Im Unterschied zu den meisten anderen chromatographischen Analysemethoden ist das Hauptziel der GPC zumeist die Charakterisierung der Größenverteilung in einer Mischung anhand der Größen Viskosität η Einführung in die Chromatographie p.7/36

11 Ziel Im Unterschied zu den meisten anderen chromatographischen Analysemethoden ist das Hauptziel der GPC zumeist die Charakterisierung der Größenverteilung in einer Mischung anhand der Größen Viskosität η RadiusR G,R H Einführung in die Chromatographie p.7/36

12 Ziel Im Unterschied zu den meisten anderen chromatographischen Analysemethoden ist das Hauptziel der GPC zumeist die Charakterisierung der Größenverteilung in einer Mischung anhand der Größen Viskosität η RadiusR G,R H Mittlere MolmasseM N,M W Einführung in die Chromatographie p.7/36

13 Ziel Im Unterschied zu den meisten anderen chromatographischen Analysemethoden ist das Hauptziel der GPC zumeist die Charakterisierung der Größenverteilung in einer Mischung anhand der Größen Viskosität η RadiusR G,R H Mittlere MolmasseM N,M W Aus den Verhältnissen dieser Größen wird auf Polydispersität und Konformation geschlossen. Einführung in die Chromatographie p.7/36

14 Anwendungsbereich Polymer Laboratories Einführung in die Chromatographie p.8/36

15 Typische Anwendungen Charakterisierung von Polymeren: Polysaccharide Einführung in die Chromatographie p.9/36

16 Typische Anwendungen Charakterisierung von Polymeren: Polysaccharide Proteine Einführung in die Chromatographie p.9/36

17 Typische Anwendungen Charakterisierung von Polymeren: Polysaccharide Proteine Kunststoffe (z.b. PE, PET) Einführung in die Chromatographie p.9/36

18 Typische Anwendungen Charakterisierung von Polymeren: Polysaccharide Proteine Kunststoffe (z.b. PE, PET) Weitere Anwendungen umfassen die Probenvorbereitung, Entsalzung und physikochemische Studien. Einführung in die Chromatographie p.9/36

19 Aufbau Polymer Laboratories Einführung in die Chromatographie p.10/36

20 Trennsäulen Hochvernetzte Polymerkügelchen, Partikelgrößen 5 bis 15µm Satz von Single Porosity Säulen oder Mixed Bed Säulen Alternativ: monolithische Trennsäulen Wikipedia Einführung in die Chromatographie p.11/36

21 Typische Mobile Phasen Wässrige Systeme, ev. mit Salz- oder Säurezusatz Einführung in die Chromatographie p.12/36

22 Typische Mobile Phasen Wässrige Systeme, ev. mit Salz- oder Säurezusatz Toluol (Polystyrol, Polybutadien, Polydimethylsiloxan) Einführung in die Chromatographie p.12/36

23 Typische Mobile Phasen Wässrige Systeme, ev. mit Salz- oder Säurezusatz Toluol (Polystyrol, Polybutadien, Polydimethylsiloxan) Tetrahydrofuran (Celluloseacetat, Polymethacrylat, PVC) Einführung in die Chromatographie p.12/36

24 Typische Mobile Phasen Wässrige Systeme, ev. mit Salz- oder Säurezusatz Toluol (Polystyrol, Polybutadien, Polydimethylsiloxan) Tetrahydrofuran (Celluloseacetat, Polymethacrylat, PVC) Um die Probe zu lösen, wird teilweise bei erhöhten Temperaturen gearbeitet. Einführung in die Chromatographie p.12/36

25 Geschichte der GPC 40er Trennungen per Größenausschluss mit Kohle und Zeoliten 1955 Größenausschlusschromatographie mit Lindqvist und Stärke Storgård 1958 Einführung dextranbasierter Säulen mit Flodin und Porath definierter Porengröße (Sephadex) 1961 Agar als Säulenmaterial Polson 1962 Einführung von vernetztem Polyacrylamid (Biogel P) Hjertén und Mosbach Einführung in die Chromatographie p.13/36

