Phosphorylierung von Vinkulin und Kraftübertragung in zellulären fokalen Adhäsionen

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1 Phosphorylierung von Vinkulin und Kraftübertragung in zellulären fokalen Adhäsionen Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Vera Bettina Hermine Flad (geb. Auernheimer) aus Nürnberg

2 Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: Vorsitzender des Promotionsorgans: Erstgutachter: Zweitgutachter: Drittgutachter: Prof. Dr. Jörn Wilms Prof. Dr. Wolfgang Goldmann Prof. Dr. Christoph Naumann Prof. Dr. Ernst-Ludwig Florin

3 Learn from yesterday, live for today, hope for tomorrow. The important thing is to not stop questioning. Albert Einstein

4 INHALTSVERZEICHNIS Inhaltsverzeichnis 1 Abstract Zusammenfassung Einleitung Zelladhäsionen Das Zytoskelett Integrine als Adhäsionsrezeptoren der Zell-Matrix Adhäsion Der Integrin-assoziierte fokale Proteinkomplex Phosphorylierung Dynamik und Kraftgeneration fokaler Adhäsionen Das fokale Adhäsionsprotein Vinkulin Proteinstruktur Bindungspartner Funktionen Aktivierung Zielsetzung Material und Methoden Zellkultur und genetisches Material Zellkultur Agarose-Gelelektrophorese SDS-Gelelektrophorese Western Blot Vinkulin cdna und Mutagenese Transiente Transfektion Immunfluoreszenz In vitro Proteinbindung Expression rekombinanter Proteine in Bakterien Aktinbindungsstudie Biophysikalische Methoden Kollagengele D Traktionsmikroskopie iv

5 INHALTSVERZEICHNIS Magnetic Tweezer Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) Ergebnisse und Diskussion Einfluss der Konformation und Tyrosin-Phosphorylierung auf die Funktion von Vinkulin Konformations- und Tyrosin-Mutanten von Vinkulin Kontraktile Kräfte Zellsteifigkeit und Bindungsstärke der fokalen Adhäsionen Austauschdynamik von Vinkulin im fokalen Adhäsionskomplex Aktinbindungskapazität der Tyrosin-Mutanten Einfluss der Serin-Phosphorylierung auf die Funktion von Vinkulin Kontraktile Kräfte Zellsteifigkeit und Bindungsstärke der fokalen Adhäsionen Austauschdynamik von Vinkulin im fokalen Adhäsionskomplex Interaktion von Vinkulin mit p130cas Kontraktile Kräfte Zellsteifigkeit und Bindungsstärke der fokalen Adhäsionen Vinkulin und die fokale Adhäsionskinase Durotaxis, ein Mechanismus bei der Entstehung von Fibrose? Test eines FAK Inhibitors in der Zellkultur Fibrose im Mausmodell und in Patienten Schlussfolgerung und Ausblick Literaturverzeichnis Anhang DNA-Plasmide Murine Vinkulinsequenz Verbrauchsmittel Abkürzungsverzeichnis Danksagung Publikationsliste v

6 ABSTRACT 1 Abstract Adherent cells are anchored via focal adhesions to the extracellular matrix, which is essential for force transduction, cell spreading, and migration. Focal adhesions consist of clusters of transmembrane adhesion proteins of the integrin family and numerous intracellular proteins including talin, focal adhesion kinase, and p130cas. Talin links integrins to actin filaments, a bond which is further stabilized by vinculin. Vinculin is therefore a key player in focal adhesions that builds up a strong physical connection for transmitting forces between the cytoskeleton and the extracellular matrix. The protein consists of a globular head and a tail domain, which undergo conformational changes from a closed, autoinhibited conformation in the cytoplasm to an open, active conformation in focal adhesions. Phosphorylation has been suggested, among other mechanisms, to regulate this conformational switch. In this work, the role of phosphorylation in vinculin activation is explored, measuring the vinculin-actin binding affinity, vinculin exchange dynamics in focal adhesions, cytoskeletal stiffness, and traction as well as adhesive forces in knock-out mouse embryonic fibroblasts reexpressing different vinculin mutants. Compared to cells expressing wildtype or constitutively active vinculin, cytoskeletal stiffness, traction and adhesion forces, and the residence time of vinculin in focal adhesions were reduced in cells expressing constitutively inactive vinculin. Cells expressing vinculin in the open conformation, but devoid of actin binding, and cells expressing vinculin, where phosphorylation was blocked by replacing tyrosine on position 100 and/or 1065, and serine on position 1033, respectively, with non-phosphorylatable phenylalanine or alanine also showed reduced mechanical features. Thus, replacing tyrosines with phospho-mimicking glutamic acid and serine with aspartic acid, respectively, restored cell stiffness, traction and adhesive forces, and vinculin exchange dynamics in focal adhesions to wildtype level. Moreover, phospho-mimicking vinculin mutant Y100/1065E showed enhanced affinity for talin binding and thereby enhanced actin co-sedimentation compared to nonphosphorylated vinculin. In addition, the interaction of vinculin with other focal adhesion proteins was tested. The binding of vinculin and p130cas was also important for the maintenance of cellular mechanics. Further more, focal adhesion kinase contributed to the stiffening of tissues in fibrotic diseases by changing the cellular mechanics of fibroblasts in mouse models and patients. 1

7 ABSTRACT Taken together, these data demonstrate that phosphorylation regulates the function and activity of many different focal adhesion proteins and reveal that phosphorylation by Srckinase and PKC is also a prerequisite for vinculin activation. Accordingly, phosphorylation controls cytoskeletal mechanics through regulating force transmission between the actin cytoskeleton, focal adhesion proteins, and the extracellular matrix. 2

8 ZUSAMMENFASSUNG 2 Zusammenfassung Adhärente Zellen stehen über fokale Adhäsionen mit der extrazellulären Matrix in Kontakt, wodurch viele zelluläre Prozesse, wie die Kraftübertragung, Ausbreitung und Migration gesteuert werden. Fokale Adhäsionen formieren sich durch Ansammlung transmembraner Adhäsionsrezeptoren der Integrinfamilie und deren Verbindung mit zahlreichen intrazellulären Proteinen, wie z. B. Talin, FAK und p130cas. Talin verknüpft dabei die Integrine mit dem Aktinzytoskelett der Zelle. Vinkulin stabilisiert diese Bindung von Talin an Aktin und spielt somit eine wichtige Rolle bei der Kraftübertragung zwischen dem Zytoskelett und der extrazellulären Matrix. Vinkulin liegt im Zytoplasma durch intramolekulare Bindung der globulären Kopf- an die Schwanzdomäne in einer autoinhibierten, inaktiven Konformation vor und wird erst in den fokalen Adhäsionen aktiviert. Ein möglicher Mechanismus für die konformationelle Aktivierung des Proteins ist Phosphorylierung. In dieser Arbeit wird die Funktion der Phosphorylierung näher untersucht. Dafür wurden die Aktinbindungsaffinität und die Austauschdynamik von Vinkulin in den fokalen Adhäsionen, sowie die Zellsteifigkeit, Traktions- und Adhäsionskräfte der embryonalen Mausfibroblasten nach der Transfektion mit verschiedenen Vinkulin Mutanten gemessen. Die Expression von konstitutiv inaktivem Vinkulin reduzierte die Steifigkeit, Traktions- und Adhäsionskräfte, sowie die Verweildauer des Proteins im fokalen Kontakt, verglichen mit konstitutiv aktiven oder Wildtyp Proteinen. Sowohl eine aktive, jedoch aktinbindungsdefiziente Mutante, als auch die nicht phosphorylierbaren Mutanten, in denen die Tyrosine zu Phenylalanin, bzw. Serin zu Alanin, mutiert worden waren, beeinträchtigten die mechanischen Zelleigenschaften. Die Mutation der Tyrosine zu Glutaminsäure, bzw. Serin zu Aspartat, simulierte eine dauerhafte Phosphorylierung und stellte dadurch die vollen mechanischen Eigenschaften der Zellen wieder her. Darüber hinaus zeigte die Doppelmutante Y100/1065E sogar erhöhte Bindungsaffinität zu Talin und damit einhergehend verstärkte Co-Sedimentation mit Aktinfilamenten. Zusätzlich wurde die Interaktion von Vinkulin mit weiteren fokalen Adhäsionsproteinen untersucht. Die Bindung von Vinkulin an p130cas stellte sich als ebenfalls wichtig für den Erhalt der mechanischen Zelleigenschaften heraus. Des Weiteren wurde beobachtet, dass die fokale Adhäsionskinase zur Versteifung des Gewebes in fibrotischen Krankheitsbildern beiträgt, indem sie die mechanischen Eigenschaften der Fibroblasten aus dem Mausmodell und aus Patienten veränderte. 3

9 ZUSAMMENFASSUNG Diese Ergebnisse zeigen, dass die Phosphorylierung die Funktion und die Aktivität verschiedenster fokaler Adhäsionsproteine reguliert, und dass die Phosphorylierung durch die Kinasen Src und PKC tatsächlich auch eine Voraussetzung für die Aktivierung von Vinkulin darstellt. Folglich steuert die Phosphorylierung die Kraftübertragung des Aktinzytoskeletts über fokale Adhäsionsproteine auf die extrazelluläre Matrix. 4

10 EINLEITUNG 3 Einleitung Für die Entstehung und Funktion mehrzelliger Organismen bis hin zu komplexen Systemen, wie unserem menschlichen Körper, ist eine strukturierte Organisation und Vernetzung auf Ebene der Einzelzellen notwendig. Die Koordination von Zellen und Zellverbänden erfordert den Austausch verschiedenster Signale, die beispielsweise in Form von Hormonen, Chemokinen oder Wachstumsfaktoren an die Zellen übermittelt und über die entsprechenden zellulären Strukturen, wie z. B. Ionenkanäle oder Rezeptoren, aufgenommen und verarbeitet werden. Aber auch mechanisch müssen Zellen über sogenannte Zelladhäsionen miteinander und mit der umgebenden extrazellulären Matrix in Kontakt stehen, um eine funktionelle Einheit bilden zu können. Die unterschiedlichen Mechanismen der Zelladhäsion werden für den Aufbau, die Erhaltung und die Regulation der dreidimensionalen Gewebestrukturen benötigt und spielen eine zentrale Rolle bei der Steuerung von zellulären Prozessen wie der Proliferation, Differenzierung oder der Migration (Ruoslahti and Obrink, 1996). Folglich beeinflusst die Zelladhäsion auch viele physiologische sowie pathologische Prozesse, wie beispielsweise die Morphogenese, Wundheilung oder die Tumorentstehung und Metastasierung. Für den korrekten Ablauf der morphogenetischen Vorgänge ist sowohl die räumliche, als auch die zeitliche Expression der verschiedenen Adhäsionsmoleküle entscheidend. Die Adhäsionsmoleküle wirken dabei nicht nur als mechanische Kontaktelemente, sondern sind auch maßgeblich an der Signaltransduktion beteiligt. Zelladhäsionen sind Multiproteinkomplexe bestehend aus drei Hauptkomponenten: die Proteine der extrazellulären Matrix, die Adhäsionsrezeptoren und die intrazellulären Adhäsionsproteine (Aplin et al., 1998). Die extrazelluläre Matrix (Basallamina und Bindegewebe) setzt sich aus lokal unterschiedlichen, spezifisch sezernierten Proteinen zusammen, die den Zusammenhalt der Zellen im Gewebe gewährleisten und deren Funktionen regulieren. Zu den Hauptbestandteilen zählen Proteoglykane, Kollagene und adhäsive Proteine, wie z. B. Laminin und Fibronektin. Bestandteile dieses Netzwerks aus extrazellulären Proteinen werden von Rezeptoren auf der Zelloberfläche erkannt und Signale können auf diesem Weg über die Membran und spezialisierte Adhäsionsproteine an die Zelle übermittelt werden. 5

11 EINLEITUNG 3.1 Zelladhäsionen Die mechanische Interaktion von Zellen mit anderen Zellen oder der extrazellulären Matrix verleiht dem Gewebe Stabilität und versetzt Zellen in die Lage physikalische Kräfte wahrzunehmen bzw. auf ihre Umgebung auszuwirken. Zelladhäsionsrezeptoren sind häufig transmembrane Glykoproteine, welche extrazellulär an Rezeptoren benachbarter Zellen (in Zell-Zell-Kontakten) bzw. an Matrixproteine (in fokalen Adhäsionen) binden und sie intrazellulär mit Strukturen des Zytoskeletts verknüpfen. Die über Mechanosensoren wahrgenommenen Reize werden auf diese Weise über das Zytoskelett der Zelle weitergeleitet und in chemische Signale umgesetzt. Bezüglich ihres Aufbaus und ihrer Funktion lassen sich die in Abbildung 1 gezeigten vier Hauptgruppen mechanisch gekoppelter Adhäsionen unterscheiden. Zell-Zell-Kontakte Zell-Adhäsion Desmosom Cadherine Hemidesmosom Intermediärfilament Adhäsionskomplex Integrine EZM Proteine (z.b. Fibronketin) Zell-EZM-Kontakte Basallamina Extrazelluläre Matrix (EZM) Fokale Adhäsion Aktinfilamente Abbildung 1: Schemazeichnung der mit dem Zytoskelett verbundenen Zell-Zell- und Zell-EZM-Kontakte. Aktinfasern sind in Rot, Intermediärfilamente in Blau und Mikrotubuli in Gelb gezeichnet. Zell-Zell-Kontakte verknüpfen benachbarte Zellen durch Transmembranproteine der Cadherin-Familie, die über einen Proteinkomplex entweder mit dem Aktinzytoskelett (Zell-Adhäsionen) oder mit Intermediärfilamenten (Desmosomen) verbunden sind. Die Zell-EZM-Kontakte verbinden die extrazellulären Matrixproteine über transmembrane Integrin Rezeptoren und den Adhäsionskomplex aus intrazellulären Proteinen mit Aktinfasern (Fokale Adhäsionen) oder mit Intermediärfilamenten (Hemidesmosomen). (Adaptiert nach 6

12 EINLEITUNG Zell-Zell-Adhäsionen koppeln das Aktinzytoskelett einer Zelle mit dem der Nachbarzelle. Dabei binden transmembrane Ankerproteine der Cadherin-Familie im Interzellularraum aneinander, während sie im Zytoplasma über Adapterproteine, wie z. B. Catenin, α-aktinin und Vinkulin an die Aktinfilamente gebunden sind. Kontraktionen des Aktinzytoskeletts können somit in Zellverbänden weiter geleitet werden. Desmosomen verbinden die Intermediärfilamente benachbarter Zellen, was zu einer mechanischen Stabilisierung des Gewebes führt. Auch diese Zell-Zell-Kontakte werden von Transmembranproteinen der kalziumabhängigen Cadherin-Familie ausgebildet und intrazellulär (über z. B. Desmoplakine und Plakoglobin) mit dem Zytoskelett verknüpft. Hemidesmosomen ähneln in ihrem Aufbau den Desmosomen, nur dass es sich hierbei um Zell-Matrix-Kontakte handelt, bei denen die Intermediärfilamente über Proteine der Integrin Familie an Proteine der extrazellulären Matrix gekoppelt werden. Fokalkontakte stellen die Verbindung zwischen den Aktinfilamenten der Zelle und der extrazellulären Matrix her. Die transmembranen Integrine binden als Adhäsionsrezeptoren an extrazelluläre Proteine (z. B. Fibronektin) und intrazellulär sind sie über Proteine des fokalen Adhäsionskomplexes (z. B. Talin und Vinkulin) mit dem Zytoskelett verbunden Das Zytoskelett Das Zytoskelett ist ein hoch dynamisches, multifunktionales Netzwerk, das im dreidimensionalen Raum alle Kompartimente der Zelle miteinander verbindet. Dieses intrazelluläre Netzwerk bietet eukaryotischen Zellen eine strukturelle Stütze zur Aufrechterhaltung der Zellform und der gerichteten Fortbewegung. Gleichzeitig bietet es die Möglichkeit für aktiven, gerichteten Transport, wie den von Organellen oder die Trennung der Chromosomen in der Mitose. Neben den Aktinfasern besteht das Zytoskelett aus zwei weiteren Arten von Proteinfilamenten, den Mikrotubuli und den Intermediärfilamenten. Alle drei Typen bestehen aus dynamischen Proteinkomponenten, die zu spiralförmigen Faserbündeln polymerisieren (siehe Abb. 2). Diese Fasern agieren wiederum über diverse andere Proteine untereinander. 7

13 EINLEITUNG Protofilament Tubulin Dimer 25 nm Keratin Bündel 10 nm Aktin Monomer 7 nm Abbildung 2: Die drei Filamenttypen des Zellzytoskeletts. Links: Elektronenmikroskopische Aufnahme der drei Filamentarten aus einer permeabilisierten Zelle. Nach Einfrieren und Sublimation des Wassers wurden die Strukturen mit Platin beschichtet. In Rot wurden Mikrotubuli hervorgehoben (Pollard and Cooper, 2009). Mitte: Schematische Darstellung der Struktur von Mikrotubuli (Grün), Intermediärfilamenten (Gelb) und Aktinfilamenten (Rot) (Modifiziert nach Alberts et al., Molecular Biology of the Cell. 4th edition.). Rechts: Immunfluoreszenzaufnahme einer murinen Lungenzelle. In Grün angefärbt ist das Tubulin, in Rot die Zellkerne und das Aktinnetzwerk ist in Blau visualisiert ( Mikrotubuli bilden, wie der Name sagt, eine hohle, Tubus-ähnliche Struktur mit einem Durchmesser von 25 nm, bestehend aus lateral aneinander gelagerten Protofilamenten. Die Protofilamente setzen sich aus Dimeren zusammen, die wiederum aus den globulären α- und β-tubulinen gebildet werden. Mikrotubuli entstehen ausgehend vom Zentrosom und wachsen durch Polymerisation am Plusende in Richtung der Zellperipherie. Sie bilden während der Mitose den Spindelapparat aus, über den die Chromosomen auf die Tochterzellen verteilt werden, außerdem findet der Transport von Organellen oder Vesikeln entlang der Mikrotubuli mithilfe von Motorproteinen (Kinesine, Dyneine, etc.) statt. Die Mikrotubuli gehören zu den steifsten Elementen in tierischen Zellen und tragen durch ihren strukturellen Aufbau zur Widerstandsfähigkeit der Zelle gegen Scherkräfte bei. Intermediärfilamente sind flexible, stabile und langlebige Proteinfasern mit einem Durchmesser von nm und weisen im Gegensatz zu den anderen Fasertypen keine Polarität auf. Sie verbinden Aktinfilamente und Mikrotubuli zusätzlich untereinander, wobei ihre Hauptaufgabe die Stützfunktion ist und durch die 8

14 EINLEITUNG assoziierten Protofilamente bieten die Intermediärfilamente eine hohe Reißfestigkeit. Sie sind daher vor allem in Bereichen hoher mechanischer Krafteinwirkung, wie beispielsweise in Epithelzellen und langlebigen Strukturen wie Haaren, zu finden. Sie kleiden außerdem die innere Kernhülle aus und stabilisieren die Axone von Nervenzellen. Intermediärfilamente (IF) umfassen eine heterogene Proteingruppe, da die Fasern sich je nach Zelltyp aus anderen Proteinen zusammensetzen. Man unterscheidet zwischen Typ 1-IF aus sauren und Typ 2-IF aus basischen Keratinen in Epithelzellen, sowie Typ 3-IF aus Vimentin in mesenchymalen Zellen oder Desmin in Muskelzellen. Als Typ 4-IF bezeichnet man die Neurofilamente der Nervenzellen und als Typ 5-IF die Lamine der Zellkernhülle. Die Aktinfilamente (F-Aktin) mit ihrer flexiblen, doppel helikalen Struktur aus polymerisierten globulären Monomeren (G-Aktin) haben einen Durchmesser von 7-9 nm. Man findet sie unterhalb der Plasmamembran als Netzwerk (kortikales Aktin), aber auch im Zytoplasma als diskrete Faserbündel (Stressfasern) ausgehend von Adhäsionskomplexen an der Membran. Dieser Filamenttyp zeigt ebenfalls eine Orientierung, da zwar Polymerisation an beiden Enden stattfindet, jedoch mit unterschiedlicher Geschwindigkeit. Das langsamer wachsende Pointed end (Minusende) zeigt ins Zellinnere und das Barbed end (Plusende) polymerisiert schneller in Richtung der Plasmamembran. Die Aktinmonomere folgen dem sogenannten Tretmühlen-Mechanismus (Pollard and Mooseker, 1981), da sich ATPgebundenes G-Aktin bevorzugt am Plusende durch schwache, nicht-kovalente Bindungen anlagert, während sich die Monomere, die an dephosphoryliertes ADP gebunden sind, am Minusende des Filaments ablösen (Carlier and Pantaloni, 1997). Bei konstanter G-Aktin-Konzentration in der Zelle findet durch diesen Mechanismus eine dynamische Umstrukturierung der Filamente bei gleichbleibender Länge statt. 9

15 EINLEITUNG A Pointed end (-) Barbed end (+) Latrunculin Cofilin Gelsolin Cytochalasin Profilin B C Filamin α-aktinin Aktinbündel Aktinnetzwerk Abbildung 3: Schematische Darstellung der Aktinpolymerisation und netzwerkbildung. A) Aktinbindungsproteine regulieren die Polymerisation am Plusende (ATP-Aktin in Blau) und Depolymerisation am Minusende (ADP-Aktin in Rot) von F-Aktin. B) Aktinbindende Proteine wie α-aktinin verknüpfen die Filamente zu Stressfasern. C) Ein Netzwerk aus Aktinfilamenten, wie der Zellkortex unterhalb der Plasmamembran, entsteht beispielsweise durch Filamin Verbindungen (Cingolani and Goda, 2008). Einige in Schwämmen und Pilzen gefundene Toxine beeinflussen die Dynamik von Aktinfasern und sind daher sehr hilfreich in der Erforschung der zellulären Funktionen des Aktinzytoskeletts. Das für die Immunfluoreszenz häufig verwendete Phalloidin bindet und stabilisiert beispielsweise das F-Aktin (Cooper, 1987). Substanzen wie Latrunculin A und Cytochalasin D fördern hingegen die Depolymerisation der Filamente, indem sie entweder mit Aktinmonomeren einen Komplex bilden, oder das Barbed end des Filaments durch ihre Anlagerung blockieren (siehe Abb. 3) (Coue et al., 1987). Sowohl das Wachstum, als auch die Verzweigung des F-Aktins werden von mehreren Aktinbindungsproteinen präzise reguliert (Revenu et al., 2004). Capping Proteine binden ein Filamentende und variieren dadurch die Länge des Filaments (z. B. Tropomodulin bindet und blockiert das Minusende), indem sie die Depolymerisation fördern (z. B. Cofilin bindet G-Aktin), die Repolymerisation verhindern (z. B. Gelsolin bindet an das Plusende) oder die Polymerisation unterstützen (z. B. Profilin katalysiert den Austausch von Aktin-gebundenem ADP zu ATP) (Paavilainen et al., 2004; Wear and Cooper, 2004). Weitere Aktinbindungsproteine, wie z. B. Filamin, erzeugen durch die Verknüpfung mehrerer Filamente flexible Aktin-Gele (van der Flier and Sonnenberg, 2001). Eine wichtige Rolle bei der Vernetzung von F-Aktin spielt der ARP2/3-Komplex, dieser bindet seitlich an ein bestehendes Filament und dient als Ausgangspunkt für die Polymerisation eines 10

