Der Blastozystentransfer: Eine natürliche Fortentwicklung der In-vitro-Fertilisation?
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1 9/1/2000 Unser Thema Ihr Thema Dr. Michael Häberle Philipp Scheurer Prof. Michael K. Hohl Frauenklinik, Kantonsspital CH 5404 Baden Der Blastozystentransfer: Eine natürliche Fortentwicklung der In-vitro-Fertilisation? Genetische Grundlagen der Embryoselektion Zur Zeit der Geburt befinden sich im Ovar etwa 1 2 Millionen Oogonien, d.h. Oozyten in der Meiose 1. Sie sind umgeben von dunkelfärbenden Zellen, aus denen sich später die Granulosazellen entwickeln. Während der Jugend und bis zur Menarche kommt es zu einer Reifung vom ruhenden Primärfollikel zum wachsenden Primärfollikel. Der Follikel sinkt mit seiner Epithelzellschicht zur Mitte des Ovars, die begleitenden dunkelfärbenden Epithelzellen proliferieren und bilden so eine Granulosazellschicht. Der Mechanismus, welcher die Proliferation und Reifung fördert, ist völlig unklar. Dies legt die Annahme nahe, dass die Follikelreifung bis zu diesem Stadium autonom erfolgt. Während der Pubertät und zum Zeitpunkt der Menarche reifen die Primärfollikel nun zu Graaf-Follikeln heran. So werden für jeden ovulatorischen Zyklus etwa Primärfollikel bereitgestellt. Diese Reifung dauert einige Monate. Der Mechanismus ist hier ebenfalls völlig unklar. Im ovulatorischen Zyklus kommt es dann zum Wachstum der reifenden Follikel. Das Follikelwachstum verläuft relativ gleichmässig, die Granulosazellschicht nimmt an Dicke zu, wandert an die Oberfläche des Ovars und ragt ab einer Grösse von 1,5 bis 2 cm über die Ovaroberfläche hinaus. Dies geschieht nun unter dem Einfluss von follikelstimulierendem Hormon (FSH), welches wiederum die Reifung zahlreicher neuer Primärfollikel für die nächsten Zyklen einleitet. Nach der Ausschüttung von luteinisierendem Hormon erfolgt innert 40 h eine Ovulation. Innerhalb dieser 40 h kommt es zu einem recht komplizierten genetischen Teilungsprozess, nämlich der ersten Reifeteilung. Hier wird der Chromosomensatz von 46 auf 23 Chromosomen reduziert. Dieser Vorgang ist lichtmikroskopisch an der Eizelle durch den Zusammenbruch des Keimbläschens und die Ausstossung des ersten Polkörperchens erkennbar. Nach Ausstossung des ersten Polkörperchens ist die Eizelle in der Metaphase 2 und somit im befruchtungsfähigen Zustand (Abb. 1). Abb. 1. Oozyten in der Metaphase 2. Etwa 20% der Eizellen weisen Chromosomendefekte auf, welche meist durch die «non-disjunction» der Chromosomenpaare entstanden sind. Hierfür verantwortlich ist der Spindelapparat. Es handelt sich dabei um Mikrotubuli im Zytoplasma, welche die Chromosomenpaare voneinander trennen. Dieses Phänomen ist altersabhängig, bei über 40jährigen Frauen können die genetischen Defekte weit über 50% aller Eizellen betreffen [1] (Abb. 2). Abb. 2. Darstellung des Spindelapparats (gelb) und der Chromosomen (blau). Pfeil = aktiviertes Zytoplasma. Auf der anderen Seite sind Chromosomendefekte bei Spermien relativ selten. Sie betreffen lediglich 4,1 7,7% aller Spermien. Diese Zahl bleibt bis zum 50. Lebensjahr relativ konstant und steigt dann nur sehr mässig an [2]. Nach dem erfolgten Fertilisierungsvorgang zeigt sich in etwa 90% eine Zygote mit 2 Vorkernen. Gele-