26 Mechanismus Ausschluss Polymer Laboratories Einführung in die Chromatographie p.14/36

27 Mechanismus Ausschluss Selektive Permeation Polymer Laboratories Einführung in die Chromatographie p.14/36

28 Mechanismus Ausschluss Selektive Permeation Volle Permeation Polymer Laboratories Einführung in die Chromatographie p.14/36

29 Weitere Mechanismen Ionenausschluss Dissertation Pascal Pfefferkorn 2004 Einführung in die Chromatographie p.15/36

30 Weitere Mechanismen Ionenausschluss Adsorption Dissertation Pascal Pfefferkorn 2004 Einführung in die Chromatographie p.15/36

31 Weitere Mechanismen Ionenausschluss Adsorption Größenausschluss Dissertation Pascal Pfefferkorn 2004 Einführung in die Chromatographie p.15/36

32 Weitere Mechanismen Ionenausschluss Adsorption Größenausschluss Abbau Dissertation Pascal Pfefferkorn 2004 Einführung in die Chromatographie p.15/36

33 Trennung Große Moleküle können nicht in die Poren eindringen, und eluieren zuerst. Kleinen Molekülen steht ein größerer Porenraum zur Verfügung, so dass sie später eluieren. Polymer Laboratories Einführung in die Chromatographie p.16/36

34 Detektion und Kalibration in der Gel-Permeations-Chromatographie Einführung in die Chromatographie p.17/36

35 Typische Detektoren Brechungsindex (RI) Einführung in die Chromatographie p.18/36

36 Typische Detektoren Brechungsindex (RI) UV Einführung in die Chromatographie p.18/36

37 Typische Detektoren Brechungsindex (RI) UV Viskosität Einführung in die Chromatographie p.18/36

38 Typische Detektoren Brechungsindex (RI) UV Viskosität Lichtstreuung Einführung in die Chromatographie p.18/36

39 Einfache Kalibration Konzentrationsabhängiger Detektor: RI UV Wikipedia Einführung in die Chromatographie p.19/36

40 Kalibration mit mehreren Standards Mirko Weinhold, UFT Bremen Einführung in die Chromatographie p.20/36

41 Einfache Kalibration Standards definierter Molekülgröße notwendig Sigma Aldrich Website Einführung in die Chromatographie p.21/36

42 Einfache Kalibration Standards definierter Molekülgröße notwendig Verfälschte Resultate für verzweigte Polymere Einführung in die Chromatographie p.21/36

43 Einfache Kalibration Standards definierter Molekülgröße notwendig Verfälschte Resultate für verzweigte Polymere Kostengünstige Apparatur Einführung in die Chromatographie p.21/36

44 Einfache Kalibration Standards definierter Molekülgröße notwendig Verfälschte Resultate für verzweigte Polymere Kostengünstige Apparatur Genaue Konzentration ist unkritisch Einführung in die Chromatographie p.21/36

45 Einfache Kalibration Standards definierter Molekülgröße notwendig Verfälschte Resultate für verzweigte Polymere Kostengünstige Apparatur Genaue Konzentration ist unkritisch Sehr gute Reproduzierbarkeit Einführung in die Chromatographie p.21/36

46 Das Chromatogramm als Histogramm Für jede Scheibeikann die Molekülgröße M i aus der Retentionszeit, und die Anzahl der Moleküle N i aus der Signalhöhe bestimmt werden. Polymer Laboratories Einführung in die Chromatographie p.22/36

47 Die mittlere Molmasse Zahlenmittel der Molmasse: M N = Ni M i Ni Einführung in die Chromatographie p.23/36

48 Die mittlere Molmasse Zahlenmittel der Molmasse: M N = Ni M i Ni Gewichtsmittel der Molmasse: M W = Ni M 2 i Ni M i Einführung in die Chromatographie p.23/36

49 Die mittlere Molmasse Zahlenmittel der Molmasse: M N = Ni M i Ni Gewichtsmittel der Molmasse: M W = Ni M 2 i Ni M i Polydispersitätd= M w M N Einführung in die Chromatographie p.23/36