16 EINLEITUNG weiteren Filaments im 70 Winkel (Krause and Gautreau, 2014). Parallele Aktinfasern werden im Vergleich dazu durch Verbindungsproteine wie α-aktinin oder Fascin zu starren Bündeln geformt (Yamashiro et al., 1998; Sjoblom et al., 2008). Über 50 Klassen verschiedener Aktin- Bindungs-Proteine kennt man inzwischen (Edwards et al., 2014). Die dynamische Struktur der Aktinfilamente wird also durch eine große Anzahl von Faktoren reguliert und kann dadurch schnell auf die jeweiligen zellulären Bedürfnisse angepasst werden (Tseng et al., 2005). So kommt es, dass manche Aktinstrukturen in allen Zelltypen gleich sind, während andere eine sehr spezifische Funktion nur in einzelnen Zellarten erfüllen. In Geweben beispielsweise sind Aktinstrukturen für die Polarität der Zellen und den kohäsiven Zusammenhalt der Epithelzellen verantwortlich oder dienen als mechanische Stütze von Mikrovilli auf der Zelloberfläche. Während der Zellteilung kommt Aktin in Form des kontraktilen Rings zum Einsatz, um die beiden Tochterzellen voneinander abzuschnüren. Und abgesehen von dem kontraktilen Apparat in Muskelzellen, spielt das Aktinzytoskelett vor allem für die Zellbewegung eine große Rolle. Der Auf- und Abbau von Aktin reguliert Filopodien und Lamellipodien an der Zellfront migrierender Zellen und durch ATP Hydrolyse der Myosin Motorproteine an den Aktinfasern können Kräfte generiert werden Integrine als Adhäsionsrezeptoren der Zell-Matrix Adhäsion Integrine gehören zu einer Familie von transmembranen Glykoproteinen und setzen sich jeweils aus einer α- und einer β-untereinheit zusammen. Bei Vertebraten finden sich 24 verschiedene dieser αβ-heterodimere, bestehend aus einer von 18 bekannten α- und einer von 8 β-untereinheiten (Hynes, 2002; Barczyk et al., 2010). Abbildung 4 gibt einen Überblick über die möglichen Kombinationen aus α- und β-untereinheiten und deren Liganden. 11

17 RGD Rezeptoren EINLEITUNG Kollagen Rezeptoren Leukozyten Rezeptoren Laminin Rezeptoren Abbildung 4: Die Integrin Familie mit den verschiedenen Kombinationen aus α- und β-untereinheiten. Eine große Ligandenvielfalt zeigen die häufig vorkommenden Integrin Heterodimere mit β1- und β3- Untereinheiten. Sie bilden Rezeptoren für die RGD-Sequenz in Fibronektin und Vitronektin. β1-dimere stellen außerdem die Verbindung zu Kollagen und Laminin her. In der Basalmembran koppeln α6β4-integrine das Laminin an Intermediärfilamente und die Heterodimere mit β2- oder β7-untereinheiten findet man in Zell-Zell- Adhäsionen von Leukozyten (Barczyk et al., 2010; Hynes, 2002). Jede Untereinheit des Heterodimers besitzt eine große extrazelluläre Domäne, eine einzelne transmembrane und eine kleine intrazelluläre Domäne (bis auf β4-integrin). Die Kombinationsmöglichkeiten der beiden extrazellulären Domänen spezifizieren die Ligandenbindung, wobei es sich primär um extrazelluläre Matrixproteine handelt. Trotz großer Ligandenproteine wie Kollagen, Laminin und Fibronektin, erkennen viele Integrine nur kurze Peptidsequenzen, wie die drei Aminosäuren RGD (Arg-Gly-Asp), die in Fibronektin und Vitronektin zu finden sind. Während manche Integrine nur ein spezifisches Protein erkennen (z. B. α5β1 als Fibronektin Rezeptor), haben andere wiederum eine Vielzahl unterschiedlicher Bindungspartner (z. B. αvβ3 mit Laminin, Kollagen, Fibronektin, Von Willebrand Faktor, Fibrinogen) (Kuhn and Eble, 1994). Neben der Expression verschiedener Integrin Untereinheiten kann die Spezifität durch alternatives Spleißen der zytoplasmatischen Domänen weiter erhöht werden und so auch die intrazelluläre Funktion der Integrine an das jeweilige Gewebe angepasst werden (Aplin et al., 1998). 12

18 EINLEITUNG inaktive Konformation aktive Konformation Abbildung 5: Struktur eines Integrin Heterodimers im inaktiven und aktivierten Zustand. Im aktivierten Zustand klappen die extrazellulären Domänen des Integrin Dimers auf und formen die rezeptorische Liganden-Bindungstasche. Die transmembranen Domänen wandern während dieses Vorgangs weiter auseinander (Shattil et al., 2010). Beide zytoplasmatischen Domänen erfüllen wichtige Aufgaben hinsichtlich der Zytoskelettanbindung und Signaltransduktion. Konservierte Sequenzen nahe der Plasmamembran halten die beiden Untereinheiten vermutlich über Salzbrücken zusammen und in einem inaktiven Zustand, wie in Abbildung 5 (links) gezeigt (Wegener and Campbell, 2008). Durch Ligandenbindung im Zytoplasma ( inside-out signaling) oder an die extrazellulären Domänen ( outside-in signaling) kann eine Konformationsänderung bewirkt werden, so dass die beiden Untereinheiten auseinander schwingen und das Heterodimer aktiviert wird (vgl. Abb. 5, rechts). Dabei geht die abgewinkelte, geschlossene Konformation der extrazellulären Domänen in eine aufrechte, offene Form über (Lu et al., 2001; Xiong et al., 2001; Xiong et al., 2002). Die Signalweiterleitung durch die Integrinmoleküle kann also in beide Richtungen über die Plasmamembran stattfinden. Die Aktivierung durch extrazelluläre Liganden führt häufig zu einer Konformationsänderung, welche die Anbindung zytoplasmatischer Proteine an den intrazellulären Teil der Transmembranproteine ermöglicht und somit die lokale Umstrukturierung des Aktinzytoskeletts oder eine anderweitige 13

19 EINLEITUNG Signalkaskade auslöst (Hynes, 2002; Calvete, 2004; Campbell and Humphries, 2011). Werden die Integrin Heterodimere dagegen durch das Zusammenspiel zytoplasmatischer Proteine (z. B. Talin) aktiviert, so stimuliert die Konformationsänderung der extrazellulären Domänen die Bindung an Matrixproteine und es kann zu einem Clustering, also der lokalen Ansammlung der Integrinmoleküle in der Membran kommen. Dadurch akkumulieren die Bindungsstellen für extrazelluläre Liganden und die Zelladhäsion wird verstärkt (Liddington and Ginsberg, 2002; Takada et al., 2007). Das Clustering wird unterstützt durch die laterale Homo-Oligomerisierung der aktivierten α- und β-untereinheiten (Li et al., 2003) Der Integrin-assoziierte fokale Proteinkomplex Um die Funktion der chemischen und mechanischen Signalübertragung in fokalen Adhäsionen erfüllen zu können, sind die Integrine auf der intrazellulären Seite mit einem multimolekularen Proteinkomplex verknüpft (Calderwood et al., 2003; Petit and Thiery, 2000). Über 50 verschiedene Proteine wurden in fokalen Adhäsionen bereits identifiziert (Zamir and Geiger, 2001a), was zum einen auf die zellspezifischen Integrin Interaktionen zurückzuführen ist, andererseits auf die Komplexität der Steuerungsprozesse dieser zahlreichen Proteine (Bershadsky et al., 2003). Zu den obligatorischen zytoplasmatischen Fokalkontaktproteinen zählen unter anderem Talin, Paxillin, Vinkulin, FAK, p130cas und α-aktinin. Dabei binden einzelne Proteine wie Talin und α-aktinin direkt an die Integrine und stellen die Verbindung zu weiteren fokalen Proteinen wie z. B. Paxillin und Vinkulin her, was letztendlich die Rekrutierung der Aktinfilamente zur Folge hat (Brakebusch and Fassler, 2003; Nanda et al., 2014). Die Verknüpfung der EZM-Proteine über die Integrine und den fokalen Adhäsionskomplex mit dem Aktinzytoskelett der Zelle ermöglicht die bidirektionale Kraftübertragung (Hynes, 2002). 14

20 EINLEITUNG Abbildung 6: Beispiele für Proteine, die an Aufbau und Funktion von fokalen Adhäsionen beteiligt sind. Über ihre zytoplasmatische Domäne binden die Integrin Heterodimere an Proteine, wie z. B. Talin (Orange), die wiederum mit weiteren fokalen Adhäsionsproteinen (z. B. FAK und Vinkulin) interagieren. Der gesamte Proteinkomplex wechselwirkt seinerseits mit dem Aktinnetzwerk. Die fokalen Adhäsionen steuern über mechanische und biochemische Signalkaskaden die Morphodynamik, sowie die Genexpression der Zelle (Harburger and Calderwood, 2009). Talin ist eines der ersten Proteine, das an der Formation von Fokalkontakten beteiligt ist und die Aktivierung der Integrine initiieren kann (Horwitz et al., 1986). Talin besteht aus zwei Polypeptiden, die ein antiparalleles Homodimer formen (Rees et al., 1990). Mit der N- terminalen Kopfdomäne bindet Talin an β1- oder β3-integrine, sowie an fokale Adhäsionsproteine wie FAK oder PIP2 (Seelig et al., 2000; Borowsky and Hynes, 1998). Die PIP2 abhängige Bindung der FERM-Domäne von Talin an ein NPxY-Motiv der β-untereinheit ist ein entscheidender Schritt zur Aktivierung der Integrine (Tadokoro et al., 2003; Nayal et al., 2004). Die größere Domäne am C-Terminus von Talin interagiert währenddessen mit F-Aktin, sowie mit weiteren zytoplasmatischen Bindungspartnern, wie z.b. Vinkulin (Hemmings et al., 1996; Bass et al., 1999). Für Vinkulin befinden sich drei bekannte Bindungsstellen (VBS) im Talin Protein (VBS1: AS ; VBS2: AS ; VBS3: AS ), die alle mit derselben Region in der Vinkulin Kopfdomäne assoziieren. Vinkulin stabilisiert die Bindung von Talin an das Aktinzytoskelett, wodurch eine direkte mechanische Kopplung des Kraft erzeugenden Apparats an die Integrine besteht (Jockusch et al., 1995; Garcia-Alvarez et al., 2003; Giannone et al., 2003). Da in dieser Arbeit in erster Linie die Struktur und Funktion von Vinkulin untersucht wird, wird dieses fokale Adhäsionsprotein in einem separaten Abschnitt genauer 15

21 EINLEITUNG beschrieben. Durch die Calpain-induzierte Proteolyse von Talin kann die Verbindung zwischen Integrinen und Aktinfasern wieder unterbrochen und die Dissoziation fokaler Adhäsionen begünstigt werden (Franco et al., 2004). Wie Talin bindet auch α-aktinin an Integrine, sowie an Aktinfilamente und erfüllt somit eine kraftübertragende Funktion (Otey and Carpen, 2004). Das Aktin bündelnde Protein lokalisiert vor allem in reifen fokalen Adhäsionen an der Ansatzstelle kontraktiler Stressfasern. Dass Integrine nicht nur für die Anheftung an das Substrat dienen, sondern maßgeblich an der Signaltransduktion beteiligt sind, zeigt beispielsweise der Integrin spezifische Anstieg phosphorylierter Proteine in Zellen, die auf Fibronektin beschichteten Oberflächen adhärieren (Burridge et al., 1992). In den fokalen Adhäsionen finden sich neben den stabilisierenden Adapterproteinen zahlreiche an der Signalgebung beteiligte Proteine, wie z. B. Paxillin, FAK und p130cas (Schlaepfer and Hunter, 1998). Durch die Phosphorylierung (MAP-Kinasen, PKC, Src, FAK) und die damit einhergehende Rekrutierung von Paxillin in den fokalen Adhäsionskomplex werden wiederum weitere Gruppen von Signalproteinen aktiviert (Nayal et al., 2006; Brown and Turner, 2004). Als Folge dessen werden Rho-GTPasen mobilisiert und das Aktinzytoskelett reorganisiert (Burridge and Wennerberg, 2004; Guilluy et al., 2011). Besonders RhoA reguliert die MyosinII Aktivität, woraufhin das Motorprotein zusammen mit den Aktinfilamenten als Reaktion auf mechanische Reize intrazelluläre kontraktile Kräfte generieren kann (Chrzanowska-Wodnicka and Burridge, 1996; Zhao et al., 2007). Signalproteine wie die GTPasen Rho und Rac regulieren auch die Kinasen, welche die Phosphorylierung und damit die Funktion verschiedener fokaler Adhäsionsproteine steuern. Bei der Betrachtung der großen Anzahl beteiligter Proteine und deren unterschiedlichen Aufgaben, die bislang nur unzureichend verstanden und von Zelltyp zu Zelltyp unterschiedlich sein können, wird offensichtlich, dass fokale Adhäsionen dynamische Strukturen mit wechselnder Größe und Zusammensetzung sind (vgl. Abb. 6). Aufgrund der mechanischen Kopplung, sowie der Signalgebung, regulieren die fokalen Adhäsionen die Struktur des Zytoskeletts, Mechanotransduktion, Migration, aber auch Proliferation, Differenzierung und Apoptose der Zelle. 16

22 EINLEITUNG Phosphorylierung Die reversible Phosphorylierung von Proteinen ist eine der wichtigsten posttranslationalen Modifikationen und der häufigste Mechanismus zur Regulation von Proteinfunktionen und Signalübertragung. Etwa ein Drittel des humanen Proteoms wird zu einem gewissen Zeitpunkt phosphoryliert und es beinhaltet geschätzte 500 Kinasen (Manning et al., 2002). Bei Abbildung 7: Phosphorylierung und Dephosphorylierung durch Proteinkinasen und -phosphatasen Proteinkinasen handelt es sich um Enzyme, welche die Übertragung der terminalen Phosphatgruppe aus einem Adenosintriphosphat (ATP) auf die Hydroxylgruppe einer der Aminosäuren Serin, Threonin oder Tyrosin katalysieren (Abb. 7). Die entgegengesetzte Reaktion, also die Hydrolyse und Freisetzung des Phosphats, wird von Proteinphosphatasen übernommen. Da Kinasen nicht nur die Zielaminosäure ihres Substrates, sondern auch die umliegende Konsensussequenz erkennen, wirken manche Kinasen ganz spezifisch auf einzelne Proteine während andere multiple Substrate phosphorylieren (Pawson and Nash, 2003). Die Wirkung der Phosphorylierung auf das jeweilige Protein ist sehr vielfältig, z. B. kann die dreidimensionale Proteinkonformation verändert, eine Enzymaktivität reguliert oder die Interaktion von Proteinen untereinander ermöglicht werden (Krebs and Beavo, 1979). Tyrosinkinasen sind wichtige Komponenten der Zellproliferation, -differenzierung und -migration. Viele Signaltransduktionskaskaden beruhen auf der Rekrutierung zytoplasmatischer Proteine an die Membran, wo sie an phosphorylierte Rezeptoren binden oder selbst phosphoryliert werden. Die Klasse der Rezeptortyrosinkinasen (z.b. EGF- oder Insulin-Rezeptoren) besitzt eine transmembrane Domäne mit einer extrazellulären Liganden- Bindungsstelle (Rezeptor) und dem intrazellulären katalytischen Zentrum (Tyrosinkinase). Durch die Ligandenbindung werden die Rezeptorkinasen aktiviert, sie bilden Dimere und können durch Autophosphorylierung zytoplasmatischer Tyrosine sowohl ihre aktive Form stabilisieren, als auch Bindungsstellen für andere Proteine der Signalkette zur Verfügung stellen. Die rekrutierten Proteine besitzen konservierte Bindungsdomänen für spezifische Aminosäuren. Die Domänen SH2 (Src homology 2) und PTB (phosphotyrosine binding) erkennen beispielsweise spezifische Phosphotyrosin-Motive (py). Zu den Tyrosinkinasen ohne extrazelluläre ligandenbindende Rezeptordomäne, gehören unter anderen die Familien der Src-, Abl- und FAK-Kinasen. Diese zytoplasmatischen Kinasen 17

23 EINLEITUNG werden durch Hormone, Neurotransmitter, Zytokine oder Wachstumsfaktoren aktiviert. Auch diese Aktivierung beginnt häufig mit der Phosphorylierung eines Tyrosinrestes. Die c-src-kinase ist eines von neun Mitgliedern der Src-Familie, sie kommt in vielen verschiedenen Zelltypen und auch in unterschiedlichen Bereichen der Zelle vor. Die Proteinstruktur von Src-Kinasen umfasst vier Domänen: eine katalytische Domäne (SH1), eine SH2 und eine SH3 Domäne, eine N-terminale Membran-Lokalisations-Sequenz mit einem Myristinsäurerest, sowie eine darauf folgende spezifische Region für die jeweilige Kinase (Boggon and Eck, 2004). Wichtig ist außerdem der kurze C-terminale Schwanz der Src-Kinase, mit dem darin enthaltenen Tyrosin-Rest an Position 527 (Brown and Cooper, 1996). Die Kinase kann durch vielfältige extrazelluläre Signale aktiviert werden, dazu gehören EZM-Integrin- Kontakte und z. B. Wachstumsfaktoren wie EGF (Parsons and Parsons, 1997). Die transiente Aktivierung erfolgt durch eine konformationelle Änderung, indem die intramolekulare Bindung der SH2 Domäne an py527 im C-Terminus gelöst und die Kinasedomäne exponiert wird. Um volle Funktionalität zu erlangen, ist zusätzlich die Autophosphorylierung von Y416 in der Kinasedomäne erforderlich (Stover et al., 1994). Während der Adhäsion von Fibroblasten auf Fibronektin wird c-src dephosphoryliert und lokalisiert in fokalen Adhäsionen (Kaplan et al., 1994; Kaplan et al., 1995). Die Bindung der SH2 und SH3 Domänen an p130cas könnte bei der Lokalisation eine Rolle spielen, oder auch die offene, aktive Konformation von c-src stabilisieren (Nakamoto et al., 1996). Über die gleichen Domänen kann die Src-Kinase auch Paxillin oder die fokale Adhäsionskinase binden und phosphorylieren. Die Tyrosinkinase FAK (fokale Adhäsionskinase) ist ein ca. 125 kda großes Protein mit einer zentralen Kinasedomäne und zwei prolinreichen Sequenzen im C-Terminus. Durch die FAT Sequenz lokalisiert FAK in den fokalen Adhäsionen (Hanks et al., 1992; Schaller et al., 1992). In adhärenten Zellen bewirkt die Signalgebung der Integrine und die Anwesenheit der Src- Kinase einen Anstieg der phosphorylierten Tyrosine im FAK Protein und damit eine gesteigerte Aktivität der Kinase (Withers et al., 1996; Burridge et al., 1992; Guan and Shalloway, 1992), während das Protein in abgelösten Zellen wieder dephosphoryliert wird (Calalb et al., 1995). Die Src-Kinase bindet an das autophosphorylierte FAK Protein und fördert dadurch wiederum die Assoziation des Adapterproteins p130cas in den Komplex, sowie dessen Phosphorylierung durch FAK (Schlaepfer et al., 1997; Aplin et al., 1998). Das Ausmaß der Phosphorylierung reguliert verschiedene Interaktionen der fokalen Adhäsionskinase, die neben p130cas, 18

24 EINLEITUNG Paxillin und Talin, an eine Vielzahl von Proteinen bindet, die eine SH2 oder SH3 Domäne beinhalten (Bellis et al., 1995; Harte et al., 1996; Hildebrand et al., 1995; Chen et al., 1995). Somit fungiert FAK auch als vernetzender Bindungspartner im Aufbau fokaler Adhäsionen. Es wird deutlich, dass die fokalen Adhäsionskomponenten Src, FAK, p130cas und Paxillin eine funktionelle Einheit bilden und essenziell sind für die Struktur- und Signalgebung in den Adhäsionen. Die Aktivierung von Tyrosinkinasen stellt also einen entscheidenden Vorgang der Integrin-vermittelten Signalkaskade dar, auch wenn nach wie vor unklar ist, wie deren Aktivierung tatsächlich vonstattengeht. Src, FAK und weitere Kinasen, sowie die antagonistischen Phosphatasen, spielen eine wichtige Rolle für zahlreiche zelluläre Abläufe wie beispielsweise Zellwachstum, Migration, Apoptose, Gentranskription, der Immunreaktion oder der neuronalen Entwicklung (Burke, 1994; Burke and Zhang, 1998). Durch die reversible Phosphorylierung können Signale also weitergeleitet und amplifiziert werden, so dass die Zelle in der Lage ist schnell auf intra- oder extrazelluläre Reize zu reagieren. 3.2 Dynamik und Kraftgeneration fokaler Adhäsionen Nicht nur im Verlauf der Embryogenese, sondern auch im adulten Organismus, findet dynamische Zellbewegung innerhalb der Gewebe statt. Besonders deutlich wird die Migration bei der Wundheilung, wenn Fibroblasten einwandern, oder bei der Metastasenbildung, wenn einzelne Zellen aus dem Primärtumor auswandern und sich an einer anderen Stelle im Körper erneut ansiedeln. Obwohl Zellen in vivo von einem dreidimensionalen Netzwerk aus EZM- Proteinen umgeben sind, was deren Migrationsverhalten stark beeinflusst, können die grundlegenden Prozesse der Adhäsions- und Zytoskelettdynamik auch auf zweidimensionalen Substraten gut untersucht werden. Erst das koordinierte Zusammenspiel von Kraftgeneration und Kraftübertragung auf das Substrat ermöglicht die Bewegung und damit die Reaktion der Zelle auf äußere Stimuli. 19

25 EINLEITUNG 1) Protrusion durch Aktinpolymerisation 2) Bildung neuer fokaler Adhäsionen 3) Kontraktion 4) Ablösen von Adhäsionen am hinteren Zellende Abbildung 8: Die vier Stufen der Zellmigration. 1) Durch Aktinpolymerisation (Grün) bildet die Zelle dynamische Protrusionen. 2) Bestimmte Protrusionen werden durch neue Fokalkontakte (Rot) am Substrat verankert. 3) Durch Kontraktion des Aktinzytoskeletts werden die Fokalkontakte stabilisiert. 4) Nach dem Ablösen bestehender fokaler Adhäsionen im hinteren Teil der Zelle verschiebt sich der Zellkörper durch die Kontraktion in Richtung der neuen Adhäsionen (Modifiziert nach commons.wikimedia.org). Um zu migrieren, muss die Zelle zunächst eine polarisierte Form einnehmen, welche die Migrationsrichtung vorgibt. Aus dem Aktinnetzwerk an der Zellfront werden durch Polymerisation breite Lamellipodien oder einzelne Filopodien mit langen parallelen Aktinfaserbündeln aus der Membran ausgestülpt (Pollard and Borisy, 2003). Durch die Protrusion (vgl. Abb. 8), also das Vorwärtsschieben der Membran durch lokale Aktinpolymerisation, erschließt die Zelle neues Territorium. Der Auf- und Abbau von Filopodien findet innerhalb weniger Minuten statt. Um ein gebildetes Filopodium zu stabilisieren, müssen die Aktinfilamente über Fokalkontakte an der extrazellulären Matrix verankert werden. Über diese neuen Verankerungen in der Zellfront werden durch Aktin- Myosin-Kontraktion (gesteuert durch Rho-Kinasen) Zugkräfte aufgebaut (Ridley, 2001; Huttenlocher et al., 1995; Beningo et al., 2001). Die auf das Substrat übertragenen Kräfte stabilisieren die neuen fokalen Adhäsionen und setzen die Zelle unter Spannung (Pasapera et al., 2010). Um die Kontraktionskräfte in eine effiziente Vorwärtsbewegung zu verwandeln, müssen die Adhäsionen im hinteren Teil der Zelle vom Substrat gelöst werden. Sobald die adhäsiven Strukturen im Zellende (mechanisch oder biochemisch) aufgelöst wurden, bewegt sich der Zellkörper entsprechend der Zugkräfte in Richtung der Zellfront (Retraktion). Folglich definiert die räumliche Verteilung der Protrusionen und der unterschiedlich starken 20