2 Unser Thema Ihr Thema 9/1/2000 gentlich sehen wir trotz erfolgreicher Fertilisierung 16 h danach nur einen oder keinen Vorkern. Hat die Fertilisierung in vitro (IVF) stattgefunden, sind die Eizellen in 57 61% diploid (Abb. 4). Das bedeutet, dass wir den genauen Zeitpunkt des Auftretens der Vorkerne meistens verpasst haben, weil wir bei der IVF im Gegensatz zur intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) den genauen Zeitpunkt der Aktivierung (Eindringen des Spermiums) nicht kennen. Nach ICSI bedeutet hingegen der eine Vorkern eine stattgefundene Aktivierung der mütterlichen Gene alleine, die Zellen sind nur in 9,5% diploid [3, 4] (Abb. 3). Abb. 3. Zygote mit 1 Vorkern. Abb. 5. Zygote mit 3 Vorkernen. Embryonen sind aber etwas mehr als ein Drittel dann effektiv diploid, während sich nach IVF sehr häufig Mosaike finden (75,7%), während nur 13,4% diploid sind [6]. Im weiteren Verlauf nimmt die Aneuploidierate innerhalb der ersten 3 Tage deutlich zu. Am 3. Tag, d.h. im 6- bis 10-Zell-Stadium, sind im Durchschnitt 40% aller Embryonen aneuploid. Dieses Phänomen ist altersabhängig und beträgt bei über 39jährigen über 70%. Eine besonders hohe Aneuploidierate (über 80%) zeigen Embryonen, welche in ihrer Entwicklung stehengeblieben sind, und Embryonen mit sehr vielen Fragmenten (über 50%) weisen eine Aneuploidierate von 90% auf [7 9] (Abb. 6, 7). Abb. 4. Zygote mit 2 Vorkernen. Bei etwa 5% aller Zygoten beobachten wir mehr als 2 Vorkerne (Abb. 5). Hat die Fertilisierung mittels ICSI stattgefunden, handelt es sich dabei meist um einen nicht ausgestossenen weiblichen Chromosomensatz [5]. Von allen Abb. 6. Häufigkeit von Chromosomenanomalien und Reproduktion.
3 9/1/2000 Unser Thema Ihr Thema Abb. 7. Abhängigkeit der Aneuploidierate von Alter und Fragmentierung der Embryonen. G I und G II = 17 40% abnorm. G III = 90% abnorm. Über 39jährige = 24 28%, unter 39jährige = 39 48% normale Embryonen. Nach Munne et al. [7]. Abb. 8. Blastozysten unterschiedlicher Reife (Tage 5 und 6): Zellen. 9,1% aller Zellen aneuploid. 13,2% aller Blastozysten vorwiegend aneuploid. Nach Evsikov und Verlinsky [10]. Die hohe Aneuploidierate bei den Embryonen am 3. Zyklustag ist eine von mehreren möglichen Erklärungen für die relativ niedrige Implantationsrate von 10 bis 20% pro Embryo. Der genetische Aspekt spiegelt sicher nur einen Teil der geringen Implantationsrate wider, er stellt aber einen der wichtigsten Faktoren dar. Aus diesem Grund wäre es sinnvoll, nur Embryonen in den Uterus zurückzuführen, welche genetisch intakt sind und deshalb ein höheres Potenzial für eine Implantation aufweisen. Hierfür gibt es grundsätzlich zwei Möglichkeiten: Die erste ist eine Präimplantationsdiagnostik durch Entfernen von 1 oder 2 Zellen am Tag 3, Analyse derselben und Implantation nur der Embryonen, welche genetisch normal sind. Diese Methode hat den Nachteil, dass auch gesunde Embryonen biopsiert und damit potentiell gefährdet werden können. Die Präimplantationsdiagnostik wird übrigens durch das neue Fortpflanzungsmedizingesetz in der Schweiz verboten. Die zweite Möglichkeit ist die natürliche Selektion. Am Tag 5 bzw. 6 im Blastozystenstadium sind nur noch etwa 10% aller Blastozysten vorwiegend aneuploid. Fast 90% der Blastozysten sind vorwiegend euploid, Mosaike sind häufig, insgesamt sind aber nur 13,2% aller Zellen der Blastozysten genetisch abnorm [10] (Abb. 8). Interessanterweise kommt es nach dem 3. Tag zu einer starken natürlichen Selektion, indem nur noch 40 50% aller Embryonen sich zu Blastozysten entwickeln. Dies wird erklärt durch die Umstellung des Embryos vom mütterlichen Genom auf das embryonale Genom, welche nach dem 3. Tag vollzogen wird. Bei genetischen Defekten der Chromosomen in den Zellkernen kommt es nun durch die fehlerhafte Transkription auch zu vielfältigen Defekten im Stoffwechsel des Zytoplasmas. Vor dem 3.Tag waren die intakten mütterlichen Gene vorwiegend für den Stoffwechsel der einzelnen Zellen verantwortlich. Der Filter Natur kommt hier voll zur Wirkung und der überwiegende Teil aller Embryonen degeneriert.