50 Beispiele M W = M N = d=1 M W = M N =60000 d=3,33 Mirko Weinhold Einführung in die Chromatographie p.24/36

51 Molekülformen Dissertation Pascal Pfefferkorn Einführung in die Chromatographie p.25/36

52 Kalibrationskurven Kursunterlagen Viskothek Einführung in die Chromatographie p.26/36

53 Intrinsische Viskosität [η]= η sp c bei unendlicher Verdünnung. Die spezifische Viskositätη sp der Lösung von Makromolekülen oder Partikeln mit der Konzentration c ist η sp = η η 0 η wobeiη 0 die Viskosität des Lösungsmittels ist. Einführung in die Chromatographie p.27/36

54 Einsteins Viskositätsgesetz Nach Einstein (1905) gilt folgende Näherung für harte, sphärische Partikel η sp =2.5Φ Φ ist der Volumenanteil der Makromoleküle in der Lösung. Einführung in die Chromatographie p.28/36

55 Einsteins Viskositätsgesetz Nach Einstein (1905) gilt folgende Näherung für harte, sphärische Partikel η sp =2.5Φ Φ ist der Volumenanteil der Makromoleküle in der Lösung. Daraus folgt [η]= η sp c =2.5 ρ wennρdie Dichte der Partikel in Lösung ist. Einführung in die Chromatographie p.28/36

56 Flory-Fox Gleichung Für zufällig geknäuelte Polymere gilt M[η]=6 3/2 Φ 0 R G Φ 0 ist die Flory-Fox Konstante, undr G der Gyrationsradius des Makromoleküls. Einführung in die Chromatographie p.29/36

57 Flory-Fox Gleichung Für zufällig geknäuelte Polymere gilt M[η]=6 3/2 Φ 0 R G Φ 0 ist die Flory-Fox Konstante, undr G der Gyrationsradius des Makromoleküls. Hier kann die Dichte ρ eingesetzt werden: [η]=6 3/2 Φ 0 4π 3 3R 3 G 4πM =1.67 ρ Einführung in die Chromatographie p.29/36

58 Universelle Kalibration Kursunterlagen Viskothek Einführung in die Chromatographie p.30/36

59 Universelle Kalibration Bei bekannter Konzentration und Trennung streng nach Größenausschluss: Kalibration für das Molekulargewicht unabhängig vom chemischen Typ des Polymers Einführung in die Chromatographie p.31/36

60 Universelle Kalibration Bei bekannter Konzentration und Trennung streng nach Größenausschluss: Kalibration für das Molekulargewicht unabhängig vom chemischen Typ des Polymers und unabhängig vom Verzweigungsgrad Einführung in die Chromatographie p.31/36

61 Lichtstreudetektion Verdampfungslichtstreuung Einführung in die Chromatographie p.32/36

62 Lichtstreudetektion Verdampfungslichtstreuung Kleinwinkelstreuung Einführung in die Chromatographie p.32/36

63 Lichtstreudetektion Verdampfungslichtstreuung Kleinwinkelstreuung Streuung bei 90 Einführung in die Chromatographie p.32/36

64 Winkelabhängigkeit Kursunterlagen Viskothek Einführung in die Chromatographie p.33/36

65 Dreifachdetektion Kursunterlagen Viskothek Einführung in die Chromatographie p.34/36

66 Response-Verhalten RI-Detektor Viskometer Lichtstreuung A=K RI dn dc c A=K Visc [η]c ( ) 2 dn A=K LS M W c dc Einführung in die Chromatographie p.35/36

67 Response-Verhalten RI-Detektor Viskometer Lichtstreuung A=K RI dn dc c A=K Visc [η]c ( ) 2 dn A=K LS M W c dc Einführung in die Chromatographie p.35/36

68 Response-Verhalten RI-Detektor Viskometer Lichtstreuung A=K RI dn dc c A=K Visc [η]c ( ) 2 dn A=K LS M W c dc Einführung in die Chromatographie p.35/36

69 Dreifachdetektion Unter optimalen Bedingungen bekommt man Absolutes Molekulargewicht Einführung in die Chromatographie p.36/36

70 Dreifachdetektion Unter optimalen Bedingungen bekommt man Absolutes Molekulargewicht Verzweigungsgrad Einführung in die Chromatographie p.36/36

71 Dreifachdetektion Unter optimalen Bedingungen bekommt man Absolutes Molekulargewicht Verzweigungsgrad Polydispersität Einführung in die Chromatographie p.36/36

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