26 EINLEITUNG Adhäsionen die Migrationsrichtung einer Zelle. Es ist bekannt, dass Zellen entlang von Gradienten chemischer oder strukturgebundener Signalstoffe migrieren (Chemotaxis, Haptotaxis). Demzufolge muss eine Signaltransduktion der äußeren Reize und die Umsetzung in eine koordinierte Steuerung der kontraktilen und adhäsiven Strukturen stattfinden. Der Adhäsionsprozess beginnt mit kleinen, punktförmigen, hoch dynamischen Anheftungen ans Substrat, in denen zunächst Talin eine Verbindung zwischen den Integrinen und den Aktinfilamenten herstellt (Izzard, 1988; Mohl et al., 2009). Dieses frühe Stadium in der Zellperipherie wird auch als focal contact bezeichnet. Die fokalen Kontakte spielen vermutlich eine Rolle für die mechanische Sensorik der Zelle bei der Erkundung (Steifigkeit, Geometrie) ihrer Umgebung (Vogel and Sheetz, 2006; Galbraith et al., 2007; Partridge and Marcantonio, 2006; Discher et al., 2005; Geiger et al., 2009) und ihre Anzahl und Größe hängt stark von den Eigenschaften des Substrats ab (Zamir and Geiger, 2001b). Viele dieser frühen Kontakte lösen sich innerhalb kurzer Zeit wieder auf, während andere durch Rekrutierung weiterer Proteine und der Bündelung von Aktinfasern zu Stressfasern, sowie der damit einhergehenden Kraftgeneration zu sogenannten focal adhesions heran reifen (Galbraith et al., 2002; Zamir et al., 2000; Balaban et al., 2001; Riveline et al., 2001; Nishizaka et al., 2000; Webb et al., 2002). Die applizierten Kräfte aus der Umgebung, sowie die vom Aktinzytoskelett ausgeübten Zugkräfte aus dem Inneren der Zelle, bewirken eine lokal verstärkte Anhäufung von Integrinen in der Membran (Clustering) (Choquet et al., 1997; Deng et al., 2004) und die Anlagerung weiterer Proteine, insbesondere von Vinkulin im fokalen Komplex (vgl. Abb. 9) (Galbraith et al., 2002; Rubashkin et al., 2014; Pasapera et al., 2010). Auf diese Weise wird die Verbindung weiter stabilisiert und es findet ein Größenwachstum der fokalen Adhäsionen statt (Zaidel-Bar et al., 2004; Delanoe-Ayari et al., 2004; Golji et al., 2011; Balaban et al., 2001; Bershadsky et al., 2003). 21

27 EINLEITUNG F-Aktin inaktives Vinkulin aktives Vinkulin Talin inaktives Integrin aktives Integrin EZM Zellfront focal adhesion focal complex Abbildung 9: Reifung der fokalen Adhäsionen. Durch Aktivierung und Anlagerung weiterer Proteine, sowie der Anbindung an das Aktinzytoskelett und der damit einhergehenden Kraftübertragung reifen initiale focal contacts zu stabilen focal adhesions. Auf die gleiche Art können Adhäsionen wieder destabilisiert werden und der Proteinkomplex dissoziiert (Adaptiert nach Humphries et al., 2007). Neben der Zusammensetzung des Proteinkomplexes ändert sich auch der Phosphorylierungsgrad der Proteine. Das bedeutet, dass Kinasen zu den ersten rekrutierten bzw. aktivierten Proteinen im Komplex zählen (Obergfell et al., 2002; Arias-Salgado et al., 2003). Durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung kann die Dynamik und das Reifungsstadium der fokalen Adhäsionen gesteuert werden (Zaidel-Bar et al., 2007; Lele et al., 2008; Qin et al., 2015). Es ist denkbar, dass eine Erhöhung der Dynamik zu einer Destabilisierung und in Kombination mit den angelegten Aktinzugkräften schließlich zu der Auflösung der fokalen Adhäsion führen kann (Galbraith and Sheetz, 1997; Wolfenson et al., 2011; Crowley and Horwitz, 1995). Die Dissoziation der fokalen Adhäsionen muss neben der ausgeübten Kraft über diverse Signalwege reguliert werden, an denen vermutlich diverse GTPasen, FAK und auch Src-Kinasen beteiligt sind (Lauffenburger and Horwitz, 1996; Riento and Ridley, 2003; Crowley and Horwitz, 1995; Carragher and Frame, 2004). Die Zugkräfte des Zytoskeletts entstehen durch das Zusammenspiel von Myosin Motorproteinen und Aktinfilamenten. Myosin II induziert durch die laterale Verschiebung der Aktinfasern zueinander Kontraktionskräfte, ähnlich wie im Sarkomer von Muskelzellen. Generell beruhen mechanische Signalwege darauf, dass ein Signal in Form mechanischer Kräfte, wie beispielsweise Zugkräfte oder Scherspannung, auf Biomoleküle übertragen werden. Oftmals induziert die ausgeübte Kraft eine Konformationsänderung des Proteins, 22

28 EINLEITUNG wodurch funktionelle Domänen freigelegt werden (del Rio et al., 2009). Dies kann der Auslöser für den Umbau des Zytoskeletts, der Zellform oder modifizierter Genexpression sein (Chiquet et al., 2009). Mechanische Reize werden häufig schneller weitergeleitet, als es bei der Wahrnehmung chemischer Signale der Fall ist (Na et al., 2008). Als weiteres Beispiel wurde beobachtet, dass mechanische Zugkräfte, die von außen auf die Zelle einwirken, einen Kalziumeinstrom über die Membran verursachen, was wiederum intrazelluläre Kraftgeneration und die Rekrutierung von Vinkulin zu den fokalen Adhäsionen bewirkt (Munevar et al., 2004). Die Stabilisierung fokaler Adhäsionen und die Kraftübertragung auf das Substrat werden maßgeblich durch Vinkulin reguliert (Gallant et al., 2005). Folglich ist es unerlässlich die Regulationsmechanismen der Vinkulin Rekrutierung zu entschlüsseln, um die Signalwege und Steuerung der Bildung und Dynamik von fokalen Adhäsionen zu verstehen. 3.3 Das fokale Adhäsionsprotein Vinkulin Bereits 1980 wurde Vinkulin (Vcl) in Adhäsionsstrukturen nachgewiesen (Geiger, 1979; Geiger et al., 1980). Vinkulin kommt sowohl in fokalen Adhäsionen (Integrin vermittelte EZM- Kontakte), als auch in Cadherin vermittelten Zell-Zell-Kontakten, mit ähnlicher Funktion aber etwas anderen Bindungspartnern vor (Huveneers et al., 2012). Zudem gibt es in Muskelzellen eine spezifische Spleißvariante von Vinkulin, das Metavinkulin Proteinstruktur Durch Entschlüsselung der vollständigen Aminosäuresequenz von Vinkulin, stellte sich heraus, dass es sich hierbei um ein hoch konserviertes und ubiquitär exprimiertes, 116 kda großes Protein, bestehend aus 1066 Aminosäuren handelt (Coutu and Craig, 1988). Diese ersten Erkenntnisse über die Proteinstruktur legten bereits nahe, dass intramolekulare Wechselwirkungen zwischen der sauren Kopf- und der basischen Schwanzdomäne möglich sind (Strasser et al., 1993). Bindungsstudien mit den isolierten Domänen (Vh, Vt) konnten zudem eine starke Interaktion zwischen dem Vinkulin-Kopf und -Schwanz nachweisen, welche die Affinität des Bindungspartners Talin an die Kopfdomäne schwächt und auch die Degradation der Kopfdomäne durch die Protease V8 inhibiert (Johnson and Craig, 1994). Auch die Bindung von F-Aktin an die Vinkulin Schwanzdomäne war im nativen Molekül nicht möglich (Johnson and Craig, 1995b). Die darauf folgende Identifikation der dreidimensionalen 23

29 EINLEITUNG Kristallstruktur von Vinkulin ergab acht Helix-Bündel, die sich tandemartig zusammen finden (Bakolitsa et al., 2004; Borgon et al., 2004). N-terminal bilden vier Domänen (D1: AS 6-252, D2: AS , D3: AS , D4: AS ) die globuläre Kopfdomäne von Vinkulin, welche über eine prolinreiche flexible Region (AS ; 45% Prolin) mit der ebenfalls globulären C-terminalen Schwanzdomäne (Vt: AS ) verbunden ist. D1 bis D3 der Kopfdomäne formen eine Tasche, in der die Schwanzdomäne sich anlagert und zusätzlich an D4 bindet (Abb. 10). Abbildung 10: Kristallstruktur von Vinkulin in der autoinhibierten Konformation. Die helikalen Domänen D1 bis D4 bilden die Kopfdomäne, welche über eine prolinreiche Region mit der Schwanzdomäne (Vt) verbunden ist. Angezeichnet sind außerdem einige Bindungsstellen für potentielle Liganden (Bakolitsa et al., 2004). Auf Grund der Beobachtung, dass die Kopf-Schwanz-Interaktion des Vinkulin Moleküls die Bindung zu anderen fokalen Adhäsionsproteinen beeinflusst bzw. potentielle Bindungsstellen maskiert, wurde angenommen, dass diese hochaffinen, intramolekularen Wechselwirkungen eine Form der Aktivitätsregulation von Vinkulin und dessen Rekrutierung in den fokalen Komplex darstellen. Das Vinkulin Protein liegt folglich im Zytoplasma der Zelle in einer autoinhibierten, geschlossenen Konformation vor und wird erst in den fokalen Adhäsionen aktiviert. Die konformationelle Änderung konnte schließlich durch ein FRET-Konstrukt (Förster-Resonanzenergietransfer) von Vinkulin und reduzierten Fluoreszenz-Signalen in den fokalen Adhäsionen nachgewiesen werden (Chen et al., 2005). 24

30 EINLEITUNG Bindungspartner In der aktivierten, offenen Konformation werden zahlreiche Bindungsstellen des Vinkulin Moleküls zugänglich, die zuvor sterisch und allosterisch blockiert waren. Abbildung 11 gibt einen Überblick über einige der mit Vinkulin interagierenden Proteine. In der D1 Domäne befinden sich Bindungsstellen für Talin und α-aktinin (Izard et al., 2004; Bois et al., 2006; Bass et al., 2002; McGregor et al., 1994; Kroemker et al., 1994). Weiter hinten in der prolinreichen Verbindungsregion von Vinkulin bindet z. B. der Arp2/3 Komplex, welcher bei der Vernetzung von Aktin eine Rolle spielt und Vinexin, welches erst durch Vinkulin in den fokalen Kontakt rekrutiert wird und ebenfalls für die Adhäsion der Zelle wichtig ist, sowie auch VASP (Chen et al., 2005; Kioka et al., 1999; Takahashi et al., 2005; Huttelmaier et al., 1998; Brindle et al., 1996; DeMali et al., 2002) und p130cas (Janostiak et al., 2014). In der Schwanzdomäne von Vinkulin bindet Paxillin, was vermutlich eine kompetitive Wirkung auf die Bindung von Paxillin zu FAK hat (Turner, 2000; Wood et al., 1994). Ohne die Bindung von Vinkulin an Paxillin findet eine dauerhafte Aktivierung des ERK-Signalwegs durch Paxillin und FAK statt, wodurch die Zelle kaum noch auf Apoptosesignale anspricht (Subauste et al., 2004). Auch die Protein Kinase C (PKC) bindet am C-terminalen Ende der Schwanzdomäne von Vinkulin und kann eine Phosphorylierung der Serin-Reste in dieser Region induzieren (Weekes et al., 1996; Ziegler et al., 2002). Weitere Bindungsstellen finden sich im Vinkulin Schwanz für Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) und der C-Terminus von Vinkulin scheint mit Phospholipid- Membranen zu interagieren (Diez et al., 2008; Johnson et al., 1998; Chandrasekar et al., 2005; Gilmore and Burridge, 1996; Weekes et al., 1996; Niggli et al., 1990). Die dominierende Interaktion der Schwanzdomäne ist sicherlich die Bindung an Aktinfilamente, die mit der Lipidbindung konkurriert (Menkel et al., 1994; Huttelmaier et al., 1997; Steimle et al., 1999; Humphries et al., 2007). Inzwischen wurde gezeigt, dass es sich um zwei Aktinbindungsstellen handelt, wovon die eine in der autoinhibierten Vinkulin Konformation zugänglich ist, die zweite allerdings von der Kopfdomäne abgeschirmt wird (Janssen et al., 2006). Nach der Aktivierung von Vinkulin und der vollständigen Bindung an Aktin, findet eine Dimerisierung des Vinkulin Schwanzes und somit eine Bündelung der Aktinfilamente statt (Johnson and Craig, 2000). 25

31 EINLEITUNG Abbildung 11: Schematischer Überblick über eine Auswahl von Vinkulin-Bindungspartnern und deren Funktionen (Carisey and Ballestrem, 2011) Funktionen Wie wichtig Vinkulin für die Kraftübertragung in fokalen Adhäsionen und den damit einhergehenden zellulären Funktionen, bzw. pathologischen Krankheitsbildern ist, zeigen zahlreiche Publikationen. Vinkulin knock-out Mäuse sterben während der Embryonalentwicklung an Tag E10 durch neuronale und kardiovaskuläre Defekte (Xu et al., 1998) und selbst heterozygote Tiere weisen eine Prädisposition für Kardiomyopathien auf (Zemljic-Harpf et al., 2004). Außerdem konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression von Vinkulin die Adhäsionsdynamik verlangsamt und die Zellen an der Migration hindert, während eine reduzierte Expression die Beweglichkeit von Zellen erhöht. Vinkulin knock-out Zellen adhärieren schlechter, sind beweglicher und zeigen weniger und kleinere fokale Adhäsionen als Wildtyp Zellen (Rodriguez Fernandez et al., 1993; Rodriguez Fernandez et al., 1992a; Varnum-Finney and Reichardt, 1994; Goldmann et al., 1995; Saunders et al., 2006). Vinkulin, eines der ersten in den fokalen Komplex rekrutierten aktinbindenden Proteine (Geiger et al., 1980; Zaidel-Bar et al., 2003), steuert die Assoziation mit dem Zytoskelett, die Austauschdynamik der fokalen Adhäsionsproteine (Mohl et al., 2009), sowie diverse Signalkaskaden (Subauste et al., 2004; Carisey and Ballestrem, 2011). Insbesondere steuert Vinkulin die Kontraktilität und Kraftübertragung der Zelle auf das Substrat, indem es eine mechanische Verbindung zwischen Aktinfasern und den Integrin Rezeptoren schafft (Ezzell et 26

32 EINLEITUNG al., 1997; Grashoff et al., 2010; Mierke et al., 2008; Thievessen et al., 2013; Alenghat et al., 2000). Daher wird vermutet, dass das Vinkulin Molekül auch als Mechanosensor fungiert (Geiger and Bershadsky, 2002; Holle et al., 2013). Vinkulin beeinflusst die Adhäsion, Kontraktilität und Beweglichkeit von Zellen, alles Prozesse, die bei der Entartung von Krebszellen eine Rolle spielen. Auch das Invasionsverhalten von Zellen in dreidimensionalen Matrizen, eine wichtige Voraussetzung für die Metastasenbildung, wird durch die Expression von Vinkulin modifiziert (Rodriguez Fernandez et al., 1992a; Mierke et al., 2010; Lifschitz- Mercer et al., 1997; Rubashkin et al., 2014). Sogar Tumor-Supressor Aktivität konnte durch Transfektion mit Vinkulin cdna nachgewiesen werden (Rodriguez Fernandez et al., 1992c; Liu et al., 2007). In diesen Studien zeigte sich, dass das Verhalten von Zellen in 2D und in 3D sehr differenziert betrachtet werden muss. Während die Expression von Vinkulin auf zweidimensionalen Substraten die Migration verzögert, indem es die Adhäsion der Zellen verstärkt und die Dynamik der fokalen Kontakte verlangsamt, erleichtert Vinkulin in dreidimensionalen Kollagengelen die Invasion, vermutlich indem es außer der Kraftübertragung auch die Polarisation der Zelle und die gerichtete Kraftgeneration unterstützt (Koch et al., 2012b; Goldmann et al., 2013) Aktivierung Um seine wichtige Funktion in der Zelle erfüllen zu können, muss das Vinkulin Protein nicht nur exprimiert werden, sondern auch in den fokalen Adhäsionen eine aktive, offene Konformation einnehmen. Wie es zur konformationellen Aktivierung des Vinkulin Moleküls mit der damit einhergehenden Exposition der diversen Bindungsstellen kommt und welche Interaktionspartner daran beteiligt sein müssen, ist stark umstritten. Auf der einen Seite gibt es Studien (meist mit isolierten Kopf- und Schwanzfragmenten) die darlegen, dass die Bindung von Talin allein ausreichend ist für die Aktivierung (Izard et al., 2004; Izard and Vonrhein, 2004; Bois et al., 2006). Andererseits wird berichtet, dass die Bindung zwischen der Vinkulin Kopfund Schwanzdomäne im nativen Molekül so stark ist, dass mindesten zwei oder mehr Bindungspartner an der Dissoziation beteiligt sein müssen (Bakolitsa et al., 2004; Cohen et al., 2005; Chen et al., 2006; Golji and Mofrad, 2010). Daraus ergab sich das Modell einer kombinatorischen Aktivierung (Ziegler et al., 2006; Goldmann et al., 2013), wie in Abbildung 12 gezeigt, an der sowohl Protein-Bindungspartner, als auch Lipidinteraktionen, 27

33 Integrin Integrin Integrin EINLEITUNG sowie Phosphorylierung und Kraftübertragung über das Vinkulin Molekül beteiligt sein können. Phosphorylierung und Proteinbindung Aktiver Zustand Kompetitive Lipidbindung Saure Phospholipide SRC Vt ATP ADP Vt Vinkulin α-aktinin p130cas, Arp2/3 etc. P P Vt Vh Paxillin Aktin Aktin Aktin Kraftübertragung Chemische Signalgebung Abbildung 12: Kombinatorisches Modell zur Aktivierung von Vinkulin. Sowohl Phosphorylierung und die Bindung von Proteinen an der Kopf- und Schwanzdomäne, als auch die Lipidinteraktion beeinflussen die Aktivierung des Vinkulin Moleküls. In seiner offenen, aktiven Konformation werden Bindungsstellen für weitere Proteine zugänglich und die Kraftübertragung sowie biochemische Signalkaskaden werden induziert (Goldmann et al., 2013). Durch die Bindung der Vinkulin Kopfdomäne an Talin und α-aktinin und der simultanen Bindung der Schwanzdomäne an Aktinfilamente ergibt sich eine starke mechanische Verbindung für die Kraftübertragung (Kanchanawong et al., 2010; Goldmann, 2012; Giannone et al., 2003; Margadant et al., 2011). Diese beidseitige Interaktion mit Bindungspartnern ist eine überzeugende Vorstellung der Aktivierung des Vinkulin Moleküls und der Freilegung der Bindungsstellen für weitere Proteine (Chen et al., 2006). Die über das Molekül übertragenen Zugkräfte stabilisieren in dieser Vorstellung die offene Konformation (Golji and Mofrad, 2010; Carisey et al., 2013). Allerdings wurde noch nicht ausreichend gezeigt, dass auch beide Domänen in der autoinhibierten Vinkulin Form für die Bindungspartner zugänglich sind. Computersimulationen der Moleküldynamik (MD) ergaben, dass Talin erst an die Kopfdomäne binden kann nachdem Vinkulin aktiviert wurde (Golji et al., 2011). Im Talin Molekül selbst ist ebenfalls nur eine der Vinkulin Bindungsstellen zugänglich, während die anderen ins Innere 28

34 EINLEITUNG der dreidimensionalen Proteinstruktur gerichtet sind, so dass Talin zunächst aktiviert werden muss, um diese zu exponieren (Papagrigoriou et al., 2004; Patel et al., 2006; Gingras et al., 2005; Hytonen and Vogel, 2008). Das Gleiche gilt für α-aktinin, auch dessen Bindung an die Vinkulin D1 Domäne erfordert zunächst sowohl eine konformationelle Aktivierung von Vinkulin, als auch eine konformationelle Änderung der α-aktinin-struktur (Shams et al., 2012; Ylanne et al., 2001; Kroemker et al., 1994). Für beide Proteine ist ebenfalls eine durch Kraft induzierte Aktivierung denkbar. Des Weiteren konnte bereits wiederholt durch Aktin-Co- Sedimentations Versuche belegt werden, dass die zytoplasmatische, inaktive Vinkulin Form nicht in der Lage ist an F-Aktin zu binden weil die Bindungsstellen durch die Kopf-Schwanz- Interaktion maskiert sind (Johnson and Craig, 1995b). Da der C-Terminus von Vinkulin nicht nur mit Aktin sondern auch mit Phospholipiden interagieren kann (Johnson and Craig, 1995a), wurde auch die Integration von Vinkulin in Lipidmembranen bereits als möglicher Aktivierungsmechanismus diskutiert (Tempel et al., 1995; Johnson et al., 1998; Diez et al., 2009; Diez et al., 2008; Niggli et al., 1986; Niggli and Gimona, 1993; Gilmore and Burridge, 1996; Weekes et al., 1996). Während vermutet wurde, dass die letzten fünf Aminosäuren der Schwanzregion in die Membran inserieren (Bakolitsa et al., 1999), konnte jedoch keine spontane Assoziation von nativem Vinkulin mit Lipidvesikeln beobachtet werden (Johnson et al., 1998). Eine weitere Studie zeigte, dass die Bindung von Vinkulin an PIP2 zwar eine regulatorische Funktion erfüllt, aber weniger die Aktivierung als eher die Dissoziation der fokalen Adhäsionen durch Lösen der Vinkulin-Aktin-Bindung bewirkt (Chandrasekar et al., 2005). Neben der kompetitiven Bindung von Phospholipiden und Aktinfilamenten, konnte in früheren Experimenten in Gegenwart anionischer Phospholipide auch ein Anstieg der Tyrosin Phosphorylierung von Vinkulin registriert werden (Ito et al., 1982; Ito et al., 1983). Phosphorylierung durch die Proteinkinase C (PKC) oder Kinasen der Src-Familie, welche im fokalen Adhäsionskomplex vorliegen, wäre ein weiterer plausibler Mechanismus, der zur konformationellen Aktivierung von Vinkulin beitragen kann (Johnson and Craig, 1994; Schwienbacher et al., 1996). Phosphorylierung ist ein entscheidender Vorgang während der Zelladhäsion und Kinase-defiziente Fibroblasten (Src -/-, Yes -/-, Fyn -/-) zeigten Beeinträchtigungen bei der Ausbreitung und der Migration auf Fibronektin beschichteten 29

35 EINLEITUNG Oberflächen (Klinghoffer et al., 1999). Vinkulin war zudem das erste identifizierte Substrat der Tyrosinkinase v-src, das Produkt eines Onkogens aus dem Rous-Sarkom-Virus, welches zu unkontrolliertem Wachstum der Wirtszelle führt (Sefton et al., 1981). In verschiedenen Zelltypen konnten Vinkulin Proteine mit phosphorylierten Tyrosin-Resten nachgewiesen werden (Vostal and Shulman, 1993; Massoumi and Sjolander, 2001) und schließlich konnten auch die durch die Src-Kinase (c-src) phosphorylierten Positionen Y100 in der Kopf- und Y1065 in der Schwanzdomäne von Vinkulin identifiziert werden (Zhang et al., 2004). In der Kopfdomäne befinden sich sechs weitere Tyrosin-Reste, die allerdings im Gegensatz zu Position 100 und 1065 nicht durch Phosphotyrosin-spezifische Antikörper markiert wurden und somit konnte an diesen Tyrosinen keine relevante Phosphorylierung nachgewiesen werden (Zhang et al., 2004). Inzwischen hat man herausgefunden, dass Vinkulin an einer dieser Positionen (Tyrosin 822) in Zell-Zell-Kontakten von der Abl-Tyrosinkinase phosphoryliert wird (Bays et al., 2014). Krafteinwirkung auf die Cadherin-vermittelten Adhäsionskontakte bewirkt in diesem Fall eine verstärkte Vinkulin Phosphorylierung, während eine nicht-phosphorylierbare Y822F Mutante eine Versteifung der Zellen verhindert (Goldmann et al., 1998). Die Phosphorylierung von Y822 unterstützt die Bindung von Vinkulin an β-catenin, aber nicht an Talin. Abgesehen von Interaktionen zwischen Zell-Zell- und Zell- Matrix-Kontakten (Tsai and Kam, 2009), spielt die Phosphorylierung von Y822 also in Integrin vermittelten fokalen Adhäsionen keine Rolle. Die Phosphorylierung von Vinkulin wird offensichtlich je nach Art der Adhäsion unterschiedlich reguliert (Bays et al., 2014). Auch im Zusammenhang mit Krankheitsbildern wurde die Vinkulin Phosphorylierung beschrieben. Bei der Infektion durch Helicobacter pylori, konnte die gestörte Wundheilung sowie der Ausbreitungsdefekt und die reduzierte Anzahl fokaler Adhäsionen in infizierten Zellen, auf eine CagA abhängige Dephosphorylierung des Vinkulin Proteins zurückgeführt werden (Moese et al., 2007). Um den Einfluss der Tyrosin Phosphorylierung im Hinblick auf die Aktivierung der autoinhibierten Konformation von Vinkulin zu untersuchen, wurden Präzipitationsexperimente mit isolierten Kopf- und Schwanzfragmenten durchgeführt. Sobald das Schwanzfragment phosphoryliert war, fand keine Bindung an das Kopffragment mehr statt. Dieses Ergebnis implizierte, dass die Phosphorylierung an Position 1065 die autoinhibitorische Kopf-Schwanz-Interaktion inhibiert (Zhang et al., 2004; Tolbert et al., 2014). Allerdings konnte für das intakte, phosphorylierte Vinkulin Protein keine Co-Sedimentation mit Aktinfilamenten nachgewiesen werden, was der Aktivierung durch Phosphorylierung 30