4 Unser Thema Ihr Thema 9/1/2000 Mögliche Vorteile des Blastozystentransfers Der in den gängigen IVF-Programmen übliche Embryotransfer an den Tagen 2 oder 3 führt typischerweise zu einer tiefen Implantationsrate von lediglich 10 20% pro Embryo. Neben der schlechten Embryoselektion ist ausserdem der schlechte Transferzeitpunkt unphysiologisch (Nidationsbereitschaft des Endometriums) am Tag 2 oder 3, da im natürlichen Zyklus der Embryo erst am Tag 5 oder 6 in das Cavum uteri gelangt. Die bisherigen In-vitro-Kulturbedingungen waren für Embryonen bis zum Tag 2 oder 3 geeignet. Die Bedürfnisse ab diesem Zeitpunkt wurden erst in den 90er Jahren erforscht, und vor allem die Umstellung des embryonalen Energieträgers von Pyruvat auf Glukose nach dem 3. Zyklustag führte zur Einführung der sequenziellen Kulturmedien. Schlechte Embryoselektion Wie bereits erläutert, sind am Tag 2 bzw. 3 über 40% aller Embryonen genetisch defekt, während am Tag 5 nur noch 13% aller Blastozysten vorwiegend aneuploid sind. Die natürliche Embryoselektion führt durch eine weitergehende verlängerte Kultur bis zum Tag 5 oder 6 zu einer Eliminierung der genetisch defekten Embryonen und so zu einer besseren Implantationsrate. einer Untersuchung wurde ein Zusammenhang zwischen Uteruskontraktilität und Implantationsrate nachgewiesen [11]. Die höchsten Implantationsraten zeigten sich, wenn die Frequenz der Uteruskontraktionen weniger als 1/min betrug, und in einer früheren Arbeit über Uteruskontraktilität zeigte sich, dass die Kontraktilität periovulatorisch am grössten ist (>5 Kontraktionen/min), während sie ab Tag 5 auf 1 Kontraktion/min und weniger abnimmt. Wahrscheinlich ist dafür der Einfluss der Gestagene verantwortlich. Ein Embryotransfer am Tag 5 oder 6 führt somit nicht nur zu einem Transfer von natürlich selektionierten, genetisch gesünderen Embryonen, sondern dieser wird auch zu einem physiologischeren Zeitpunkt durchgeführt. Schlechte In-vitro-Kulturbedingungen Mit zunehmender Zellzahl des Embryos wird der Bedarf an Energieträgern immer differenzierter. Durch den Verlust der Pluripotenz der einzelnen Zellen wird der Energieverbrauch komplexer und der Embryo stellt seinen Energieverbrauch von Pyruvat in den ersten 2 3 Tagen auf den komplizierteren Zucker Glukose um. Diese Erkenntnis bildete die Grundlage für die Einführung der sequenziellen Kultur, bei welcher am Tag 3 das Kulturmedium gewechselt wird [12] (Tab. 1). Schlechter Transferzeitpunkt Physiologischerweise gelangen die Embryonen in vivo erst am Tag 5 oder 6 in das Cavum uteri. Zu diesem Zeitpunkt steht der Embryo kurz vor dem Schlüpfen und das Endometrium ist optimal auf eine Einnistung vorbereitet. Zur ungenügenden Embryoselektion und Nidationsbereitschaft des Endometriums tritt mindestens noch ein weiterer Faktor: In Tab. 1. Blastozystenkultur mit sequenziellen Kulturmedien Tag 1 3 Tag 4 6 Aminosäuren Pyruvat EDTA HSA Aminosäuren Glukose HSA
