Charité-Universitätsmedizin Berlin Campus Benjamin Franklin Abteilung: Allgemeine Pathologie Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. med. H.
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- Claudia Dresdner
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1 Charité-Universitätsmedizin Berlin Abteilung: Allgemeine Pathologie Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. med. H. Stein Bedeutung somatischer Mutationen im nicht-kodierenden Bereich der umgelagerten Immunglobulingene in Hodgkin-Reed-Sternberg Zellen für die fehlende Immunglobulingenexpression beim klassischen Morbus Hodgkin Inaugural-Dissertation zur Erlangung der medizinischen Doktorwürde der Charité-Universitätsmedizin Berlin vorgelegt von: Jan Theil aus : Berlin
2 2 Referent: Korreferent: Prof. Dr. H. Stein Prof. Dr. K. Sperling Gedruckt mit Genehmigung der Charité-Universitätsmedizin Berlin Promoviert am:
3 3 INHALTSVERZEICHNIS 1. Einleitung Der Morbus Hodgkin Ursprung der malignen Tumorzellen des Morbus Hodgkin Histologie Immunhistologie Zellkulturen Polymerasekettenreaktion (PCR) Das Immunglobulingen (Ig Gen) Ergebnisse aus Gesamtzellextrakten Ergebnisse der Einzelzellisolierung Stadium der B-Zellentwicklung der Hodgkin-Reed-Sternberg Zellen Ursachen der fehlenden Ig Genexpression in HRS Zellen Verkrüppelnde Mutationen im kodierenden Bereich des Ig Gens Mutationen konservierter Strukturen des Ig Schwerkettenpromotors Fehlregulation der Ig Genexpression durch Transkriptionsfaktoren Fragestellung Materialien und Methoden Gewebematerial und Zelllinien Immunhistologie Einzelzellisolierung Polymerasekettenreaktion Ig Schwerkettenpromotor (IgH Promotor) PCR Eµ Enhancer PCR Sequenzanalysen Antigenselektion Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT PCR) Ig Gentranskripte Oct-1 RT PCR Oct-2 RT PCR 33
4 OCA-B RT PCR Semiquantitative RT PCR Ergebnisse Ig Gentranskripte in Hodgkinzelllinien Untersuchung des umgelagerten IgH Gens in Hodgkinzelllinien Etablierung einer PCR für den umgelagerten IgH Promotor Mutationsanalyse des IgH Promotors Mutationsanalyse des Leaderbereiches Mutationsanalyse des variablen Schwerketten- (VH) Bereiches Etablierung einer PCR und Mutationsanalyse am Eµ Enhancer Untersuchung des umgelagerten IgH Gens in einzelnen HRS Zellen Kriterien für die Auswahl der Fälle des klassischen Morbus Hodgkin Ergebnisse der Einzelzellisolierung Etablieren einer PCR für den umgelagerten IgH Promotor Mutationsanalyse des IgH Promotors Mutationsanalyse des Leaderbereiches Mutationsanalyse des VH-Bereiches Kontrollen Expression der Transkriptionsfaktoren Oct-1, Oct-2, sowie des 46 Ko-Faktors OCA-B in Hodgkinzelllinien Nachweis von Oct-1, Oct-2 und OCA-B m-rna Quantifizierung der Oct-1, Oct-2 und OCA-B m-rna Nachweis von Oct-1, Oct-2 und OCA-B Proteinen Diskussion Zusammenfassung Abkürzungen Quellennachweis 60 Danksagung 68 Lebenslauf 69 Eidesstattliche Erklärung 70
5 68 DANKSAGUNG Herrn Prof. Dr. med. H. Stein danke ich für die freundliche Überlassung des Themas, für die Anleitung und die konstruktiven Vorschläge sowie für die Möglichkeit den experimentellen Teil meiner Dissertation am Institut für Pathologie der Freien Universität durchzuführen. Frau Dr. med. T. Marafioti danke ich für die Betreuung meiner experimentellen Arbeit sowie für die Einführung in viele Aspekte der molekularen Pathologie und deren Techniken. Herrn PD Dr. rer. nat. M. Hummel danke ich für die Unterstützung bei allen technischen Problemen, für die anregenden Diskussionen und besonders für die Betreuung meiner schriftlichen Arbeit. Mein besonderer Dank gilt Alexandra Förster für die Bereitstellung und Aufarbeitung der Zelllinien sowie für ihre organisatorische Hilfe. Mein Dank gilt auch Diana Jahnke für die Sequenzierung der PCR Produkte, Erika Protz für das Schneiden und Färben der Präparate, sowie Gudrun Demel, Hedwig Lammert und Henning Müller für die Hilfe im molekularpathologischen Labor Des Weiteren möchte ich mich bei allen anderen Mitarbeitern des Instituts für Pathologie der FU Berlin für die freundliche Zusammenarbeit bedanken. Meiner Familie Kerstin, Robin und Jacob und meinen Eltern danke ich für ihre Unterstützung und Motivation. Fußnote: Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnten in der Zeitschrift Blood publiziert werden: Theil J., Laumen H., Marafioti T., Hummel M., Lenz G., Wirth T. and Stein H.; Defective Octamer-dependent transcription is responsible for silenced immunoglobulin transcription in Reed-Sternberg cells. Blood (2001) 97(10):
4. ERGEBNISSE. 4.2. Untersuchung des umgelagerten IgH Gens in Hodgkinzelllinien
36 4. ERGEBNISSE 4.1. Immunglobulin Gentranskripte in Hodgkinzelllinien Mit Hilfe der RT PCR untersuchten wir die Expression umgelagerter Ig Gene in den Hodgkinzelllinien L1236, L428, L591 und KM-H2 sowie
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Das Vorhandensein dieser Risikofaktoren ist jedoch keine notwendige Bedingung für die Entwicklung eines Morbus Hodgkin.
5 1. EINLEITUNG 1.1. Der Morbus Hodgkin Im Jahre 1832 beschrieb Thomas Hodgkin an sieben Fällen das makroskopische Bild einer zum Tode führenden Erkrankung, die mit der Vergrößerung von Lymphknoten und
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Elektrophysiologischer Nachweis langsam leitender Pyramidenbahnfasern
Medizinische Fakultät Charité Universitätsmedizin Berlin Campus Benjamin Franklin Aus der Klinik für Neurologie Direktor Prof. Dr. med M. Endres Abteilung klinische Neurophysiologie Abteilungsleiter Prof.
INAUGURAL-DISSERTATION. zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin an der Freien Universität Berlin
Aus dem Institut für Veterinär-Pathologie des Fachbereichs Veterinärmedizin der Freien Universität Berlin und dem Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Physikalische Kartierung und Genomische Struktur