36 EINLEITUNG widerspricht, da die konformationelle Änderung nicht ausreichend ist, um die Aktinbindungsstellen im Vinkulin Molekül freizulegen (Zhang et al., 2004; Tolbert et al., 2014). Aufgrund dessen wurde vermutet, dass vielleicht das Zusammenspiel beider Phosphorylierungsstellen ausschlaggebend ist, indem die autoinhibierte Konformation geschwächt und zusätzlich die Bindungsaffinität der Schwanzdomäne erhöht wird. Zur weiteren Funktionsanalyse der Vinkulin Phosphorylierung wurde die Doppelmutation Y100/1065F eingeführt und es konnte beobachtet werden, dass wenn beide Tyrosine durch Phenylalanin ersetzt wurden und Vinkulin somit nicht mehr phosphorylierbar ist, das Ausbreitungsverhalten der Zellen dem von Vinkulin knock-out Zellen gleicht (Zhang et al., 2004). Die simulierte Phosphorylierung der Doppelmutante Y100/1065E beschleunigte hingegen die Ausbreitung. Darüber hinaus wurde eine fehlende Phosphorylierung in der Vinkulin Schwanzdomäne mit erhöhter Austauschdynamik von Vinkulin in frühen fokalen Adhäsionen, erschwerter Integration in Lipidmembranen und verminderter Kraftgeneration in Verbindung gebracht (Mohl et al., 2009; Diez et al., 2009; Wirth et al., 2010; Kupper et al., 2010; Huang et al., 2014; Huang et al., 2011). Diese Daten sprechen alle dafür, dass eine mangelnde Phosphorylierung zu einer Arretierung des Vinkulin Proteins in der inaktiven, geschlossenen Konformation führt und die Interaktionen mit Bindungspartnern im fokalen Kontakt erschwert. Des Weiteren wurden im Vinkulin Protein nicht nur phosphorylierte Tyrosine, sondern auch Phosphatgruppen an Serin- und Threonin-Resten nachgewiesen. In vitro Experimente ergaben, dass die Phosphorylierung an den Serinen 1033 und 1045 vermutlich durch die Proteinkinase C katalysiert wird (Ziegler et al., 2002; Aquino et al., 1988; Schwienbacher et al., 1996). Die Aktivität der PKC ist kalzium- und phospholipidabhängig und sie lokalisiert gemeinsam mit Vinkulin an der Plasmamembran (Takai et al., 1979; Werth et al., 1983; Haller et al., 1998). Computersimulationen der Moleküldynamik von Vinkulin zeigten, dass die Serin- Phosphorylierung zur Aktivierung der autoinhibierten Konformation beitragen könnte (Golji et al., 2012). Durch die Phosphorylierung von Y100 verschieben sich einige geladene Seitengruppen innerhalb der Kontaktregion zwischen D1 und Vt Domäne, wodurch diese intramolekulare Bindung gelockert wird. Der gleiche Effekt lässt sich durch die Phosphorylierung von S1033 hervorrufen. Diese Phosphorylierung (ps1033) reduzierte zudem die simulierten Zugkräfte an D1, die nötig waren um das Vinkulin Molekül zu aktivieren 31

37 EINLEITUNG (konformationelle Öffnung). Die Phosphorylierung einer der beiden anderen Positionen S1045 oder Y1065 induzierte ebenfalls eine konformationelle Änderung des Vinkulin Moleküls, beeinflusste allerdings nicht die autoinhibierende Interaktion zwischen Kopf- und Schwanzdomäne (Golji et al., 2012). Bereits zuvor konnte durch Stimulation der Proteinkinase C eine verstärkte Zell-Adhäsion und -Migration beobachtet werden (Vuori and Ruoslahti, 1993; Defilippi et al., 1997; Myat et al., 1997; Chun et al., 1996). PKC moduliert die Organisation der Aktinfilamente an der Membran und durch PKC Inhibitoren wird die Anzahl gebildeter fokaler Adhäsionen reduziert (Woods and Couchman, 1992; Jaken et al., 1989). Dennoch bleibt offen, ob Vinkulin in vivo durch die Proteinkinase C phosphoryliert wird und auf welche Weise die Serin- Phosphorylierung die Vinkulin Funktion beeinflusst. 3.4 Zielsetzung Adhärente Zellen stehen über fokale Adhäsionen mit der extrazellulären Matrix in Kontakt, eine Verbindung, die entscheidend ist für viele zelluläre Prozesse. Um verstehen zu können, wie Zellen ihre Umwelt wahrnehmen und auf die unterschiedlichen Reize reagieren können, ist es unerlässlich mehr über die Regulation und Funktionsweise der fokalen Adhäsionen, sowie den daran beteiligten Proteinen zu erfahren. Vinkulin spielt eine zentrale Rolle beim Auf- und Abbau von fokalen Komplexen. Es stabilisiert die Bindung der transmembranen Integrine über Talin an das Aktinzytoskelett der Zelle und ist somit entscheidend an der Kraftübertragung beteiligt. Obwohl seit Jahren intensiv an dem fokalen Adhäsionsprotein Vinkulin geforscht wird und viele Details über dessen Proteinstruktur und Interaktionspartner bekannt sind, ist nach wie vor unklar wie die Aktivierung des Moleküls und damit dessen Funktion genau reguliert wird. In dieser Arbeit soll der umstrittene Aktivierungsmechanismus der Phosphorylierung näher untersucht werden. Die Ergebnisse aus früheren Studien lassen vermuten, dass die Vinkulin Aktivierung beeinträchtigt ist, sobald keine Phosphorylierung stattfindet. Allerdings konnte bislang auch keine konformationelle Änderung des Moleküls durch eine bestehende Phosphorylierung nachgewiesen werden. Somit bleibt die Frage offen, ob die Phosphorylierung an Position 1065 und insbesondere an der noch seltener beschriebenen Position 100 in der Kopfdomäne, tatsächlich zur Aktivierung beiträgt. Um den Einfluss der Phosphorylierung auf die Funktion von Vinkulin näher zu untersuchen, wurde im Rahmen dieser Arbeit das Verhalten verschiedener Vinkulin Mutanten, in erster 32

38 EINLEITUNG Linie mit biophysikalischen Methoden, analysiert. Punktmutationen, die eine Phosphorylierung verhindern, bzw. eine dauerhafte Phosphorylierung simulieren, wurden mit konstitutiv geöffneten, bzw. geschlossenen Proteinkonformationen verglichen. Die kontraktilen Kräfte, der mit diesen Mutanten transfizierten Zellen, wurden durch die Traktionsmikroskopie und die Steifigkeit der Zellen, sowie die Bindungsstärke der fokalen Adhäsionen, mikrorheologisch mithilfe des Magnetic Tweezers bestimmt. Um zu analysieren, inwiefern sich die Phosphorylierung auf die Proteindynamik in den fokalen Adhäsionen auswirkt, wurden FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) Versuche durchgeführt und die konformationelle Aktivierung des Vinkulinmoleküls wurde zudem durch Co- Sedimentation mit Aktinfilamenten überprüft. Im Folgenden sollen auf Grundlage der unterschiedlichen Experimente mit diversen Vinkulin Mutanten neue Erkenntnisse bezüglich der Vinkulin Aktivierung durch Phosphorylierung und der damit einhergehenden Regulation der fokalen Adhäsionen sowie der zellulären Kraftübertragung gewonnen werden. 33

39 MATERIAL UND METHODEN 4 Material und Methoden 4.1 Zellkultur und genetisches Material Zellkultur Für die Untersuchung von Vinkulin wurde eine Wildtyp (WT) und eine Vinkulin knock-out (KO) Zelllinie muriner embryonaler Fibroblasten (MEF) verwendet (Abb. 13), welche im Labor von Dr. W. H. Ziegler (Universität Leipzig) isoliert und immortalisiert worden sind (Mierke et al., 2010). Zur Kultivierung der Vinkulin MEF Zellen (37 C, 5% CO2, 95% Luftfeuchtigkeit) wurde DMEM (Dulbecco s modified Eagle s medium) mit 1 g/l Glukose und dem Zusatz von 2 mm L- Glutamin und 10 % fötalem Kälberserum verwendet. Für die regelmäßige Passage wurden die Zellen mit 0,05 % Trypsin in 0,02 % EDTA abgelöst. A B Abbildung 13: Murine embryonale Fibroblasten (Wildtyp). A) Phasenkontrast-Aufnahme (Maßstab = 100 µm). B) Elektronenmikroskop-Aufnahme (Maßstab =20 µm). Zwei weitere Zelllinien muriner embryonaler Fibroblasten wurden für die Untersuchung der fokalen Adhäsionsproteine FAK und p130cas gebraucht. FAK WT und FAK KO Zellen wurden von ATCC bezogen (CRL-2645 bzw. CRL-2644) und CAS WT, bzw. CAS KO Zellen wurden von Dr. J. Brábek (Universität Prag) zur Verfügung gestellt. Diese Fibroblasten wurden auf dieselbe Weise kultiviert, mit dem Unterschied, dass die FAK und CAS Linien in DMEM mit hohem Glukosegehalt (4,5 g/l) und Antibiotika (1 % Penicillin/Streptomycin) gehalten wurden. Die Zellkultur wurde regelmäßig auf Mycoplasmen Kontamination mithilfe eines Mycoplasmen Kits überprüft. 34

40 MATERIAL UND METHODEN Für die Kryokonservierung wurden 10 6 Zellen in 1 ml Medium mit 10 % Dimethylsulfoxid in ein Kryoröhrchen aliquotiert und in einer Einfrierbox (Nalgene Cryo 1 C Mr. Frosty ) mit Isopropanol bei ca. 1 C/min bis -80 C eingefroren und anschließend im Stickstofftank gelagert. Zum Auftauen wurden die Röhrchen ins 37 C warme Wasserbad gestellt, die Zellsuspension zügig in 9 ml DMEM überführt, gemischt und abzentrifugiert (1000 rpm, 5 min). Das Pellet wurde in frischem Medium resuspendiert und in eine Zellkulturflasche überführt Agarose-Gelelektrophorese Mithilfe der Gelelektrophorese lassen sich DNA-Fragmente ihrer Länge nach auftrennen. Diese Methode wurde eingesetzt, um beispielsweise PCR-Produkte zu identifizieren (Mycoplasmen-Test), Restriktionsansätze zu kontrollieren oder einzelne DNA-Fragmente von anderen zu separieren. Zur Herstellung einprozentiger Agarosegele wurde 1% Agarosepulver in 1x TAE-Laufpuffer aufgekocht und die gelöste Agarose mit Ethidiumbromid (0,5 µg/ml) gemischt, bevor sie in die Gelkammer gegossen wurde. Das Ethidiumbromid interkaliert in die DNA-Stränge, sodass diese nach der elektrophoretischen Auftrennung unter UV-Licht sichtbar sind. Die DNA- Proben wurden mit Ladepuffer (10 µl Probe + 2 µl Loading Dye Blue 6x) versetzt, welcher die Dichte der Lösung erhöht, sodass die DNA in die Geltaschen absinkt. Außerdem enthält der Ladepuffer Farbstoffe, welche sich im elektrischen Feld mitbewegen, sodass abgeschätzt werden kann wie weit die Elektrophorese im Gel fortgeschritten ist. Das polymerisierte Gel wurde mit 1x TAE-Laufpuffer übergossen und die vorbereiteten DNA-Proben in die Taschen geladen. Die erste Geltasche wurde jeweils mit einem Marker beladen, welcher DNA- Fragmente definierter Größe enthält und somit als Größenstandard zur Auswertung nach erfolgter Elektrophorese dient. Nach dem Anlegen einer elektrischen Spannung wandern die DNA-Fragmente gemäß ihrer negativen Ladung in Richtung der Anode. Dabei wandern kleinere Fragmente durch den geringeren Widerstand im Gel schneller als größere. 35

41 MATERIAL UND METHODEN SDS-Gelelektrophorese Vorbereitung von Zelllysaten 10 7 Zellen wurden abgelöst, pelletiert (1000 rpm, 5 min), mit PBS gewaschen und erneut abzentrifugiert. Auf Eis wurde das Zellpellet in 250 µl RIPA-Puffer aufgenommen, 1 µl Proteinasen (Aprotinin, Pepstatin, Leupeptin) zugegeben, auf dem Vortexer gut gemischt und 5 min inkubiert. Die sonifizierte Probe wurde bei rpm für 15 min zentrifugiert und der Überstand bis zum Auftragen auf das Gel bei -20 C eingefroren. Proteinbestimmung nach Bradford Die Bradford-Reaktion ist eine schnelle Methode, um die Proteinkonzentration einer Lösung zu messen. Durch die Bindung von Coomassie R-250 an die Proteine verschiebt sich das Absorptionsmaximum der Lösung von 465 nm auf 595 nm. Der Bio-Rad Protein Assay wurde hierfür 1:5 mit dh2o gemischt und verschiedene Verdünnungen (0,1 1,0 mg/ml) des Bio-Rad Protein Standards (2 mg/ml BSA in dh2o) hergestellt. Sowohl von der Proteinprobe als auch vom BSA-Standard wurden je 10 µl mit 1 ml des Bradford-Reagenz in eine Küvette pipettiert. Nach 15 min bei RT wurde die Absorption im Photometer bei 595 nm gemessen. Aus den verdünnten Albumin-Standard-Messungen wurde eine Eichgerade erstellt und damit die Proteinkonzentration in der Probe ermittelt. SDS-PAGE Bei der diskontinuierlichen SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese) werden Proteine unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt. Zunächst wurden die dafür benötigten Polyacrylamidgele in der entsprechenden Apparatur zwischen zwei Glasplatten gegossen. Sobald das dichtere Trenngel (beschichtet mit Isopropanol) auspolymerisiert ist, kann das lockerere Sammelgel darauf gegossen und die Kämme für die Beladungstaschen eingesetzt werden. Das Sammelgel sorgt durch seinen niedrigeren ph-wert (entspricht dem Probenpuffer) und den größeren Poren für ein schnelles Eindringen der Proteine und dem Sammeln beim Übergang zum Trenngel, sodass alle Proben gleichzeitig mit der Auftrennung beginnen. Die Porengröße der Gele ist abhängig von der Acrylamid/Bis- Acrylamid-Konzentration. Für die zu untersuchenden Proteine eignete sich in den meisten Fällen ein 10%iges Trenngel. 36

42 MATERIAL UND METHODEN Trenngel (10%, 20 ml): 8 ml H2O 6,6 ml Acrylamid/Bis-Acrylamid (29/1) 5 ml 1,5M Tris (ph=8,8) 200 µl 10% SDS-Lösung 200 µl 10% APS 20 µl TEMED Sammelgel (5%, 10 ml): 7 ml H2O 1640 µl Acrylamid/Bis-Acrylamid (29/1) 1240 µl 1M Tris (ph=6,8) 100 µl 10% SDS-Lösung 100 µl 10% APS 15 µl TEMED Die auspolymerisierten Gele wurden aus der Halterung entnommen (Taschen nach dem Entfernen der Kämme mit Wasser auswaschen) und in die Elektrophorese-Apparatur eingesetzt, die mit 1x SDS-Laufpuffer (25 mm Tris, 0,25 M Glycin, 0,1% SDS) aufgefüllt wurde. Die Proben wurden 1:1 mit Auftragspuffer (250 mm Tris-HCl (ph=6,8), 6% SDS, 40% Glycerin, 200 mm DTT, 0,02% Bromphenolblau) gemischt und 5 min bei 95 denaturiert. Das β-mercaptoethanol im Puffer dient dabei zum zusätzlichen Lösen der Disulfidbrücken- Bindungen. Das SDS im Auftragspuffer bindet an die Proteine und überdeckt somit deren Eigenladung, was notwendig ist, damit die Laufgeschwindigkeit im Gel ausschließlich von der Molekülgröße abhängt und nicht durch Ladungen modifiziert wird. Die Gesamtladung ist somit negativ und die Proteine wandern im elektrischen Feld in Richtung der Anode. Die Größe der elektrophoretisch aufgetrennten Proteine konnte durch Einsatz eines kommerziellen Proteinstandards (Prestained Protein Marker von NEB) mit Peptiden zwischen 7 und 175 kda identifiziert werden. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte bei 150 V für ca. 1,5 Stunden. Im Anschluss wurde das Sammelgel abgetrennt, das Trenngel 3x in H2O gewaschen und in Coomassie-Lösung gefärbt. Coomassie Färbung Als Coomassie bezeichnet man einen Triphenylmethanfarbstoff, der sich an die basischen Seitenketten der Aminosäuren anlagert und dadurch unspezifisch Proteine färbt. Um die Banden nach der SDS-PAGE sichtbar zu machen, wurden die Gele in eine Coomassie Färbelösung eingelegt (70 mg/l Coomassie Brilliant Blau G-250 in bidest. Wasser, 35 mm Salzsäure) und ca. 10 s in der Mikrowelle erhitzt (ohne zu kochen). Nach min leichtem Schwenken waren die Proteinbanden gut sichtbar und die Hintergrundfärbung konnte durch Auswaschen in zweifach destilliertem Wasser noch reduziert werden. 37

43 MATERIAL UND METHODEN Western Blot Um die aufgetrennten Proteine mit Antikörpern detektieren zu können, wurden sie durch eine weitere Elektrophorese auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Dabei wurde ein elektrisches Feld senkrecht zum PAA-Gel angelegt, sodass die Proteinbanden in Richtung der Anode wandern und mit der negativ geladenen Membran wechselwirken. Für den Western Blot kam sowohl eine Semi-Dry-Apparatur als auch ein Wet-Blot zum Einsatz, wobei sich gezeigt hat, dass die Handhabung und das Übertragungsergebnis des Wet-Blots vorzuziehen ist. Die Nitrozellulosemembran wurde zuerst 2 min in Methanol aktiviert, dann in H2O gewaschen und in Transferpuffer (25 mm Tris, 1,92 mm Glycerin, 20% Methanol) eingelegt. Das Gel aus der SDS-PAGE und das verwendete Whatman-Papier wurden ebenfalls in Transferpuffer eingelegt. Die Komponenten des Wet-Blots wurden wie in Abbildung 14 gezeigt zusammengefügt. aufgetrennte Proteinfraktionen Lauffront Kathode (+) Anode ( ) Transferaufbau eingespannt zwischen Halterplatten Transferpuffer PAA-Gel Nitrozellulosemembran Filterpapier Abstandshalter Einspannhalterung Abbildung 14: Aufbau eines Western Blots. Die Komponenten Filterpapier, Gel, Membran, Filterpapier werden luftblasenfrei aufeinandergeschichtet, in eine Halterung und schließlich in die Apparatur eingesetzt, die mit Transferpuffer aufgefüllt wird. Durch die angelegte Spannung werden die aufgetrennten Proteine aus dem Gel in Richtung der Anode auf die Nitrozellulosemembran übertragen (Adaptiert nach Dabei ist zu beachten, dass die Membran luftblasenfrei auf dem PAA-Gel aufliegt. Der Transfer fand bei 100 V für 90 min in der Kammer (+ Kühlblock und Rührfisch) mit Transferpuffer statt. Nach beendeter Elektrophorese wurden alle Teile aus der Blot-Kammer ausgebaut, die Membran 3x in dh2o gewaschen und mit Ponceau S Lösung (0,2% Ponceau S, 3% Trichloressigsäure, 30% 5-Sulfosalicylsäure) gefärbt. Da Ponceau S reversibel Proteine anfärbt, konnte dadurch der vollständige Transfer auf die Membran überprüft und der Azofarbstoff hinterher wieder in Wasser ausgewaschen werden. 38

44 MATERIAL UND METHODEN Für die Immundetektion der Proteine mit monoklonalen Antikörpern mussten zunächst die unspezifischen Bindungsstellen abgesättigt werden. Hierfür wurde die Membran für 1 h mit 5% Milchpulver in TBST (20 mm Tris (ph=7,5), 500 mm NaCl, 0,05% Tween20) geschwenkt. Der Vinkulin Antikörper (VIN-11-5) wurde 1:1000 in Milchlösung angesetzt und die Membran darin über Nacht im Kühlschrank (spezifischere Bindung bei niedrigeren Temperaturen) inkubiert. Überschüssige Primärantikörper wurden am nächsten Tag durch drei Waschschritte (je 15 min) mit TBST auf dem Schüttler entfernt und der Sekundärantikörper (Anti-mouse IgG (H+L)-Peroxidase; 1:20.000) ebenfalls in Milch für 30 min bei RT zugegeben. Der sekundäre Antikörper, der an das Reporterenzym HRP (Meerrettichperoxidase) gebunden ist, erkennt die Fc-Region des Primärantikörpers und bildet ein Immunkonjungat (vgl. Abb. 15). Nach der Antikörper-Bindung wurde erneut gewaschen und schließlich das Entwicklungsreagenz ECL auf die Membran gegeben. Der Nachweis der Antikörper-markierten Proteine erfolgte durch S HRP P Substratreaktion mit Photonen Emission sek. AK prim. AK Zielprotein Abbildung 15: Chemilumineszenzreaktion eines HRP-konjungierten Antikörpers. Chemilumineszenzdetektion. Die an den sekundären Antikörper gekoppelte Peroxidase HRP katalysiert die Oxidation von Luminol in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid und bei dieser chemischen Reaktion wird Licht emittiert. Die emittierten Photonen wurden entweder durch einen aufgelegten Röntgenfilm detektiert und in der Dunkelkammer mit der Entwicklermaschine entwickelt oder digital aufgenommen Vinkulin cdna und Mutagenese Plasmid-DNA Der eukaryotische Expressionsvektor pcdna3.1 (siehe Anhang), welcher die cdna des murinen Vinkulin Proteins enthält, wurde von Dr. Diez (an unserem Lehrstuhl) hergestellt. Dafür wurde der Vektor pcdna 3.1 Hygro/(+) (Invitrogen) mit einer egfp-kassette (enhanced green fluorescent protein) aus einem pegfp-aktin-vektor (BD Bioscience) kombiniert und die Vinkulin cdna einkloniert (Diez et al., 2011). Auch die Punktmutation A50I wurde basierend auf diesem Plasmid von Dr. Diez eingeführt. Die Vinkulin Konstrukte T12 und ex20 wurden von Dr. Ziegler von der Universität Leipzig zur Verfügung gestellt. Alle verwendeten Vinkulin Mutanten sind somit egfp-fusionsproteine. Das heißt, die DNA-Sequenz für Vinkulin wird gemeinsam mit einer Sequenz transkribiert, die ursprünglich aus der Qualle Aequorea victoria 39