5 9/1/2000 Unser Thema Ihr Thema Die sequenzielle Kultur war die Voraussetzung dafür, dass 50% aller Embryonen unter In-vitro-Bedingungen in das Blastozystenstadium gelangen. Früher war dies durch Kokultur mit tierischen oder menschlichen Zellen möglich. Eigene Erfahrungen mit dem Blastozystentransfer Da sich zwar knapp die Hälfte aller Embryonen zu Blastozysten entwickeln, aber nur 30% zu morphologisch «guten» Blastozysten, führten wir anfangs eine Blastozystenkultur nur bei Paaren durch, welche nach erfolgreicher Fertilisierung oder nach erfolgreichem Auftauen kryokonservierter Zygoten 7 und mehr Zygoten zur Verfügung hatten. Bei einer durchschnittlichen Entwicklungsrate von 30% morphologisch einwandfreien Blastozysten rechneten wir bei 7 Zygoten mit 2 transferierbaren Blastozysten. Unter diesen strengen Kriterien führten wir in den ersten Monaten bei 65 Zyklen eine Blastozystenkultur durch. Bei 61 Paaren kam es zu einem Transfer, wir erzielten 31 klinische Schwangerschaften, entsprechend einer Schwangerschaftsrate von 47,7% pro Zyklus und 51,7% pro Transfer. Im Mittel transferierten wir 1,85 Blastozysten, und unsere Implantationsrate betrug 33,3%. Im weiteren Verlauf zeigten sich 23 intakte klinische Schwangerschaften, wovon 18 eine Fruchtblase aufwiesen, während bei 9 Paaren zwei Fruchtblasen auftraten (Tab. 2). Aufgrund unserer ersten Erfahrungen erweiterten wir unsere Indikation. Auf Wunsch führten wir auch bei weniger als 7 vorhandenen Zygoten eine Blastozystenkultur durch. Innerhalb des ersten Jahres führten wir in 164 Zyklen eine solche durch. In 150 Fällen kam es zu einem Transfer (91,5%), in 130 transferierten wir 2 Blastozysten, in 20 Fällen 1 Blastozyste. Insgesamt erzielten wir 63 Schwangerschaften, entsprechend einer Rate von 42,0% pro Transfer (Tab. 3). Tab. 2. Blastozystenkultur: Eigene Ergebnisse von September 1998 bis Januar 1999 Anzahl Zyklen 65 Transfer von 1 Blastozyste 9 Transfer von 2 Blastozysten 51 Kein Transfer 5 (7,7%) Transfer am Tag 5 58 Transfer am Tag 6 2 Anzahl Schwangerschaften 31 Pro Zyklus, % 47,7 Pro Transfer, % 51,7 Tab. 3. Blastozystenkultur: Eigene Ergebnisse von September 1998 bis August 1999 Anzahl Zyklen 164 Anzahl Transfers 150 (91,5%) Transfer von 1 Blastozyste 20 Transfer von 2 Blastozysten 130 Transfer am Tag Transfer am Tag 6 21 Anzahl Schwangerschaften 63 Pro Transfer, % 42,0 Verschiedene Prognosekriterien für den Erfolg der Blastozystenkultur haben sich mittlerweile herausgestellt. Wichtig ist die Anzahl der vorhandenen Zygoten bzw. Embryonen. Bei Zyklen mit weniger als 7 Zygoten kam es nach unserer Erfahrung bei 87% zu einem Transfer (20 von 23), aber nur zu 5 Schwangerschaften, was einer Rate von 25% pro Transfer entspricht. Joon et al. [13] untersuchten den Transferzeitpunkt und fanden keine Unterschiede in den Schwangerschaftsraten, wenn der Transfer am Tag 5 oder 6 durchgeführt wurde. Schoolcraft et al. [14]
6 Unser Thema Ihr Thema 9/1/2000 wiesen aber in einer retrospektiven Studie nach, dass das Stimulierungsschema eventuell einen Einfluss auf die Schwangerschaftsrate haben könnte. Bei einer Stimulierung mit HMG-Präparaten kam es zu einer Schwangerschaftsrate von 73% gegenüber 55% bei einer Stimulierung mit rekombinantem oder urinärem FSH (p <0,005). Auch die Implantationsraten differierten signifikant zwischen 60% mit HMG und 40% mit rekombinantem oder urinärem FSH [14]. Eines der wichtigsten Prognosekriterien ist die Qualität der Blastozysten. Wird mindestens 1 Blastozyste vom Grad IV A transferiert, beträgt