45 MATERIAL UND METHODEN stammt und für ein grün fluoreszierendes Protein codiert. Folglich entsteht bei der Expression ein Fusionsprodukt aus den beiden aneinander gebundenen Proteinen. Diese Fluoreszenzmarkierung ermöglicht die Lokalisation, Verfolgung und gezielte Untersuchung einzelner Proteine in lebenden Zellen. DNA Amplifikation Um die DNA Vektoren zu amplifizieren, wurden sie in chemisch kompetente Escherichia coli (E. coli) Bakterien des Stammes DH5α transformiert. Dafür wurden 50 µl der E. coli Suspension zusammen mit 1 µl der Plasmid DNA für 30 min auf Eis gehalten und nach einem zweiminütigen Hitzeschock bei 42 C weitere 3 min auf Eis gestellt, bevor 500 µl eines 37 C warmen SOC-Mediums (Super Optimal Broth Medium mit 2 mm Glukose) dazu gegeben wurden. Der Ansatz wurde bei 37 C und 350 rpm für eine Stunde inkubiert und anschließend bei 1500 rpm abzentrifugiert. Die Hälfte des Überstands wurde verworfen, das Pellet in der verbleibenden Flüssigkeit resuspendiert und die Bakterien auf einer Agarplatte (Ø 10 cm) ausplattiert. Der Agar war im Voraus angesetzt (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl, 15 g/l Agar-Agar, ph=7,0), autoklaviert und für ein selektives Wachstum der transformierten Bakterien entsprechend der jeweiligen Vektor-Resistenz 1:1000 mit Antibiotikum (Ampicillin 100 µg/ml; Kanamycin 30 µg/ml) versetzt worden. Nach dem Gießen der Agarplatten müssen diese vollständig abgekühlt sein, bevor die Bakterien darauf ausgesät werden können. Nachdem die Platten bei 37 C über Nacht inkubiert worden sind, wurden für eine Maxipräparation (präparativer Maßstab) ml LB-Medium (lysogeny broth medium; 10 g/l Trypton + 5 g/l Hefeextrakt + 10 g/l NaCl), bzw. 8 ml für eine Minipräparation (analytischer Maßstab), mit je einer der gewachsenen Bakterienkolonien angeimpft und in einem Bakterienkolben bei 37 C und 150 rpm über Nacht geschüttelt. Die Bakterienkultur wurde abzentrifugiert und die Plasmid-DNA aus dem Pellet entsprechend der Herstelleranleitung mit dem NucleoBond Kit für die Maxipräparation und mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit für die Minipräparation isoliert und aufgereinigt. Die gefällte DNA wurde im letzten Schritt der Aufreinigung in sterilem, zweifach destilliertem Wasser gelöst und bei -20 C gelagert. DNA Konzentrationsbestimmung Die Reinheit und die Konzentration der extrahierten DNA-Lösung wurden aufgrund ihrer Extinktion im Photometer bestimmt. Eine optische Dichte von 1 bei 260 nm entspricht dabei 40

46 MATERIAL UND METHODEN 50 µg/ml doppelsträngiger DNA. Aus dem Verhältnis OD260/OD280 lässt sich auf mögliche Kontaminationen mit RNA oder Proteinen schließen. Angestrebt wurde ein Verhältnis von 1,8, welches eine reine DNA-Lösung anzeigt, während höhere Werte für RNA in der Lösung und deutlich niedrigere Werte für eine Verunreinigung mit Proteinen sprechen (das Absorptionsmaximum der aromatischen Aminosäurereste liegt bei 280 nm). Gezielte Mutagenese Um die Auswirkungen der Phosphorylierung an einzelnen Aminosäuren des Vinkulin Proteins zu untersuchen, wurden gezielt Punktmutationen eingeführt. Die Tyrosine (aromatisch, polar, neutral) an Position 100 bzw wurden entweder durch Phenylalanin (aromatisch, unpolar, neutral) oder durch Glutaminsäure (aliphatisch, polar, sauer) ersetzt. Die Aminosäure Serin (aliphatisch, polar, neutral) an Position 1033 wurde zu Alanin (aliphatisch, unpolar, neutral) oder Asparaginsäure (aliphatisch, polar, sauer) mutiert (Abb. 16). Abbildung 16: Austausch der phosphorylierbaren Aminosäuren Tyrosin und Serin. Gezeigt sind die Molekülstrukturen der gezielt ausgetauschten proteinogenen Aminosäuren in der Vinkulinsequenz. Um eine Phosphorylierung zu verhindern, wurde Tyrosin zu Phenylalanin bzw. Serin zu Adenin mutiert. Eine konstitutive Phosphorylierung wurde durch die Mutation von Tyrosin zu Glutaminsäure, bzw. von Serin zu Asparaginsäure simuliert. a) Primer-Design Um einzelne Aminosäuren der Vinkulin cdna zu mutieren, wurden passende Primer für eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) entworfen und von der MWG-Biotech AG synthetisiert. Diese Oligonukleotide wurden so ausgewählt, dass sie zwischen 25 und 45 Basenpaaren lang sind und dem Sequenzbereich entsprechen, in dem die zu mutierende Aminosäure liegt. Diese Aminosäure wurde in der Primersequenz bereits durch das neue Codon der gewünschten Punktmutation ersetzt. Um die Mutation zu erleichtern, wurde die größtmögliche Übereinstimmung der beiden Codons von ursprünglicher und neu einzufügender Aminosäure gewählt, sodass möglichst wenige Fehlpaarungen des Doppelstranges auftreten (siehe 8.2 und 41

47 MATERIAL UND METHODEN Tabelle 1). Die veränderte Codonsequenz (mismatch) sollte zudem in der Mitte des Primers, mit mindestens 10 bp Abstand zu den Enden, liegen und es durfte keine Verschiebung des Leserasters eingeführt werden. Für ein optimales Reaktionsergebnis wurde darauf geachtet, dass am 3 -Ende der Primer ein bis drei Guanine oder Cytosine sitzen und es nicht komplementär zum 5 -Ende ist. Außerdem sollten die beiden Primer die gleiche Schmelztemperatur (> 60 C) und einen GC-Gehalt von 40-60% aufweisen. Die Schmelztemperatur TM, bei der 50% der Basen getrennt vorliegen, berechnet sich wie folgt: n= Anzahl des Nukleotides G bzw. C s= Anzahl aller Nukleotide TM[ C] = 69,3 + 41(n G + n C ) s ( 650 s ) Tabelle 1: Mutationsprimer (MWG Biotech AG) Primer Name Hybridisierungsregion Primer Sequenz forward E28R Vcl bp TGGTGATTATGCACAGGAGGGGCGAGGTGGACGGCAAAG reverse E28R Vcl bp CTTTGCCGTCCACCTCGCCCCTCCTGTGCATAATCACCA forward E29R Vcl bp TGGTGATTATGCACGAGAGGGGCGAGGTGGACGGCAAAG reverse E29R Vcl bp CTTTGCCGTCCACCTCGCCCCTCTCGTGCATAATCACCA forward E31R Vcl bp TGGTGATTATGCACAGGAGGGGCAGGGTGGACGGCAAAG reverse E31R Vcl bp CTTTGCCGTCCACCCTGCCCCTCCTGTGCATAATCACCA forward Y100F Vcl bp CCCAGATGCTTCAGTCAGACCCATTCTCGGTTCCTGCGC reverse Y100F Vcl bp GCGCAGGAACCGAGAATGGGTCTGACTGAAGCATCTGGG forward Y100E Vcl bp CCAGATGCTTCAGTCAGACCCAGAGTCGGTTCCTGCGCG reverse Y100E Vcl bp CGCGCAGGAACCGACTCTGGGTCTGACTGAAGCATCTGG forward S1033D Vcl bp GCCCAGAACCTCATGCAGGATGTGAAGGAGACTGTGCG reverse S1033D Vcl bp CGCACAGTCTCCTTCACATCCTGCATGAGGTTCTGGGC forward S1033A Vcl bp GCCCAGAACCTCATGCAGGCTGTGAAGGAGACTGTGCG reverse S1033A Vcl bp CGCACAGTCTCCTTCACAGCCTGCATGAGGTTCTGGGC 42

48 MATERIAL UND METHODEN b) Polymerase-Kettenreaktion Durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) lassen sich DNA Fragmente und Plasmide in kurzer Zeit in vitro vervielfältigen, sowie einzelne Punktmutationen, Deletionen oder kurze Insertionen einführen. Für die Mutagenese wurden zwei Ansätze mit je nur einem der beiden komplementären Primer hergestellt. Der codierende und der nicht-codierende DNA Strang wurden jeweils mit dem forward bzw. dem reverse Primer repliziert, so dass eine effiziente Einführung der Mutation gewährleistet war (Abb. 18). Für jeden der beiden Reaktionsansätze wurden 50 ng des zu mutierenden Ausgangsplasmids zusammen mit 1 µl des jeweiligen Primers (= 10 pmol), 2 µl Desoxy-Nukleotide (10 mm dntp-mix) und 0,5 µl (1U) der Polymerase Phusion mit 10 ml des dazugehörigen Polymerase-Puffers HF eingesetzt. Die thermostabile Phusion High-Fidelity DNA Polymerase besitzt eine 5 3 Polymeraseaktivität, eine 3 5 Exonukleaseaktivität, generiert Blunt-Ends und produziert mit ihrer Korrekturlesefunktion eine 50-fach niedrigere Fehlerquote als die herkömmliche Taq-Polymerase. Für den Einbau der Mutationsprimer in der PCR wurden die Zykluszeiten folgendermaßen gewählt: Initialisierung: 95 C 30 s Die Wasserstoffbrückenbindungen werden aufgebrochen und sowohl die Ausgangs- DNA als auch die Primer liegen als Einzelstränge vor. Denaturierung: 95 C 30 s Die DNA-Doppelstränge werden aufgetrennt. Hybridisierung: 55 C 60 s Optimale Temperatur für die spezifische Anlagerung der Primer an die Matrizen-DNA. Elongation: 72 C 4 min, 50 s Die DNA-Polymerase verwendet die freien dntps, um ausgehend von dem Primer die komplementären DNA-Stränge zu synthetisieren. Der Zyklus von Denaturierung bis Elongation wurde 6x wiederholt. Je 25 µl aus dem Ansatz mit dem forward Primer und aus dem Ansatz mit dem reverse Primer wurden zusammen mit 0,5 µl Phusion in ein neues PCR-Reaktionsgefäß überführt und das komplette Plasmid im Thermocycler während 28 Zyklen repliziert. Abschließend wurde die Reaktion noch für 7 min bei 72 C gehalten (finale Elongation). 43

49 MATERIAL UND METHODEN Um das Ausgangsplasmid aus dem Reaktionsansatz zu entfernen, wurden 3 µl des Restriktionsenzyms DpnI zum Ansatz gegeben und die DNA für zwei Stunden bei 37 C verdaut. CH 3 5 GA TC 3 3 CT AG 5 CH 3 Abbildung 17: Erkennungssequenz und Schnittstelle der Restriktionsendonuklease DpnI DpnI schneidet die Erkennungssequenz GATC, allerdings nur wenn Adenin methyliert ist (vgl. Abb. 17). Diese methylierte DNA liegt nur vor, wenn das Plasmid in einem Bakterienstamm mit dam-methylase, wie z. B. dem hier verwendeten E.coli Dh5α, repliziert wurde. Somit baut die Enzymreaktion mit DpnI nur das Ausgangsplasmid ab, während das in der PCR synthetisierte, mutierte Plasmid erhalten bleibt. Danach können kompetente Zellen direkt mit fünf Mikrolitern aus dem Reaktionsansatz transformiert werden. ATG TAC ATG Denaturierung TAC CH 3 CH 3 Primer Hybridisierung CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 TAC AAG TTC ATG CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 TAC ATG PCR TTC AAG CH 3 CH 3 CH 3 DpnI Verdau TTC AAG TAC ATG CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 Transformation CH 3 Abbildung 18: Schematischer Überblick über die Schritte der gezielten Mutagenese. Die doppelsträngigen DNA-Plasmide werden denaturiert zu Einzelsträngen. Bei der spezifischen Hybridisierungstemperatur lagern sich die Mutationsprimer an und durch mehrere PCR-Zyklen werden die DNA- Stränge repliziert und die neue Aminosäure (Grün) eingebaut. Die alten, methylierten DNA-Matrizen werden mit dem Restriktionsenzym DpnI verdaut. Die unverdauten, neuen DNA-Plasmide mit der Punktmutation können in kompetente Bakterien transformiert werden. Von den transformierten Bakterienklonen wurde per Mini-Präparation DNA isoliert und aufgereinigt. Um die Mutation zu überprüfen, wurden je 20 µl der Plasmid-DNA (80 ng/µl) an GATC Biotech geschickt und mit den dort synthetisierten Primern sequenziert. Erfolgreich mutierte DNA-Plasmide mit korrekter Sequenz wurden erneut amplifiziert und im präparativen Maßstab für die Transfektion aufgereinigt. 44

50 MATERIAL UND METHODEN Tabelle 2: Primer für die Sequenzierung (GATC Biotech) Primer Name Hybridisierungsregion Primer Sequenz Primer 1 MCS bp AGAAGCGCGATCACATG Primer 2 Vcl bp AGCTGCTTCCTGTTCTC Primer 3 Vcl bp TTTGGCTGAAGCTCGGAAG Primer 4 Vcl bp AAACCATTCAGGAAGGC Primer 5 Vcl bp AACAGCTACGACTAACTG Transiente Transfektion Für die transiente Expression der Plasmid-DNA wurde diese durch eine Transfektionsmethode, basierend auf kationischen Lipiden, in die eukaryotischen Zellen eingeschleust. Bei der Lipofektion bilden die Lipide im wässrigen Milieu Mizellen (kleine Lipidmonolayer) oder Liposomen (größere Lipidbilayer), welche zusammen mit der DNA Lipoplexe formieren. Bei dieser Komplexbildung darf allerdings kein Serum anwesend sein. Die Lipoplexe werden durch Endozytose von den Zellen aufgenommen. Beim Zerfall des Endosoms penetriert die DNA ins Zytoplasma. Dabei sind gut proliferierende Zellen mit einer Konfluenz von ca. 80% von Vorteil. Am Tag vor der Transfektion wurden 1, Zellen in einer 3,5 cm Kulturschale ausgesät. In je 250 µl FCS freiem DMEM wurden 2 µg Plasmid-DNA, bzw. 10 µl des Transfektionsreagenz Lipofectamin 2000, für 5 min bei RT inkubiert, der Lipid-Ansatz in den DNA-Ansatz überführt und für weitere 20 min inkubiert. Das Medium in der Zellschale wurde durch 2 ml FCS freies DMEM ersetzt, bevor der Transfektionsansatz auf die Zellen pipettiert wurde. Nach 4 h im Inkubator wurde das Medium erneut gegen Vollmedium ausgetauscht. Am Tag nach der Transfektion wurden die Zellen abgelöst und für die jeweiligen Versuche auf neuen Zellkulturschalen, beschichteten Deckgläsern oder PAA-Gelen ausgesät. Da es bei den so behandelten MEFs sowohl zu schwankenden Transfektionseffizienzen, als auch zu unterschiedlichen Mengen an exprimiertem Vinkulin kommen kann, wurden die Zellen in allen durchgeführten Versuchen einzeln ausgewählt, ihre Fluoreszenz optisch kontrolliert und auf ein mittleres Expressionslevel geachtet. 45

51 MATERIAL UND METHODEN 4.2 Immunfluoreszenz Um neben den in die Zelle transfizierten GFP-Fusionsproteinen weitere native Proteine sichtbar zu machen, wurde eine Antikörperfärbung durchgeführt. Die an die spezifischen Proteine bindenden monoklonalen Antikörper wurden wiederum von sekundären Antikörpern erkannt, welche an ein Fluorochrom gekoppelt und somit im Fluoreszenzmikroskop sichtbar sind. Um das Aktinzytoskelett der Zelle zu markieren, wurden keine Antikörper, sondern an Fluoreszenzfarbstoffe gebundenes Phalloidin eingesetzt. Bei Phalloidin handelt es sich um ein Toxin aus dem grünen Knollenblätterpilz, das irreversibel an Aktinfilamente bindet. Für die Immunfluoreszenz wurden Deckgläser vorbereitet, die mit 10 µg/ml Fibronektin beschichtet und mit dh2o gewaschen wurden. In einer 6-Wellplatte wurden die Zellen auf den Gläsern ausgesät und über Nacht inkubiert, sodass sie gut adhäriert waren. Als Nächstes wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und 20 min in 4% Paraformaldehyd (in PBS) fixiert. Nach dreimaligem Waschen in PBS wurden die Zellmembranen mit 0,2% Triton X (in PBS) genau 5 min permeabilisiert und anschließend wieder dreimal gewaschen. Mit 0,5% BSA in PBS wurden bei 37 C für 1 Stunde alle unspezifischen Bindungsstellen blockiert und im Anschluss der primäre Antikörper in der jeweiligen Verdünnung zugegeben. Um den Antikörperverbrauch zu minimieren, wurden 70 µl Tropfen der AK-Lösung in 0,5% BSA auf einen Parafilm pipettiert und die Deckgläser mit den Zellen darauf gelegt. Die AK-Bindung erfolgt über Nacht bei 4 C in einer befeuchteten Kammer, um das Austrocknen zu verhindern. Die Zellen wurden am Folgetag dreimal für 5 min in BSA-Lösung gewaschen, bevor der sekundäre Antikörper, gemischt mit Phalloidin-TRITC, auf dieselbe Weise aufgebracht und für 1 h bei 37 C inkubiert wurde. Überschüssige Antikörper wurden mit BSA-Lösung abgewaschen. Die Deckgläser wurden zuletzt kurz in Millipore Wasser getaucht, um Salze zu entfernen und schließlich mit einem Tropfen Eindeckmedium auf Objektträger aufgebracht. Die fest gewordenen Proben wurden mit Nagellack luftdicht verschlossen und im Dunkeln gelagert, um ein Ausbleichen der Fluoreszenz zu vermeiden. 4.3 In vitro Proteinbindung Um die Interaktionen einzelner Proteine in einer definierten Umgebung außerhalb der Zelle (in vitro) untersuchen zu können, wurden DNA-Vektoren in Bakterienzellen eingeschleust, die 46

52 MATERIAL UND METHODEN entsprechenden Proteine überexprimiert und anschließend aus den Zellen extrahiert und aufgereinigt. Die aufgereinigten Vinkulin Mutanten wurden für Bindungsstudien mit Aktinfilamenten eingesetzt Expression rekombinanter Proteine in Bakterien Klonierung der Vinkulin cdna in den Bluescript Vektor Zunächst mussten die codierenden DNA-Sequenzen (Vinkulin cdna mit entsprechenden Punktmutationen) in einen passenden Vektor kloniert werden, der die Überexpression des Proteins in Bakterien ermöglicht. Hierfür wurden der Vektor pbluescript II SK(-) (pbssk) in dem Bakterienstamm XL1 blue (Ampicillin-Resistenz) und der Vektor pet-28a(+) (pet) in E.coli TOP10 (Kanamycin-Resistenz) amplifiziert und mit einer Maxi-Präparation isoliert. Der Bluescript Vektor (high-copy) diente als Übergangsplasmid, um den korrekten Restriktionsverdau und die Ligation der Vinkulin cdna durch Sequenzierung überprüfen zu können. Eine Übersicht über die einzelnen Schritte der Umklonierung zeigt Abbildung 22. a) Einführung von Schnittstellen durch PCR Da für diese Vektoren keine geeigneten Schnittstellen in der Ausgangssequenz des Vinkulin tragenden Vektors vorhanden waren, wurden mithilfe einer PCR eine NotI und eine NdeI Schnittstelle (Abb. 19) am 5 -Ende und eine weitere NotI-Schnittstelle am 3 -Ende eingeführt. Die Reaktionsbedingungen für diese PCR waren wie folgt: PCR-Ansatz (50 µl): PCR-Zyklus: 50 ng DNA 2 min 94 C 1 µl dntps (10 mm) 30 s 94 C 5 µl 5x Puffer Phusion HF 30 s 59 C 30x 0,5 µl forward Primer (25 µm) 1 min 72 C 0,5 µl reverse Primer (25 µm) 10 min 72 C 1 µl Polymerase Phusion 10 C PCR-grade H2O 47

53 MATERIAL UND METHODEN Tabelle 3: Primer zur Einführung von Schnittstellen (Invitrogen) Primer Name vinculin fwd mit NotI / NdeI vinculin WT rev mit NotI vinculin Y100/1065F rev mit NotI vinculin Y100/1065E rev mit NotI Primer Sequenz ATTATTGCGGCCGCCATATGCCAGTGTTTCATACGCGTACG TAATAACGCGGCCGCCTACTGGTACCAGGGAGTCTTTCTGACCC TAATAACGCGGCCGCCTACTGGAACCAGGGAGTCTTTCTGACCC TAATAACGCGGCCGCCTACTGCTCCCAGGGAGTCTTTCTGACCC Im Anschluss an die PCR wurden die DNA-Produkte mithilfe des PCR Clean-Up Kits gereinigt, um störende Faktoren (z. B. Salze, Enzyme, Nukleotide) für weitere Enzymreaktionen zu entfernen. Der PCR-Ansatz wurde mit Puffer NT auf 100 µl aufgefüllt und auf die Säule aufgetragen. Nach dem Zentrifugieren (1 min, rpm) wurde mit 700 µl Puffer NT3 gewaschen, wieder zentrifugiert und die saubere DNA mit 40 µl Puffer NE eluiert. b) Restriktionsverdau Mithilfe von Restriktionsendonukleasen können DNA-Doppelstränge an spezifischen Stellen geschnitten werden. Dadurch können Plasmide geöffnet, linearisiert oder Fragmente ausgeschnitten werden. Die einzelnen DNA-Stücke können anschließend in einer Gelelektrophorese analysiert oder durch Ligation zusammengefügt werden. Zu diesem Zweck wurden TypII Restriktionsenzyme verwendet, welche eine bestimmte Basensequenz erkennen und den Doppelstrang innerhalb dieser Zielsequenz hydrolysieren. Die hier eingesetzten Enzyme erkennen palindromische Sequenzen und erzeugen sticky ends, da die hybridisierenden Einzelstrang-Überhänge leichter ligierbar sind. NotI 5 GCGGCCGC 3 3 CGCCGGCG 5 NdeI 5 GATATG 3 3 GTATAC 5 Abbildung 19: Erkennungssequenzen und Schnittstellen der Restriktionsendonukleasen NotI und NdeI. Für den Restriktionsverdau wurden die Ansätze jeweils in folgendem Verhältnis gemischt: ca. 1 µg DNA in einem Gesamtvolumen von 20 µl 20 U Enzym pro µg DNA 1/10 des Gesamtvolumens aus dem zum Enzym gehörenden Puffer (CutSmart) Der mit PCR-grade Wasser aufgefüllte Ansatz wurde für eine Stunde bei 37 C und 300 rpm inkubiert. 48

54 MATERIAL UND METHODEN Bei einem Doppelverdau wird die DNA gleichzeitig mit zwei verschiedenen Restriktionsenzymen geschnitten. Dabei ist zu beachten, dass beide Endonukleasen unter den gleichen Bedingungen optimale Enzymaktivität aufweisen, d. h. im gleichen Puffer eingesetzt werden können. Als erster Schritt wurde die Vinkulin cdna übergangsweise in das high-copy Plasmid pbssk kloniert, um die korrekte Einführung der Schnittstellen durch die PCR und die Vinkulinsequenz durch Sequenzierung zu überprüfen. Dafür wurde die DNA aus der PCR mit NotI verdaut und der Vektor pbssk mit demselben Enzym linearisiert. Die DNA-Fragmente wurden durch Gelelektrophorese überprüft. Um zu vermeiden, dass der geschnittene Vektor religiert bevor das neue Insert eingefügt wurde, mussten die terminalen 5 -Phosphatgruppen abgespalten werden. Zu diesem Zweck wurde der Vektor mit einer alkalischen Phosphatase (Antarctic Phosphatase) behandelt, welche die Dephosphorylierung der DNA katalysiert. Der Restriktionsansatz (pbssk + NotI) konnte dafür einfach mit 1/10 des Volumens an Phosphatase-Puffer und 1 µl Antarctic Phosphatase (5000 U/ml) gemischt und 15 min bei 37 C inkubiert werden. Um das Enzym nach der Reaktion zu inaktivieren, wurde das Gemisch abschließend für 5 min auf 65 C erhitzt. c) Gelextraktion Durch eine Gelextraktion wurde der linearisierte Vektor von unverdauten oder religierten Vektor-Überresten, und das PCR-Produkt von Template-Überresten und den abgeschnittenen Sequenzenden, getrennt und von Salzen und Enzymen gereinigt. Für diese Gele wurde Ultra Pure Agarose verwendet, die Geltaschen für die große Probenmenge verbreitert und die DNA bei einer Spannung von 70 V aufgetrennt. Unter UV-Licht wurden die gewünschten Banden zügig mit einem sauberen Skalpell ausgeschnitten, in frische Reaktionsgefäße überführt und gewogen (Abb. 20). 49

55 MATERIAL UND METHODEN A B Marker pbssk (verdaut) C Marker pbssk (verdaut) 3 kb Abbildung 20: Agarosegele bei der Gelextraktion. A) 1 kb DNA Ladder von Biolabs als Größen- und Mengenmarker. B) Agarosegel nach der elektrophoretischen Auftrennung des mit NotI verdauten pbssk Vektors (dicke Bande bei 3 kb). Unverdaute Überreste aus dem Restriktionsansatz sind als feine Bande weiter oben im Gel zu erkennen. C) Agarosegel nach dem Ausschneiden der relevanten Bande des linearisierten Vektors. Die Extraktion der DNA aus der Agarose erfolgte mit einem Gelextraktions-Kit von Qiagen. Die Gelstücke wurden in dem Puffer QG (VGC in µl = 3x Masse des Gelstücks in mg) unter vortexen bei 50 C gelöst, anschließend mit Isopropanol (VIsoprop = 1/3 VGC) gemischt und auf eine Säule gegeben. Die Säule wurde 1 min bei rpm zentrifugiert, mit 750 µl Puffer PE gewaschen und erneut zentrifugiert. Die DNA wurde mit 50 µl Puffer EB von der Säulenmatrix in ein frisches Gefäß eluiert. Zur Mengenbestimmung und Überprüfung der extrahierten DNA- Fragmente wurde erneut eine Gelelektrophorese durchgeführt und die Konzentration an verdautem Vektor und Insert anhand der Markerbande abgeschätzt (Abb. 21). Marker Insert pbssk Spur kb 125 ng Abbildung 21: Mengenabschätzung von Insert und Vektor durch Gelelektrophorese. Agarosegel nach elektrophoretischer Auftrennung der DNA-Fragmente. Aufgetragen wurden 5 µl Marker in Spur 1, 4 µl Insert-DNA in Spur 2 und 4 µl Vektor-DNA in Spur 4. 50

56 MATERIAL UND METHODEN d) Ligation Unter Ligation versteht man die enzymatische Verknüpfung zweier DNA-Enden. Das Enzym Ligase bildet eine Phosphodiesterbindung zwischen dem 3'-Hydroxy-Ende und dem 5'-Phosphat-Ende der DNA aus. Bei der Ligation eines linearisierten und dephosphorylierten Plasmidvektors mit einem DNA-Insert entstehen ringförmig Plasmide, die an den Insertionsstellen nur über einen durchgehenden Einzelstrang miteinander verbunden sind, da die 5 -Enden des Vektors nicht mit den 3 -OH-Enden des Inserts verestert werden können. Der finale Ringschluss findet erst nach der anschließenden Transformation in E.coli durch Reparaturenzyme der Wirtszelle statt. Für die Ligationsreaktion mit dem Quick Ligation Kit wurden die Vektor-DNA und die Insert- DNA in einem molaren Verhältnis von 1:4 eingesetzt. m (Insert) = 4 m (Vektor) N(kb des Inserts) N(kb des Vektors) In einem Reaktionsvolumen von 20 µl wurden ca. 100 ng Vektor-DNA mit der entsprechenden Menge Insert-DNA und 20 µl Puffer gemischt. Nach Zugabe von 2 µl T4 DNA Ligase wurde der Ansatz 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und bis zur Transformation auf Eis gehalten. Zur Kontrolle wurde parallel dazu ein Ansatz ohne die Insert-DNA gemacht. Daraufhin wurden 50 µl Bakteriensuspension (XL10-Gold) mit 5 µl des Ligationsansatzes transformiert und aus den resultierenden Klonen wurden per Mini-Präparation die DNA- Plasmide isoliert. Die isolierte DNA aus dem Ligationsansatz wurde mit NdeI im Probeverdau geschnitten und anschließend durch Gelelektrophorese kontrolliert. Plasmide, die nach dem Restriktionsverdau die richtigen Banden aufwiesen, wurden zur Sequenzierung an GATC geschickt. Plasmide mit korrekter Sequenz wurden wiederum amplifiziert und in präparativem Maßstab aufgereinigt. 51

57 MATERIAL UND METHODEN N2 N2 pbssk PCR Restriktionsverdau Ligation Sequenzierung pbssk Restriktionsverdau pet Ligation pet Abbildung 22: Klonierung der Vinkulin cdna in den Expressionsvektor pet. In den Vektor N2 (Gelb) mit der Vinkulin Sequenz (Orange) wurden mittels PCR NotI und NdeI Schnittstellen eingeführt. N2 und pbssk (Grün) wurden mit NotI verdaut und ligiert. Die erfolgreiche Insertion der Vinkulin cdna in den pbssk Vektor wurde durch Sequenzierung überprüft. Das korrekt sequenzierte Plasmid wurde mit den Restriktionsenzymen NotI, NdeI und ScaI geschnitten. Die ausgeschnittene Vinkulinsequenz wurde in den ebenfalls mit NotI und NdeI verdauten pet Vektor (Blau) inseriert. Klonierung der Vinkulin cdna in den Expressionsvektor pet28a Als Erstes wurde die integrierte Vinkulinsequenz aus dem pbssk-vektor wieder herausgeschnitten (vgl. Abb. 22). Da der Vektor und das Insert in diesem Fall etwa gleich groß sind (ca. 3 kb), würden sie während der Gelelektrophorese gleich schnell laufen und könnten somit nicht unterschieden und voneinander getrennt werden. Aus diesem Grund wurde im Restriktionsverdau das Insert mit NotI und NdeI herausgeschnitten und der Vektor zusätzlich mit dem Restriktionsenzym ScaI in zwei kleinere Stücke zerteilt, um diese vom größeren Insert trennen zu können. Der Zielvektor pet wurde ebenfalls mit NotI und NdeI verdaut und anschließend mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Als Nächstes wurden das Insert und der Zielvektor wie schon bei der vorherigen Klonierung durch eine präparative Gelelektrophorese separiert, extrahiert und aufgereinigt. Im letzten 52

58 MATERIAL UND METHODEN Schritt wurde die Vinkulinsequenz in den pet Expressionsvektor ligiert, der Vektor amplifiziert (für höhere Effizienz wurde dieses große Plasmid in E.coli DH10β transformiert) und in einem Probeverdau mit NotI und NdeI kontrolliert (Abb. 23). Marker Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5 Spur Vektor + Insert 6 kb Vektor 3 kb Insert Abbildung 23: Kontrollgel des Probeverdaus von pet28a mit integrierter Vinkulinsequenz. In den Spuren mit ungerader Ziffer wurden jeweils 2 µl des unverdauten Plasmids aufgetragen und in die Spuren mit gerader Ziffer der Probeverdau der entsprechenden DNA (2 µl) mit NotI und NdeI. Man sieht, dass alle fünf Mini-Präparationen (Probe 1-5) das korrekte Plasmid ( 5,4 kb) mit Insert ( 3 kb) enthielten und der Verdau an den Restriktionsschnittstellen gut funktioniert hat, sodass die linearisierten Fragmente weiter in das Gel eingewandert sind. Expression der Vinkulin Proteine in Bakterien Für die Überexpression und Aufreinigung der Vinkulin Proteine wurde die Vinkulinsequenz in einen pet28a-vektor kloniert und in den Bakterienstamm BL21 (DE3) RIL transformiert. Der pet-vektor bietet neben einer Antibiotika-Resistenz die Möglichkeit, einen C-terminalen His-tag oder/und einen N-terminalen His-tag, gefolgt von einer Thrombin-Schnittstelle als Fusionsprotein mit der Insert-Sequenz, zu exprimieren. Außerdem wichtig für die gezielte Expression in Bakterien ist das LacI-Gen, welches den Lac-Repressor (LacI) codiert, sowie der T7 Promotor, welcher zusammen mit dem Lac-Operator und der ribosomalen Bindungsstelle dem Insert vorgeschaltet ist (vgl. Abb. 24). LacI bindet spezifisch an die Sequenz des Lac-Operators und verhindert somit die Bindung der T7 RNA-Polymerase an den T7 Promotor. Die ausgewählten E.coli BL21 (DE3) RIL sind besonders geeignet für die Expression rekombinanter Proteine, da sie keine Lon und OmpT Proteasen besitzen, die normalerweise fehlerhaft gefaltete Proteine degradieren, und somit empfänglicher sind für die Produktion von Fremdproteinen. Zusätzlich ist dieser Stamm in der Lage, Proteine mit den in E.coli selten vorkommenden trna-codons AGA und AGG für Arginin, AUA für Isoleucin und CUA für Leucin zu exprimieren. Der BL21 (DE3) RIL Stamm codiert zudem für eine T7 RNA-Polymerase, die für eine hohe Transkriptionsrate von Expressionsvektoren mit einem T7 Promotor, wie dem 53

59 MATERIAL UND METHODEN verwendeten pet-vektor, sorgt. Die Expression der T7 RNA-Polymerase wird von einem LacUV5-Promotor kontrolliert. Es handelt sich dabei um ein modifiziertes Lac-Operon, dessen Promotor von den E.coli eigenen RNA-Polymerasen erkannt werden kann. Aber auch in diesem Fall ist die Bindung der Polymerase durch den Lac-Repressor blockiert, welcher von dem LacI-Gen in einem anderen Sequenzbereich der Wirtszelle codiert wird. Dank dieser genetischen Voraussetzungen kann die Proteinexpression durch Zugabe von Isopropyl-β-Dthiogalactopyranosid (IPTG) gezielt induziert werden. IPTG hat eine ähnliche Struktur wie Galaktose und fungiert somit als künstlicher Induktor des Lactose-Operons. Das bedeutet, IPTG aktiviert das Operon indem es an den Lac-Repressor bindet, welcher daraufhin seine Konformation ändert und sich vom Operon löst. Als Folge dessen können alle Gene unter Kontrolle des Lac-Promotors abgelesen werden. Da IPTG, im Gegensatz zum ursprünglichen Induktor Lactose, nicht im natürlichen Metabolismus von Bakterien umgesetzt wird, bleibt die zugegebene Konzentration konstant und der Repressor somit inaktiv. IPTG Induktion E.coli RNA- Polymerase 2 Lac-Operator Lac-Promotor T7 Gen T7 RNA- Polymerase 4 T7 RNA- Polymerase 2 Lac-Operator Lac-Promotor Vinkulin Gen pet Lac-Repressor E.coli DNA BL21 (DE3) RIL LacI Gen Abbildung 24: Induktion der Vinkulin Transkription in E. coli. Sowohl die bakterielle DNA, als auch das Plasmid codieren für den Lac-Repressor (Rot), der an den Lac-Operator (Blau) bindet. Durch IPTG Zugabe (1) löst sich der Lac-Repressor vom Lac-Operon (2), sodass die RNA-Polymerase (Braun) der Wirtszelle E. coli BL21 (DE3) RIL das T7 Gen transkribieren kann (3). Die exprimierte T7 RNA- Polymerase (Orange) bindet wiederum an das Lac-Operon des pet-vektors (4), dessen Repressor ebenfalls durch IPTG gebunden wurde. Als Folge dessen wird das nachgeschaltete Vinkulin Gen (Lila) abgelesen und exprimiert (Modifiziert nach 54

60 MATERIAL UND METHODEN Die Bakteriensuspension (50 µl) wurde 10 min auf Eis aufgetaut und zusammen mit 1 µl DNA für 30 min auf Eis inkubiert. Nach einem Hitzeschock (42 C, 30 s) wurde der Ansatz für weitere 5 min auf Eis gekühlt und dann mit 950 µl SOC-Medium gemischt und bei 37 C und 250 rpm für 1 h inkubiert. Die transformierten Bakterien wurden auf vorgewärmten Agarplatten ausplattiert und am Folgetag wurde eine Vorkultur (LB-Medium + 34 µg/ml Chloramphenicol + 39 µg/ml Kanamycin) angeimpft. Aus der Vorkultur wurde am nächsten Tag die Hauptkultur im Verhältnis 1:40 angesetzt und bei 37 C inkubiert, bis im Photometer bei 595 nm eine optische Dichte von 0,6 erreicht war. Sobald die exponentielle Wachstumsphase erreicht war, wurde die Bakteriensuspension mit 0,5 mm IPTG (1M Stocklösung in H2O) stimuliert und über Nacht (ca. 15 h) bei 18 C und 150 rpm kultiviert. Die Bakterien wurden anschließend pelletiert und bei -80 C eingefroren. Aufreinigung der exprimierten Proteine Die eingefrorenen Bakterienpellets wurden für den Zellaufschluss in kaltem Lysepuffer (50 mm Tris (ph=8,0), 500 mm NaCl, 10 mm Imidazol, 5 mm β-mercaptoethanol, 1 mg/ml Lysozym, 0,1 mg/ml Dnase, 1 mm PMSF, 1 mm Benzamidin) resuspendiert, 3 15 s bei 50 W auf Eis sonifiziert und anschließend abzentrifugiert ( rpm, 15 min, 4 C). Im ersten Schritt der Aufreinigung wurden die rekombinanten Proteine mithilfe ihres His-tags durch eine Nickel-Affinitätschromatographie isoliert (vgl. Abb. 25). Die sechs aufeinander folgenden Histidinreste des Proteins binden dabei an eine Nickel-Chelat-Säule. Als Säulenmatrix diente in diesem Fall Sepharose (quervernetzte Agarose), die Ni 2+ -Ionen gebunden an Nitrilotriessigsäure (NTA) enthält (Ni 2+ bindet je 2 Histidine). Die Ni-NTA- Sepharose (stationäre Phase) wurde mit dem zehnfachen Volumen an Puffer (50 mm Tris (ph=8,0), 500 mm NaCl, 10 mm Imidazol, 5 mm β-mercaptoethanol) äquilibriert, bevor das Proteingemisch (flüssige Phase) aufgetragen wurde. Die stationäre Phase mit den daran gebundenen Proteinen wurde in zwei Durchläufen mit jeweils dem zehnfachen Säulenvolumen an Puffer (50 mm Tris (ph=8,0), 500 mm NaCl, 10 mm (1. Waschdurchlauf) bzw. 20 mm (2. Waschdurchlauf) Imidazol, 5 mm β-mercaptoethanol) gewaschen. Durch eine gesteigerte Imidazolkonzentration konnten die Proteine anschließend wieder von den Ionen verdrängt werden. Für die Elution wurde das zweifache Säulenvolumen an Elutionspuffer (50 mm Tris (ph=8,0), 500 mm NaCl, 250 mm Imidazol, 5 mm β-mercaptoethanol) zugegeben und das durchgelaufene Eluat aufgefangen. 55

61 MATERIAL UND METHODEN Im zweiten Schritt der Aufreinigung erfolgte die Entsalzung der Probe über eine HiTrap Entsalzungssäule (vgl. Abb. 25). Dafür kam eine Flüssigchromatographie FPLC Einheit von Pharmacia (FPLC System von Pharmacia mit LCC 500 Controller, P-500 Pumpen, UV Detektor UV-1 und Frac 100 Kollektor) zum Einsatz. Die Säule ist mit dem Medium Sephadex G-25 Superfine gepackt, welches aus vernetzten Dextrankügelchen besteht. Das Prinzip dieser Chromatographie basiert auf dem Größenausschluss der einzelnen Komponenten. Kleine Moleküle können in die poröse Säulenmatrix eintreten, was eine längere Retentionszeit bedingt. Moleküle mit einem größeren hydrodynamischen Volumen können hingegen nicht in die Poren eindringen, wandern folglich schneller durch die Matrix und können somit von den kleineren Bestandteilen separiert werden. Die Extinktion (OD280) der austretenden Fraktion kann durch einen Detektor bestimmt werden. Das Eluat aus der Affinitätschromatographie wurde auf die Säule geladen und als Puffer wurde 50 mm Tris (ph=8,0) mit 2 mm DTT (Dithiothreitol) verwendet. Im dritten Schritt der Aufreinigung (vgl. Abb. 25) wurden die Proteine über einen Ionenaustauscher (MonoQ) separiert. Diese Methode beruht weder auf spezifischen Bindungen der Aminosäuren, noch auf der Molekülgröße wie die vorherigen Schritte, sondern auf den unterschiedlichen Ladungszuständen der Proteine. An einer polymeren Matrix befinden sich in diesem Fall geladene funktionelle Gruppen, deren reversible Interaktion mit den Molekülen durch den ph-wert und die Salzkonzentration des Puffers reguliert wird. Die Netto-Oberflächenladung der amphoteren Proteine ist ph-abhängig, und in einem definierten ph-wert spezifisch für das einzelne Protein, entsprechend seines isoelektrischen Punktes. Somit würde ein bestimmtes Protein bei einem ph-wert oberhalb seines isoelektrischen Punktes an eine positiv geladene Matrix binden (Anionenaustauscher) und bei ph-werten kleiner als der isoelektrische Punkt an negativ geladene Oberflächen (Kationenaustauscher). Beim Beladen der Säule binden die Proteine mit der passenden Oberflächenladung an die stationäre Phase, während anders geladene oder ungeladene Bestandteile mit der Flussgeschwindigkeit des Puffers durchgespült werden. Wenn alle nicht-bindenden Proteine ausgewaschen sind, können die isolierten stationären Proteine durch steigende Salzkonzentrationen (= ph-änderung) im Puffer eluiert werden. Bei niedrigen Salzkonzentrationen werden zunächst die Proteine mit der niedrigsten Nettoladung von den 56

62 MATERIAL UND METHODEN Salzionen verdrängt und abgelöst. Die Proteine mit der höchsten Oberflächenladung eluieren erst in der letzten Fraktion mit der höchsten Salzkonzentration. Die MonoQ-Säule wurde mit dem Puffer A (50 mm Tris (ph=8,0), 2 mm DTT) equilibriert, die Probe aufgetragen, noch einmal mit Puffer A gewaschen und schließlich durch einen linearen Gradienten an NaCl (0-200 mm) über 20 ml eluiert. Um alle Rückstände zu lösen, wurde zuletzt mit reinem Puffer B (50 mm Tris (ph=8,0), 2 mm DTT, 1 M NaCl) gespült. Die Vinkulin Proteine lösten sich von der Säule bei NaCl Konzentrationen von mm. Affinitätschromatographie Größenausschlusschromatographie Ionenaustauschchromatographie Abbildung 25: Verwendete Chromatographieverfahren zur Proteinaufreinigung. In der Affinitätschromatographie wird ein Ligand (dunkelblau) über spezifische Bindungen mit Rezeptoren (hellblau) an der Säulenmatrix immobilisiert. Die Größenausschlusschromatographie trennt, aufgrund von unterschiedlichen Diffusionsvolumina für Moleküle unterschiedlicher Größe, die Substanzen in Fraktionen mit verschiedenen Laufzeiten auf. In der Ionenaustauschchromatographie binden Stoffe anhand ihrer Ladung reversibel an geladene funktionelle Gruppen am Säulenmaterial (Adaptiert nach GE Healthcare-Handbook Ion Exchange Chromatography & Chromatofocusing). Als letzter Schritt der Aufreinigung wurde die Vinkulin Fraktion noch in Centricon Röhrchen auf 2,2 mg/ml aufkonzentriert Aktinbindungsstudie Um die Bindung eines beliebigen Proteins an Aktinfilamente nachzuweisen, kann die sogenannte Co-Sedimentation dieses Proteins mit Aktin in vitro getestet werden. Durch Ultrazentrifugation wird das F-Aktin vom G-Aktin separiert und F-Aktin-bindende Proteine cosedimentieren gemeinsam mit den Aktinfilamenten im Pellet am Boden des Zentrifugenröhrchens (vgl. Abb. 26). Für die Bindungsstudie von Vinkulin wurden die in vitro 57

63 MATERIAL UND METHODEN exprimierten und aufgereinigten Vinkulin Mutanten zusammen mit kommerziellem Aktin aus dem Actin Binding Protein Biochem Kit verwendet. Die Lösungen und lyophilisierten Komponenten des Kits wurden gemäß der Anleitung vorbereitet. Um die Aktivierung und somit die Aktinbindung des Vinkulin Moleküls zu unterstützen, wurde für diese Versuche auch eine Peptidsequenz aus dem Protein Talin benötigt. Bei der Vinkulin Bindungsstelle 3 aus Talin (VBS3) handelt es sich um eine 26 Aminosäuren lange Sequenz (YTKKELIESARKVSEKVSHVLAALQA), welche als Oligopeptid (Reinheitsgrad > 95%; M = 2899 g/mol) von der Firma Biomatik bezogen wurde. Alle Reagenzien für den Versuchsansatz wurden zunächst zügig aufgetaut und auf Eis gestellt. 250 µg Muskel-Aktin wurden mit 250 µl Aktin-Resuspensionspuffer resuspendiert und 30 min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 25 µl Aktin-Polymerisationspuffer wurde das Aktin bei 24 C eine Stunde lang polymerisiert. Für die Reaktionsgemische wurden jeweils 45 µl F-Aktin (21 µm), 50 µl Vinkulin (19 µm), 500 µm bzw. 1 mm VBS3 verwendet und der Ansatz mit Aktin-Puffer (630 µl Aktin- Resuspensionspuffer + 70 µl Aktin-Polymerisationspuffer) auf 100 µl aufgefüllt. Als Positivkontrolle wurden Ansätze mit 10 µl α-aktinin (2 µm) und 2 µl Tris-HCl (ph 6,5) vorbereitet. Als Negativkontrolle dienten die Ansätze mit 2 µl BSA (2 µm) und 9 µl H2O anstelle von Vinkulin. Im Laufe der Versuchsreihe wurde das Verhältnis von Aktin zu Vinkulin angepasst. Als optimal ergab sich eine Endkonzentration von 9,5 µm Aktin mit 3,8 µm Vinkulin und 5 µm VBS3 in einem 100 µl Ansatz. Die Reaktionsansätze wurden 1 h bei RT inkubiert und in einer Ultrazentrifuge abzentrifugiert (4 C, g, 1 h). VBS3 Vinkulin F-Aktin 1h, RT 1h, 4 C g Überstand Pellet Abbildung 26: Schematische Darstellung der Co-Sedimentation mit Aktin. Vinkulin (Grün) bindet das Peptid VBS3 (Rot) und polymerisierte Aktinfilamente (Schwarz). Durch Ultrazentrifugation sedimentiert F-Aktin. Folglich findet man Aktin und alle daran gebundenen Proteine im Pellet, während ungebundene, lösliche Proteine im Überstand verbleiben. 58

64 MATERIAL UND METHODEN Anschließend wurde der Überstand vorsichtig abgezogen und das Pellet in 100 µl Aqua bidest. resuspendiert. Beide Fraktionen wurden mit 25 µl 5x Laemmli-Puffer versetzt, aufgekocht (5 min, 95 C) und auf ein SDS-Gel aufgetragen. Nach der elektrophoretischen Auftrennung wurden die Proteinbanden mit Coomassie gefärbt und die Intensitäten in ImageJ ausgewertet. 4.4 Biophysikalische Methoden Kollagengele Das Verhalten (Invasion, Kraftgeneration, Migration) von Zellen in ihrer dreidimensionalen Umgebung kann analysiert werden, indem Kollagengele als artifizielle extrazelluläre Matrix dienen (Mierke et al., 2010). Die Dichte und Steifigkeit dieser Matrizen kann durch die Kollagenkonzentration variiert und nach Bedarf können zusätzliche Faktoren, wie z. B. Fibronektin oder Wachstumsfaktoren, zugesetzt werden (Lang et al., 2015). Die Mischung für die Kollagengele wurde auf Eis angesetzt: 1,2 ml Kollagen G (4 mg/ml) + 1,2 ml Kollagen R (2 mg/ml) µl 10x DMEM (4,5 g/l D-Glukose, ohne NaHCO3, L-Glutamin und Na-Pyruvat) µl NaHCO3 (M= 84,01 g/mol, 23 mg/ml in H2O, steril filtriert) + 43 µl NaOH (1N) Von dem sorgfältig gemischten Ansatz wurden je 1,2 ml in eine 3,5 cm Schale gefüllt und im Brutschrank polymerisiert. Nach 2 h wurden 2 ml Medium zugegeben, um das Austrocknen zu verhindern. Um die Kollagengele für die 3D Traktionsmikroskopie einzusetzen, wurden zunächst 16,6 µl einer Bead-Suspension (FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, Ø 1,0 µm (540/560) 2% solids) in 500 µl NaHCO3 gewaschen, 8 min bei rpm abzentrifugiert und wieder in 270 µl NaHCO3 aufgenommen. Diese Suspension wurde sonifiziert und anstatt der reinen NaHCO3-Lösung im Protokoll verwendet. Zusätzlich wurden 20 µl einer Zellsuspension ( Zellen/ml) zur Kollagen-Mischung gegeben, bevor diese auf Schälchen verteilt wurde. Von den Zellen und den umgebenden Beads (kugelförmige Partikel) im Kollagengel wurden Schichtaufnahmen am Mikroskop gemacht und diese mit den entsprechenden Matlab Programmen wie in (Koch et al., 2012b) ausgewertet. 59