die Schwangerschaftsrate 85%, bei Blastozysten der Grade I III B oder C beträgt sie nur noch 41% [14]. Diese Ergebnisse wurden in einer prospektiv randomisierten Studie von Gardner et al. [12] bestätigt, wobei ein Transfer vom Tag 3 mit Tag 5 verglichen wurde. Trotz der Reduktion der zu transferierenden Embryonen von 3,7 auf 2,2 (p <0,01) konnte die klinische Schwangerschaftsrate konstant gut bei 71 bzw. 66% pro Transfer gehalten werden. Die Implantationsrate verbesserte sich signifikant von 30,1 auf 55,5% (p <0,01) [12]. Kernaussagen Zusammengefasst bringt der Transfer im siehe Kernaussagen Blastozystenstadium eine Verbesserung der Ergebnisse durch eine bessere natürliche Selektion, verbesserte Kulturbedingungen und einen physiologischeren Transferzeitpunkt. Durch die Blastozystenkultur kann die Aneuploidierate der transferierten Embryonen von etwa 40 auf 13% gesenkt werden. Die natürliche Selektion der genetisch gesunden Embryonen führt zu einer verbesserten Implantationsrate von bis zu 50% pro Blastozyste. Literatur 1 Plachot M, de Grouchy J, et al: Chromosome analysis of human oocytes and embryos: Does delayed fertilization increase chromosome imbalance? Hum Reprod 1988; 3: Pfeffer J, Pang MG, Hoegerman SF, et al: Aneuploidy frequencies in semen fractions from ten oligoasthenoteratozoospermic patients donating sperm for intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril 1999;72: Staessen C, Janssenswillen C, et al: Cytogenetic and morphological observations of single pronucleated human oocytes after in-vitro fertilization. Hum Reprod 1993;8: Sultan KM, Munne S, et al: Chromosomal status of unipronuclear human zygotes following in-vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 1995;10: Grossmann M, Calafell JM, et al: Origin of tripronucleate zygotes after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 1997;12: Kola I, Trounson A, et al: Tripronuclear human oocytes: Altered cleavage patterns and subsequent karyotypic analysis of embryos. Biol Reprod 1987;37: Munne S, Marquez C, et al: Chromosome abnormalities in embryos obtained after conventional in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril 1998;69: Plachot M, Mandelbaum J, et al: Cytogenetic analysis and developmental capacity of normal and abnormal embryos after IVF. Hum Reprod 1989;4: Zenzes MT, Casper RF: Cytogenetics of human oocytes, zygotes and embryos after in vitro fertilization. Hum Genet 1992;88: Evsikov S, Verlinsky Y: Mosaicism in the inner cell mass of human blastocysts. Hum Reprod 1998;13: Fanchin R, Righini C, Olivennes F, et al: Uterine contractions at the time of embryo transfer alter pregnancy rates after in-vitro fertilization. Hum Reprod 1998;13: Gardner DK, Schoolcraft WB, Wagley C, et al: A prospective randomized trial of blastocyst culture and transfer in in vitro fertilization. Hum Reprod 1998;13: Joon HG, Joon SH, Lee SW, et al: How viable is a 6-day-old blastocyst. ASRM, Sept 1999, Toronto. 14 Schoolcraft WB, Gardner DK, Lane M, Schlenker T, et al: Blastocyst culture and transfer: Analysis of results and parameters affecting outcome in two in vitro fertilization programs. Fertil Steril 1999;72:
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