65 MATERIAL UND METHODEN D Traktionsmikroskopie Die mechanischen Kräfte, welche eine adhärente Zelle auf das Substrat ausübt, können mit Hilfe der von Pelham und Wang etablierten 2D Traktionsmikroskopie veranschaulicht und quantifiziert werden (Pelham and Wang, 1997; Bonakdar et al., 2014). Als Substrat für diese Methode werden Polyacrylamid-Gele verwendet, da deren Materialeigenschaften genau charakterisierbar sind und die elastischen Hydrogele über weite Bereiche eine lineare Deformation aufweisen (Frey et al., 2007). Während der Adhäsion kontrahiert die Zelle und deformiert das Substrat, was durch Fluoreszenzmarker innerhalb der Geloberfläche detektiert werden kann. Aus dem räumlichen Verschiebungsfeld der Marker kann dann das Kraftfeld rekonstruiert werden. Das Schermodul [G ] der PAA-Gele kann durch die Acrylamid-Konzentration [c] variiert werden und berechnet sich gefitteten Rheometer Messungen zufolge, bei einem vorgegebenen Acrylamid zu Bis-Acrylamid Verhältnis von 29:1, nach der Gleichung: G = 42,82e (0,7599c) Dementsprechend beträgt der Wert für das Elastizitätsmodul: E = 3G Für die Vermessung von transfizierten Fibroblasten haben sich PAA-Gele mit einem Elastizitätsmodul von ca. 18 kpa als am besten geeignet erwiesen. Um das Polyacrylamid auf einen Glasuntergrund aufzubringen, wurden zunächst Deckgläser Si O OEt Si OEt APTMS Glutaraldehyd H H Abbildung 27: Aktivierung der Deckgläser mit APTMS und Glutaraldehyd für die Bindung an Polyacrylamidgele. N N CO CH CH 2 n Polyacrylamid mit Silan beschichtet (Abb. 27). Die Gläser wurden in 0,1 N NaOH Lösung entfettet, bei Raumtemperatur getrocknet, anschließend in frisch angesetzter zweiprozentiger Lösung 3- Aminopropyltriethoxysilan in H2O beschichtet und wieder getrocknet. Die beschichteten Deckgläser wurden 10 min in H2O gewaschen, mit 2,5 % Glutaraldehyd in PBS 30 min bei RT fixiert, wieder für 20 min gewaschen und getrocknet. Zur Gelherstellung (18 kpa) wurden 2 µl rot fluoreszierender Beads mit einem Durchmesser von 1 µm in 407 µl H20 suspendiert und 20 s mit Ultraschall vereinzelt. Die Suspension wurde auf Eis abgekühlt, bevor 87,5 µl Acrylamid/Bis-Acrylamid (29:1), 2,5 µl Ammoniumperoxodisulfat (APS) und 1 µl Tetramethylethylendiamin (TEMED) hinzupipettiert wurden. APS als Radikalstarter leitet 60

66 MATERIAL UND METHODEN die radikalische Polymerisation von Acrylamid in der wässrigen Lösung ein, während TEMED als Katalysator fungiert. Von der sorgfältig gemischten PAA-Suspension wurden je 28 µl in die Mitte eines Gene Frames pipettiert, ein vorbehandeltes Deckglas darauf gesetzt und die Beads innerhalb von 30 min bei 2500 rpm und 4 C an die Geloberfläche zentrifugiert. Die PAA-Gele wurden anschließend 2 h bei RT auspolymerisiert und mithilfe des Kleberandes am Boden einer Petrischale (Ø 3,5 cm Schälchen mit Ø 1,5 cm Loch) befestigt. Die fertigen Gele wurden 20 min mit PBS gewaschen und für 1 h unter UV Licht sterilisiert. Um die Adhäsion von Zellen auf dem Polyacrylamidgel zu ermöglichen, muss dieses zunächst mit Proteinen der extrazellulären Matrix beschichtet werden, welche mithilfe eines photoaktivierbaren Vernetzungsmittels (z. B. Sulfo-SANPAH) an die Geloberfläche gebunden werden können. Auf jedes PAA-Gel wurden 100 µl Sulfo-SANPAH pipettiert und für 5 min unter UV-Licht aktiviert, anschließend 2 10 min mit PBS gewaschen und mit 500 µl einer Fibronektinlösung (10 µg/ml in PBS) über Nacht im Kühlschrank beschichtet. Am Folgetag wurden die Gele im Inkubator vorgewärmt, mit PBS gewaschen und die Zellen darauf ausgesät. Die Zellzahl wurde dabei auf die jeweilige Zellfläche angepasst, sodass die Zellen am Tag der Messung einzeln ohne Zell-Zell-Kontakte vorliegen. Von transfizierten MEFs wurden Zellen pro Schälchen für die 2D Traktionsmikroskopie eingesetzt und über Nacht inkubiert. CytoD/Trypsin PAA Gel fluoreszierende beads kontrahiertes Gel relaxiertes Gel Abbildung 28: Schematische Darstellung der 2D Traktionsmikroskopie. Zellen werden auf ein mit Fibronektin beschichtetes Polyacrylamidgel ausgesät und kontrahieren während ihrer Ausbreitung das Gel. Am Folgetag werden die Zellen mit einer Mischung aus Cytochalasin D und Trypsin abgelöst und das Gel relaxiert. Die Positionen der Beads (Rot) in der Geloberfläche werden vor und nach der Relaxation detektiert und aus der Verschiebung werden die Traktionskräfte berechnet. Von den adhärierten Zellen und den fluoreszierenden Beads in der Geloberfläche wurden Aufnahmen gemacht. Danach wurden die Zellen mit Cytochalasin D (80 µm) und Trypsin (0,25% in EDTA) abgelöst und von dem relaxierten PAA-Gel erneut Bilder aufgenommen (Abb. 28). Die Positionen der Fluoreszenzmarker vor und nach der Relaxation wurden detektiert und das Verschiebungsfeld anhand einer Subpixelverschiebung mit Interpolation 61

67 MATERIAL UND METHODEN im Fourierraum bestimmt. Basierend auf der Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC) Methode von Butler et al. wurde daraufhin das Kraftfeld rekonstruiert (Butler et al., 2002). Aus den berechneten Traktionskräften, die auf die elastische Matrix ausgeübt wurden, lässt sich auch auf die elastische Deformationsenergie (Strain Energy) schließen, welche im Polyarcylamidgel gespeichert ist. Die Deformationsenergie ist das Produkt aus lokaler Kraft und Deformation integriert über die Zellfläche und eignet sich daher besonders als Gesamtmaß für die Kontraktilität, um verschiedene Zelltypen mit unterschiedlicher Genexpression zu vergleichen (Koch et al., 2012b) Magnetic Tweezer Mit dem Magnetic Tweezer lassen sich die passiven, mechanischen Eigenschaften von adhärenten Zellen untersuchen, indem mit Hilfe eines Elektromagneten laterale Kräfte auf kleine paramagnetische Partikel (Beads) ausgeübt werden (Bonakdar et al., 2014). Die mit EZM-Proteinen beschichteten Beads sind über die Integrine der fokalen Adhäsionskomplexe an die Zelloberfläche gebunden und durch videomikroskopische Verfolgung (40 Aufnahmen/s mit einer CCD-Kamera) kann ihre Position (geometrischer Schwerpunkt) und deren Verschiebung während der Kraftapplikation beobachtet werden (Alenghat et al., 2000). Die Beads, als magnetische Dipole, erfahren im inhomogenen Magnetfeld eine Kraft, durch die sie sich in Richtung der höheren Feldstärke bewegen. Durch die Anbindung an die Zelloberfläche und die Verknüpfung mit dem Zytoskelett wird die Auslenkung des Beads als Scherspannung auf die Zellstrukturen weiter gegeben. Die Verformung der Zelle J(t) folgt dabei einem Potenzgesetz: J(t) = J 0 ( t t ) b 0 Der Kehrwert des Faktors J0 (nn/µm) ist ein Maß für das dynamische Schermodul, also die Steifigkeit der Zelle. 62

68 Auslenkung [µm] Kraft [nn] MATERIAL UND METHODEN A Inkubation mit paramagnetischen Beads Spule B magnetisierbarer Kern mit geschliffener Spitze C D Zeit [s] Abbildung 29: Aufbau des Magnetic Tweezers. A) Zellen werden am Vortag auf regulären Zellkulturschalen ausgesät und 30 min vor der Messung mit paramagnetischen Beads (Ø 4,5 µm, Fibronektinbeschichtung) inkubiert. Über die sehr feine Spitze eines Elektromagneten (magnetisierbarer Kern in Kupferspule) wird ein Magnetfeld erzeugt und eine kalibrierte Kraft auf die an der Zelloberfläche angebundenen Beads appliziert. Die Auslenkung der Beads bei der jeweils angelegten Kraft wird detektiert und daraus auf die Steifigkeit der Zelle geschlossen. B) Magnetic Tweezer Apparatur während einer Messung von transfizierten Zellen. C) Hellfeld-Aufnahme aus einer videomikroskopischen Verfolgung eines an die Zelloberfläche gebundenen Beads nahe der magnetisierbaren Spitze. D) Der Graph zeigt die gemessene Verschiebung eines Beads (Blau) während der applizierten Kraftstufen (Rot; 1 nn/s). Der experimentelle Aufbau besteht aus einem zu einer sehr feinen Spitze geschliffenen Baustahl, der sich als magnetisierbarer Kern in einer Kupferspule befindet (Abb. 29A+B). Diese Apparatur zur Erzeugung des Magnetfeldes befindet sich an einem invertierten Mikroskop und kann durch einen motorisierten Mikromanipulator gesteuert werden. Das Matlab-basierte Programm zur Ansteuerung des Magnetic Tweezers erkennt automatisch den Abstand zwischen der Spitze und dem Bead und reguliert entsprechend den Strom durch den Elektromagneten, um genau die richtige Kraft auf das Bead auszuüben (Abb. 29C). Für diesen Vorgang muss der Aufbau zunächst kalibriert werden (Kollmannsberger and Fabry, 2007). Hierfür werden Beads in verschiedenen Silikonölen (Polydimethylsiloxan) mit definierter Viskosität suspendiert und ein Magnetfeld appliziert. Durch die bekannte Viskosität und die Geschwindigkeit der Beads im Feld lässt sich durch das Gesetz nach Stokes auf die Kraft rückschließen. Auch für die Restmagnetisierung des Materials muss kalibriert werden, indem 63

69 MATERIAL UND METHODEN mehrere Zyklen von Magnetisierung und Entmagnetisierung durch eine Koerzitivfeldstärke erfolgen. Für die Messung der Zellsteifigkeiten wurde ein Kraftprotokoll angewendet, welches schrittweise im Abstand einer Sekunde die Kraft um 1 nn erhöht und bis zur nächsten Erhöhung konstant hält. Nach zehn erfolgten Kraftstufen wird das Magnetfeld abgeschaltet und die Relaxation der Zelle verfolgt (Abb. 29D). Für die darauf folgende Messung wurde die Spitze zunächst gereinigt, um im Magnetfeld angezogene Partikel zu entfernen und durch Anlegen eines geeigneten Gegenstroms entmagnetisiert. Danach wurde eine neue Zelle in ausreichendem Abstand zur vorherigen ausgewählt. Als Vorbereitung für die Messung mit dem Magnetic Tweezer musste zunächst Fibronektin kovalent an die Oberfläche der verwendeten Beads gebunden werden. Dafür wurden 25 µl der Dynabead-Suspension (ca Beads, Ø 4,5 µm) zweimal in 1 ml PBS gewaschen und abzentrifugiert ( rpm, 2 min) und anschließend mit 1 ml kalter Fibronektinlösung (50 µg/ml in PBS) für 24 h bei 4 C und 1400 rpm auf dem Schüttler beschichtet. Am Folgetag wurden die Beads mit einprozentiger BSA-Lösung und danach mit PBS gewaschen. Beschichtete Beads wurden für den direkten Gebrauch bei 4 C und für spätere Versuche bei -20 C gelagert. Am Tag vor der Messung wurden Zellen in einem Zellkulturschälchen (Ø 3,5 cm) ausgesät. Die Fibronektin beschichteten Beads wurden im Ultraschallbad vereinzelt und ca. 20 µl der Suspension auf die adhärierten Zellen gegeben. Nach 30 min im Brutschrank waren die Beads ausreichend stark an die Zelloberflächen gebunden und die Zellen konnten eine halbe Stunde lang auf der geheizten Mikroskopplattform vermessen werden. Die Messzeit war begrenzt, da der Aufbau keine CO2-Versorgung ermöglicht. Um die Ergebnisse nicht zu verfälschen, wurde darauf geachtet, dass nur Zellen vermessen werden, welche nicht mehr als ein Bead auf der Oberfläche tragen und keinen Kontakt zu Nachbarzellen haben. Bei transfizierten Zellen wurde zudem im Fluoreszenzmodus die egfp-expression der ausgewählten Zelle überprüft. Die beobachteten Bead Positionen im Verlauf der Kraftapplikation wurden hinterher mit der zugehörigen Matlab-Software ausgewertet Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) Bei Fluoreszenz Recovery After Photobleaching (FRAP) handelt es sich um eine Methode zur Bestimmung der Austauschkinetik fluoreszenzmarkierter Moleküle, Proteine oder auch Lipide. 64

70 MATERIAL UND METHODEN Durch FRAP konnte z. B. die laterale Diffusion von Proteinen in Lipidmembranen beobachtet werden, was zum Flüssig-Mosaik-Modell der Plasmamembran führte. Mit einem Laserstrahl werden die fluoreszierenden Moleküle in einem definierten Bereich irreversibel ausgebleicht. Sobald die gebleichten Moleküle den Bereich verlassen und durch neue fluoreszierende Moleküle aus den umliegenden Regionen ersetzt werden, steigt die Fluoreszenzintensität im beobachteten Bereich wieder an. Die Fluoreszenzintensität und die Geschwindigkeit ihrer Veränderung kann somit als Maß für die Austauschdynamik der Moleküle dienen. Damit der Austausch von Proteinen in fokalen Adhäsionen möglich ist, müssen zum einen ungebleichte Proteine aus dem Zytoplasma in den gebleichten Bereich hinein diffundieren und zum anderen müssen sich die gebleichten Proteine von ihren Bindungspartnern lösen und aus dem fokalen Komplex dissoziieren. Nur dann können die ungebleichten neuen Proteine in dem Komplex binden. Diese beiden Faktoren, Diffusionsgeschwindigkeit und Austauschrate (= Dissoziationsrate koff + Assoziationsrate kon), bestimmen den zeitlichen Anstieg der mittleren Fluoreszenzintensität nach dem Bleichen. Während dieses Vorgangs stellt die Zeitkonstante der Dissoziation den limitierenden Faktor dar, da sie deutlich größer ist als die der Assoziation und der verhältnismäßig schnellen Diffusionsgeschwindigkeit. Für den Fall, dass mehrere Prozesse mit unterschiedlicher Geschwindigkeit an dem Fluoreszenzanstieg beteiligt sind, lässt sich dies theoretisch an verschiedenen Phasen der Kurvensteigung erkennen. Die Diffusion der im Überschuss exprimierten Vinkulin Proteine im Zytoplasma ist allerdings so viel schneller als die Austauschkinetik, dass der kurze, schnelle Anstieg bei den hier verwendeten Aufnahmen in einem Abstand von 4 s, über einen Zeitraum von 5 min, vernachlässigbar ist. Außerdem wurde bereits durch eine dünn gewählte optische Schicht am Konfokalmikroskop ein großer Teil der Zytoplasma-Fluoreszenz ausgeblendet. Innerhalb des Beobachtungszeitraumes erreicht die Intensität einen stationären Zustand, der nicht der Intensität vor dem Bleichen entspricht. Dieser Sättigungswert gibt Aufschluss über den Anteil beweglicher Proteine innerhalb dieses Zeitraums. Stabil gebundene Proteine, welche auf dieser Zeitskala nicht ausgetauscht werden, bezeichnet man als immobile Phase. Da Vinkulin zahlreiche verschiedene Interaktionen (unterschiedlicher Anzahl und Stärke) mit unterschiedlichen Bindungspartnern im fokalen Adhäsionskomplex eingeht, die man weder alle im Detail kennt, noch sie differenziert mathematisch beschreiben kann, wurde für die Analyse der FRAP-Kurven zur allgemeinen Vereinfachung eine einzelne Interaktion zwischen 65

71 MATERIAL UND METHODEN zwei Bindungspartnern angenommen. Die egfp-markierten Proteine befinden sich somit entweder in einem gebundenen oder einem freien Zustand (Abb. 30). Die Wahrscheinlichkeit, dass ein gelöstes Protein an einen Rezeptor bindet, wird bestimmt von der Bindungsrate kon, der Konzentration an freien Liganden cl (wird als konstant angenommen, da freie Proteine in der Zelle im Überschuss vorliegen, verglichen mit den verfügbaren Rezeptoren) und der Anzahl freier Bindungsstellen 1-n (n = Anzahl besetzter Bindungsstellen). Die Wahrscheinlichkeit, dass eine Bindung gelöst wird, hängt dagegen nur von der Rate koff und der Menge blockierter Liganden n ab. Die zeitliche Änderung von n berechnet sich folglich durch die Differenzialgleichung: θ n (t) θ(t) = k on c L [1 n(t)] k off n(t) Somit kann man die auf die Ausgangsfluoreszenz normierte FRAP-Kurve mit der entsprechenden exponentiellen Funktion beschreiben: n(t) = α(1 e κt ) Dabei ist α eine Gleichgewichtskonstante, die den Anteil freier Liganden bei Erreichung des Sättigungswertes (mobile Fraktion) angibt und κ die effektive Austauschrate. k on c L α = k on c L + k off κ = k on c L + k off Als Vergleichsbasis für die FRAP-Messungen hat sich der Wert T1/2 (Halflife Recovery Time) etabliert. k off k on Abbildung 30: Protein-Austauschdynamik. Die freien Proteine (Grün) binden mit einer spezifischen Rate kon an die imobilisierten Rezeptoren (Blau). Die Dissoziation der Bindung erfolgt mit der Rate koff. T 1/2 = ln2 κ Diese Halbwertszeit berechnet sich aus der Austauschrate und gibt an, wie lange es nach dem Bleichen dauert, bis die Intensität wieder auf 50% der stationären Phase angestiegen ist (vgl. Abb. 31). Proteine in einem molekularen Zustand, in dem sie sehr langsam ausgetauscht werden, gehen in die Berechnung dieser Halbwertszeit nicht mit ein, sondern definieren die Höhe der immobilen Fraktion. 66

72 Norm. Intensität MATERIAL UND METHODEN 1 0,8 0,6 0,4 0,2 Fit: Halbwertszeit: Immobile Fraktion = T 1/2 Immobile Mobile Fraktion Zeit [s] Abbildung 31: Verlauf einer Intensitäts-Erholungskurve und Berechnung der FRAP-Parameter. Aufgetragen sind als Beispiel die normierten Intensitätswerte eines markierten Bereichs in einer Vinkulin Rescue Zelle (1 Bild/ 4 s). Nach dem Ausbleichen (t=0) erholt sich die Fluoreszenz bis zu einem Sättigungswert, welcher die mobile Fraktion definiert. Aus den Parametern des monoexponentiellen Fits (Rot) lassen sich die Halbwertszeit und die Mobilitätsverteilung berechnen. Es sind Aufnahmen der gebleichten fokalen Adhäsion zum Zeitpunkt t = -4 s, t = 0 s und t = 160 s gezeigt. Für die Untersuchung der Dynamik von Vinkulin im fokalen Adhäsionskomplex wurden Vinkulin knock-out MEFs mit unterschiedlichen egfp-markierten Vinkulin Konstrukten transfiziert und FRAP Messungen mit einem Konfokalmikroskop in einer Inkubationskammer bei 37 C und 5% CO2 durchgeführt. Da für das Konfokalmikroskop ein 20x dip-in-objektiv zur Verfügung stand, konnten die Proben in regulären Zellkulturschalen ausgesät werden. Um den Drift während den Messungen zu minimieren, sollte die Inkubationskammer über Nacht vorgeheizt, die Zellen 30 min vor Messbeginn in das Mikroskop gestellt und die Raumtemperatur konstant gehalten werden. Die egfp-fluoreszenz wurde angeregt durch einen 488 nm Argon-Laser und die Zellen bei möglichst geringer Leistung gescannt. Eine geeignete fokale Adhäsion wurde mindestens 1 min lang aufgenommen, um den Ausgangswert der Fluoreszenzintensität zu messen. Der Laser wurde anschließend zum Bleichen mit voller Leistung dreimal hintereinander auf die Zielregion gerichtet. Die Zelle wurde nach dem Bleichen für weitere 5 Minuten beobachtet und Aufnahmen im Abstand von 4 s gemacht. Die Fluoreszenzintensitäten in den verschiedenen Bereichen der Zelle wurden im Nachhinein mit ImageJ gemessen und die Werte mithilfe eines Matlab-Programms verrechnet und graphisch dargestellt. 67

73 Norm. Intensität Norm. Intensität Intensität [a.u.] Intensität [a.u.] MATERIAL UND METHODEN A B gebleichte Adhäsion Mittelwert der Referenzadhäsionen Aufnahme (4s/Aufnahme) Aufnahme (4s/Aufnahme) D 1 Fit C 1 0,8 0,8 0,6 0,6 0,4 0, Zeit [s] 0,4 0,2 I 1 n gebleichte Adhäsion n I I i Aufnahme (4s/Aufnahme) I referenzadhäsion Zytoplasma Zytoplasma Abbildung 32: Auswertung der FRAP Messungen. A) Intensitätswerte aller markierten Bereiche in der Zelle. Die Einheit a. u. (arbitrary units) steht für beliebige Zahlenwerte. B) Die Intensitätswerte der gebleichten Adhäsion nach Abzug der Zytoplasmaintensität (Blau) und die Mittelwerte der Intensitäten aller ungebleichten Referenzadhäsionen nach Abzug der Zytoplasmaintensität (Gelb). C) Die Werte für die gebleichte Adhäsion werden auf die Referenzadhäsionen normiert (siehe Gleichung) und der Mittelwert der Messpunkte vor dem Bleichen gleich 1, sowie der Zeitpunkt nach dem Bleichen gleich 0 gesetzt. D) Die entstehenden Kurven für die einzelnen Messungen werden monoexponentiell gefittet und anschließend die Fit-Parameter gemittelt. Als Erstes wurden für jeden Zeitpunkt die Intensitäten in der gebleichten Region und in mehreren ungebleichten Referenzadhäsionen gemessen und von allen Werten die Hintergrundfluoreszenz des Zytoplasmas abgezogen (Abb. 32A+B). Die Intensitäten des gebleichten Bereichs wurden durch den Mittelwert der Referenzadhäsionen geteilt, wodurch der Effekt des Ausbleichens durch die wiederholte Laseranregung der Fluoreszenzmoleküle eliminiert wurde, und anschließend normiert, indem der Mittelwert der 15 Zeitpunkte vor dem Bleichen gleich 1 und der Zeitpunkt nach dem Bleichen gleich 0 gesetzt wurde (Abb. 32C). Die für jede Messung resultierende FRAP-Kurve wurde einzeln mit der beschriebenen monoexponentiellen Funktion gefittet (Abb. 32D). Die Mittelwerte mit Standardfehlern der Fit-Parameter α und κ bzw. T1/2 wurden schließlich als Wert für die verschiedenen Vinkulin Mutanten angegeben. 68

74 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 5 Ergebnisse und Diskussion 5.1 Einfluss der Konformation und Tyrosin-Phosphorylierung auf die Funktion von Vinkulin Konformations- und Tyrosin-Mutanten von Vinkulin Der Einfluss der Vinkulin Konformation auf das Verhalten des Proteins im fokalen Adhäsionskomplex und die Auswirkungen auf die Zellmechanik wurden anhand von Mutanten untersucht, deren dreidimensionale Konformationen in der Literatur bereits beschrieben sind (vgl. Abb. 33A). Eine dauerhaft autoinhibierte und somit geschlossene Proteinstruktur weist die Mutante A50I auf. Diese Punktmutation im Kopfbereich von Vinkulin stabilisiert die D1 Domäne, was zu einer stärkeren Anbindung der Schwanzdomäne führt. Die Bindungsstärke einer isolierten Vinkulin Kopfdomäne (mit der Punktmutation A50I) mit Talin sowie auch mit α-actinin ist dagegen deutlich reduziert (Bakolitsa et al., 2004). Die autoinhibierte Vinkulin- Mutante A50I kann folglich nicht durch die Bindung zu Talin aktiviert werden. Im Gegensatz zur geschlossenen Form der A50I Mutante, bietet die T12 Mutante die Möglichkeit, eine konstitutiv geöffnete, aktive Konformation zu untersuchen. Hinter dem Namen T12 verbergen sich vier Punktmutationen in der Schwanzdomäne von Vinkulin, bei denen geladene Aminosäuren durch Alanin ersetzt wurden (D974A, K975A, R976A, R978A). Durch die veränderte Oberflächenladung ist die Interaktion mit der D4 Domäne gestört und die Bindung von Kopf- und Schwanzdomäne der T12 Mutante ist verhindert (Cohen et al., 2005). Eine weitere aktivierte Vinkulin Form, die Mutante Δex20 wurde verwendet, da sie neben der offenen Konformation einen Defekt in der Aktinbindungskapazität aufweist. Vinkulin Δex20 ist eine Spleißvariante, bei der die 68 Aminosäuren (G916 Q983) des Exons 20 deletiert wurden. Diese Deletion führt in homozygoten Mäusen (Vcl-ΔIn20/21 knock-in) zum Tod im Stadium zwischen E 10,5 und E 12,5 der Embryonalentwicklung. Der Mutante Δex20 fehlen 2,4 Helices der Vinkulin Schwanzdomäne, wodurch essenzielle Bindungsstellen für die Kopfdomäne und und beide Aktinbindungsstellen nicht vorhanden sind (Marg et al., 2010). Da es aus vorangegangenen Arbeiten, in denen die Kristallstruktur von Vinkulin und deren Moleküldynamik in Computersimulationen untersucht worden war, Hinweise gab, dass eine Ladungsänderung an spezifischen Stellen in der Kopfdomäne ebenfalls zu einer Aktivierung 69

75 ERGEBNISSE UND DISKUSSION des Moleküls führen sollte, wurde eine weitere Konformations-Mutante getestet. Die sauren Glutaminsäuren an den Positionen 28, 29 und 31 wurden durch basische Arginine ersetzt, um so die Oberflächenladung der Kopfdomäne zu verändern und die autoinhibierenden Interaktionen durch Abstoßung zu unterbinden. Da sowohl die Dreifachmutante, als auch die Doppelmutante E28,29R, nach der Transfektion in Vcl KO Zellen zu Proteinaggregaten führten, ohne dass Vinkulin gezielt in den fokalen Adhäsionen lokalisierte, und die Zellmorphologie der transfizierten MEFs gestört war, wurde nur die Mutante E29R für weitere Experimente verwendet. A T12 E29R ex20 A50I Kopf Schwanz konstitutiv offene Konformation Aktinbindungs -defizienz B Y100E Y1065E Y100/1065E Y100F Y1065F Y100/1065F simulierte Phosphorylierung nicht phosphorylierbar Abbildung 33: Übersicht über die verwendeten Vinkulin Mutanten. Die Vinkulin Kopfdomäne (AS 1-835) ist über eine prolinreiche Region (schraffierter Bereich) mit der Schwanzdomäne verbunden (AS ). Die Positionen der Punktmutationen sind farbig markiert. A) Zu den Konformations-Mutanten (Blau) gehören die dauerhaft geöffneten, aktiven Mutanten T12 und Δex20 (aktinbindungsdefizient). Bei der Mutante T12 wurden vier Punktmutationen in der Schwanzdomäne eingeführt (D974A, K975A, R976A, R978A) und bei der Mutante Δex20 wurde das Exon20 deletiert (blaues Kreuz). Die Mutante E29R soll aufgrund der Punktmutation im Kopf ebenfalls aktiviert sein. Eine dauerhaft inaktive, autoinhibierte Konformations-Mutante ist die A50I durch die Mutation im Kopfbereich. B) Die Tyrosin Mutationen in der Vinkulin Kopf- und/oder Schwanzdomäne sind in Rot markiert für den Austausch zu Glutaminsäure (simuliert Phosphorylierung) und in Orange für den Austausch zu Phenylalanin (nicht phosphorylierbar). Um zu testen, ob die Src-Phosphorylierung an den Tyrosinen die Funktion von Vinkulin modifiziert, wurden durch gezielte Mutagenese die Phosphorylierungsstellen verändert (Abb. 33B). Durch die Mutation von Tyrosin zu Phenylalanin wurde die Phosphorylierung an dieser Stelle verhindert, wohingegen die Mutation zu Glutaminsäure durch ihre Oberflächenladung eine dauerhafte Phosphorylierung simuliert. Es wurden die beiden relevanten Phosphorylierungsstellen an Position 100 im Kopf und an Position 1065 in der 70

76 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Schwanzdomäne jeweils einzeln oder in Kombination als Doppelmutante ausgetauscht und getestet. Die Transfektion von Mutanten mit gezielten Punktmutationen hat den Vorteil, dass sich die gemessenen Daten auf eine eindeutige Veränderung im Vinkulin Protein zurückführen lassen. Der Einsatz von Kinase-Inhibitoren hätte dagegen zahlreiche Auswirkungen auf diverse Zielproteine und man könnte nicht verlässlich klären, in welchem Maß die fehlende Phosphorylierung von Vinkulin zu den zellulären Veränderungen beiträgt. Die Expression der verschiedenen mutierten Vinkulin Konstrukte in Vinkulin knock-out MEFs wurde nach der Transfektion im Fluoreszenzmikroskop überprüft. Abbildung 34 zeigt konfokale Aufnahmen von transfizierten und anschließend fixierten Zellen auf einem mit Fibronektin beschichteten Glasuntergrund. Durch die zusätzliche Anfärbung des F-Aktins lässt sich gut erkennen, dass die egfp-markierten Vinkulin Proteine regulär in den fokalen Adhäsionen, häufig am Ende von Aktinbündeln, lokalisieren (Moese et al., 2007; Kupper et al., 2010; Zhang et al., 2004). Auch die Morphologie der Zellen wurde durch die Expression der Plasmide nicht gestört. 71

77 ERGEBNISSE UND DISKUSSION WT KO Rescue 20µm T12 E29R Δex20 A50I Y100E Y1065E Y100/1065E Y100F Y1065F Y100/1065F Abbildung 34: Fluoreszenzaufnahmen der verschiedenen Vinkulin Mutanten. Konfokale Aufnahmen von Paraformaldehyd-fixierten MEF WT, KO, sowie transfizierten Zellen. Das Aktinzytoskelett ist mit Phalloidin-TRITC gefärbt (Rot) und die mutierten Vinkulin Proteine sind an egfp gekoppelt (Grün). In WT und KO Zellen wurden die fokalen Adhäsionen durch anti-paxillin Antikörper markiert (Grün) Kontraktile Kräfte Um die Kraftübertragungsfunktion von Vinkulin zu analysieren, wurden murine embryonale Fibroblasten mittels Traktionsmikroskopie vermessen. Erste Ergebnisse (Abb. 35) der WT und KO Zellen ergaben, dass zwar in beiden Fällen klar ersichtlich ist, dass Vinkulin knock-out Zellen 72

78 Deformationsenergie [pj] ERGEBNISSE UND DISKUSSION weniger Kräfte auf das Substrat ausüben können, jedoch waren die gemessenen Unterschiede in der Kraftübertragung, verursacht durch die Expression von Vinkulin, in der zweidimensionalen Methode (Faktor 3,8) größer als in dreidimensionalen Kollagengelen (Faktor 2,5). 1,4 40 1,2 2D 1 3D 0,8 0,6 0, , WT KO Abbildung 35: 2D versus 3D Traktionsmikroskopie. Wildtyp und Vinkulin knock-out Fibroblasten wurden jeweils in der 2D und 3D Traktionsmikroskopie vermessen. Aufgetragen sie die Mittelwerte der Deformationsenergien mit Standardfehlern und der Anzahl vermessener Zellen. Zusätzlich wurde beobachtet, dass die Morphologie der in das Kollagengel eingegossenen Zellen stark abgerundet war und im Falle von transient transfizierten Zellen nur wenige den Vorgang des Eingießens überlebten. Um die Zellen nicht unnötig zu stressen durch die extremen ph-werte, die für die Kollagenpolymerisation notwendig sind und die Unterversorgung an Nährstoffen während dieser Zeit, wurden die 3D Versuche mit transfizierten Zellen eingestellt. Alle weiteren Kraftmessungen wurden auf zweidimensionalen Substraten durchgeführt, die zudem die Detektion feinerer Unterschiede zwischen den verschiedenen egfp-markierten Vinkulin Konstrukten ermöglichten. Dafür wurden die auf Polyacrylamidgelen mit fluoreszierenden Beads adhärierten Zellen mit Cytochalasin D und Trypsin abgelöst und die Verschiebung der Beads während der Gelrelaxation detektiert. Durch das bekannte Elastizitätsmodul wurde auf diese Weise die Deformationsenergie (Strain Energy) berechnet, die angibt wieviel Kraft die Zelle auf das Substrat ausgeübt hat. Die resultierenden Kraftfelder für die verschiedenen Vinkulin Mutanten auf den PAA-Gelen sind in Abbildung 36 gezeigt. 73

79 KO A50I Y100/1065F Δex20 Y1065F E29R Y100F T12 Y100/1065E Rescue Y1065E WT Y100E ERGEBNISSE UND DISKUSSION Hellfeld Fluoreszenz Traktion [kpa] Hellfeld Fluoreszenz Traktion [kpa] µm µm Abbildung 36: Repräsentative Aufnahmen der verschiedenen Mutanten aus der 2D Traktionsmikroskopie. Das Bild auf der linken Seite zeigt eine Hellfeld-Aufnahme der adhärierten Zelle auf dem PAA-Gel. In der Mitte ist die Fluoreszenzaufnahme der in das Gel eingegossenen Beads unterhalb der Zelle zu sehen und rechts die resultierenden Traktionskräfte, berechnet aus der Verschiebung der Beads nach Ablösen der Zelle. Die gelben Linien markieren die Umrisse der Zellen und der Maßstab entspricht 50 µm. Durch den Vergleich von unbehandelten Wildtyp Zellen mit Rescue Zellen, also Vcl knock-out MEFs transfiziert mit dem intakten egfp-vinkulin Konstrukt, konnte überprüft werden, dass weder der Vorgang der Lipotransfektion, noch die Expression der Plasmid-DNA, das Zellverhalten beeinflussen. Da die Rescue Zellen vergleichbare Werte für die Deformationsenergie lieferten wie die Wildtypzellen (ca. 1,2 pj), kann man davon ausgehen, dass die Konzentration an zellulärem Vinkulin ebenfalls vergleichbar ist und die Effekte, die 74

80 Deformationsenergie [pj] ERGEBNISSE UND DISKUSSION bei der Transfektion mit Mutanten (Vinkulin cdna mit Punktmutationen) auftreten, ausschließlich auf die Mutationen zurückzuführen sind (Abb. 37). Auch die untransfizierten Vinkulin knock-out MEFs wurden als Referenzwert vermessen. Murine embryonale Fibroblasten ohne Vinkulin (KO) adhärierten zwar auf den PAA-Gelen, zeigten aber deutlich schwächeres Verhalten und nur ein Viertel der Deformationsenergie (0,3 pj) verglichen mit Zellen mit intakter Vinkulin Expression (Mierke et al., 2010). Die mit der T12 Mutante transfizierten Zellen verhielten sich wie Wildtyp oder Rescue Zellen, während die Deformationsenergie von E29R Mutanten (1,7 pj) signifikant erhöht war. Die ebenfalls konstitutiv geöffnete, aber atinbindungsdefiziente Mutante Δex20 verursachte einen Abfall der gemessenen Deformationsenergie um 50%, und auch die inaktive Vinkulin Konformation der A50I Mutante reduzierte die ausgeübten Traktionskräfte, wie bereits beschrieben, beträchtlich (Diez et al., 2011). Die Zellen mit exprimiertem Vinkulin A50I erreichten nur noch ein Drittel der Deformationsenergie von Rescue Zellen. 2 1,8 1,6 1,4 1, * ,8 0,6 0,4 * 133 * * 132 * * 86 * 307 0,2 0 Abbildung 37: Deformationsenergie der verschiedenen Vinkulin Mutanten in der 2D Traktionsmikroskopie. Die WT, KO und Rescue Zellen (Schwarz) dienen als Kontrolle zum Vergleich mit den Konformations- (Blau) und Phosphorylierungs-Mutanten (simulierte Phosphorylierung in Rot, inhibierte Phosphorylierung in Orange). Aufgetragen sind die Mittelwerte mit Standardfehlern und der Anzahl vermessener Zellen. Die Sternchen zeigen ein Signifikanzniveau von p 0,05 zum Rescue Wert an. 75

81 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Die Tyrosin Mutationen zu Glutaminsäure führten zu einer leichten Erhöhung der Deformationsenergie (1,5 1,6 pj), wohingegen die Mutationen zu Phenylalanin die Zellen drastisch beeinflussten und die Traktionskräfte auf das Niveau der aktinbindungsdefizienten Mutanten (Δex20, A50I) reduzierten (ca. 0,6 pj). Entgegen den Erwartungen beeinflusste die offene Konformation der T12 Mutante die Kraftausübung der Zelle kaum. Dabei war die ursprüngliche Annahme, dass eine dauerhafte Aktivierung des Moleküls die Verbindung von Integrinen über den fokalen Adhäsionskomplex zum Aktinzytoskelett verstärkt und folglich mehr Kräfte auf das Substrat übertragen werden. Eine mögliche Erklärung wäre, dass das Vinkulin Molekül, das in Wildtypzellen zwischen seiner offenen und geschlossenen Konformation wechseln kann, in den fokalen Adhäsionen in ausreichendem Maß geöffnet vorliegt, um alle Bindungspartner abzusättigen. Somit wäre die reguläre Kraftübertragung der Zelle jederzeit gewährleistet und nicht mehr steigerbar durch die Anwesenheit weiterer aktivierter Vinkulin Moleküle im fokalen Komplex. Dafür sprechen Experimente mit FRET-Konstrukten, die gezeigt haben, dass Vinkulin in neu gebildeten Adhäsionen in der offenen Konformation vorliegt, während sich die Konformation in den auflösenden Adhäsionen im retrahierenden Zellende schließt (Chen et al., 2005). Somit würde sich eine dauerhaft geöffnete Proteinkonformation weniger auf die Kraftübertragung, sondern eher auf die Verweildauer von Vinkulin in den fokalen Adhäsionen und die Migrationsgeschwindigkeit der Zelle auswirken. Ein anderer Ansatzpunkt wäre, dass die aufeinander folgenden Punktmutationen in der T12 Mutante eventuell die Bindung zu Aktin oder einem anderen Interaktionspartner im fokalen Komplex beeinträchtigen. Eine frühere Studie belegte durch Präzipitationsversuche von Vinkulin Schwanz- und Kopffragmenten, dass die T12 Mutante (Schwanz) deutlich schlechter an die Kopfdomäne bindet. Betrachtet man allerdings die Daten für die Bindung des T12- Schwanzfragmentes an Aktinfilamente, so sieht man auch dort einen leichten Abfall der prozentualen Bindung im Vergleich zum Wildtyp Protein (Cohen et al., 2005). Darüber hinaus liegen bislang keine Ergebnisse über das Co-Sedimentationsverhalten von Aktin und einem intakten Vinkulin Protein mit den T12 Mutationen vor. Vor kurzem wurde eine neue konstitutiv geöffnete Vinkulin Mutante beschrieben mit den beiden Punktmutationen N773A und E775A, welche nicht in der Aktinbindungsregion der Schwanzdomäne liegen (Thievessen 76

82 ERGEBNISSE UND DISKUSSION et al., 2013). Durch die Wiederholung der Experimente mit dieser neuen Mutante, könnte das Verhalten eines konstitutiv aktivierten Vinkulin Proteins überprüft werden. Die neu eingeführte Punktmutation E29R ergab andere Ergebnisse, als die T12 Mutante. In diesem Fall wiesen die transfizierten Zellen deutlich erhöhte Traktionskräfte auf. Davon ausgehend, dass die Punktmutation in der Kopfdomäne tatsächlich die Interaktion mit der Schwanzdomäne inhibiert und das Vinkulin Protein eine offene Konformation aufweist, könnte dies im Vergleich mit der T12 Mutante nicht die alleinige Ursache für höhere Deformationsenergien sein. Vorausgesetzt die T12 Mutante ist vollständig aktiviert und die Mutationen beeinträchtigen keine der Interaktionen mit Bindungspartnern. Aktuelle MD Simulationen unterstützen die Annahme, dass die Mutation E29R zu einer Aktivierung beiträgt, da die geladenen Glutaminsäure-Reste in dieser Kopfregion laut Simulation an der Bindung zwischen der D1 Domäne und der Schwanzdomäne über Wasserstoffbrückenbindungen beteiligt sind (Golji et al., 2012). Neueste Erkenntnisse lieferten die simulierten Moleküldynamiken über die Bindung zwischen Vinkulin und Aktin. Für Vinkulin in der geöffneten Konformation wurden drei Interaktionsbereiche beobachtet und zwar neben zwei Aktinbindungsregionen in der Schwanzdomäne auch eine zusätzliche Bindung der D1 Domäne durch die Aminosäuren an Position 27, 28 und 29 mit der Oberflächenregion S3 der n-2 Aktinuntereinheit (Golji and Mofrad, 2013). In der geschlossenen Vinkulinkonformation ist diese Bindung durch die Assoziation mit der Schwanzdomäne blockiert (Janssen et al., 2006). Sobald sich jedoch die D1 Domäne von der Schwanzdomäne löst, kann nicht nur die Bindung der Schwanzdomäne an die Aktinfilamente erfolgen, sondern diese wird auch noch zusätzlich durch die Bindung der D1 Domäne an Aktin stabilisiert. Die Ladungsveränderung durch die Punktmutation E29R könnte folglich nicht nur eine konformationelle Aktivierung des Moleküls verursacht haben, sondern auch die Bindung von Vinkulin an die Aktinfasern verstärkt haben, wodurch sich die auf das Substrat übertragenen kontraktilen Kräfte der Zelle erhöhten. Angesichts der diversen Bindungsstellen in der Vinkulin Kopfdomäne für Proteine, die an zellulären Signalkaskaden beteiligt sind, ist es darüber hinaus auch möglich, dass die Punktmutation E29R die Interaktion mit einem anderen Protein (als Aktin) im fokalen Adhäsionskomplex begünstigt, was einen Stimulus für die Kraftentwicklung der Zelle darstellen könnte. 77

83 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Die Traktionskräfte der Zellen und damit die Deformationsenergie sinken, sobald die Anbindung von Vinkulin an die Aktinfasern nicht mehr gegeben ist. Die Mutante Δex20 kann zwar Dank ihrer konstitutiv geöffneten Konformation an viele verschiedene Interaktionspartner im fokalen Komplex, darunter auch Talin, binden, die Assoziation mit dem Aktinzytoskelett ist allerdings defekt. Die Zugänglichkeit für diverse Bindungspartner im offenen Molekül ist dabei ein plausibler Grund für die etwas höheren Deformationsenergien der Δex20 Mutante, verglichen mit der Mutante A50I. Die autoinhibierte, nicht aktivierbare Form der A50I Mutante lokalisiert zwar in den fokalen Adhäsionen, ist dort aber deutlich weniger stabil eingebunden und kann ebenfalls nicht mit dem Aktinnetzwerk interagieren. Die Traktionskräfte dieser Mutante sind beinahe so schwach wie die der KO Zellen (Diez et al., 2011). Wie bereits in früheren Publikationen beschrieben, ist durch den kompletten Verlust von Vinkulin die Kraftübertragung der Zellen zwar massiv geschwächt, sie sind aber dennoch in der Lage zu adhärieren und gewisse, mit der Traktionsmikroskopie messbare Kräfte auf ihre Umgebung auszuüben (Mierke et al., 2010). Vinkulin ist folglich nicht unerlässlich für die Adhäsion. Die Verknüpfung der Integrine mit den Aktinfasern kann, wenn auch mit verminderter Stabilität, von anderen fokalen Proteinen wie z. B. Talin aufrechterhalten werden. Anhand der beiden Mutanten Δex20 und A50I zeigte sich sehr deutlich, dass Vinkulin in seiner aktivierten Form notwendig ist, um die Verbindung des Aktinzytoskeletts mit den fokalen Adhäsionsproteinen und rezeptoren (Integrine) ausreichend zu stabilisieren. Nur durch die beidseitige Bindung von Kopf- und Schwanzdomäne kann Vinkulin seine Funktion als Kraftüberträger erfüllen und die Zelle durch Kontraktion die nötigen Kräfte auf das Substrat ausüben. Betrachtet man nun die Ergebnisse der Phosphorylierungs-Mutanten, so fällt auf, dass die Auswirkungen einer dauerhaften Phosphorylierung gering sind, unphosphorylierte Vinkulin Proteine jedoch die Kraftübertragung signifikant hemmen. Sowohl die einzelnen Mutationen Y100E und Y1065E, als auch die Doppelmutante Y100/1065E führten zu leicht erhöhten Werten der Deformationsenergie, die allerdings nicht signifikant von denen der Rescue Zellen abwichen. Für den Fall, dass die konstitutive Phosphorylierung der Tyrosine eine Aktivierung des Vinkulin Proteins bewirkt, lässt sich diese mit der Methode der 2D Traktionsmikroskopie nicht nachweisen. Schließlich zeigte auch die Konformations-Mutante T12 keine erhöhten Werte. Außerdem wäre es denkbar, dass auch das Wildtyp Protein im fokalen Komplex 78

84 ERGEBNISSE UND DISKUSSION vollständig phosphoryliert vorliegt und sich somit nicht von der Mutante unterscheidet. Ein Trend hinsichtlich stabiler Kraftübertragung durch phosphoryliertes Vinkulin in den fokalen Adhäsionen lässt sich dennoch in diesen Daten erkennen. Mit Sicherheit ausgeschlossen werden kann eine Beeinträchtigung der Zellen aufgrund der Mutation der Tyrosine zu Glutaminsäure. Aufschlussreichere Ergebnisse lieferten die nicht phosphorylierbaren Mutanten Y100F, Y1065F und Y100/1065F. Sobald eine oder mehrere Src-Phosphorylierungsstellen blockiert waren, sanken die von der Zelle ausgeübten Kräfte drastisch ab. Dabei spielte es keine Rolle, ob sich die Mutation in der Kopfdomäne (Y100F) oder in der Schwanzdomäne (1065F) befand. Die Deformationsenergie lag bei den nicht phosphorylierbaren Mutanten bei ca. 0,6 pj, wobei die Doppelmutante den kleinsten Mittelwert aufwies. Aus diesen Werten lässt sich schließen, dass die Funktionalität von Vinkulin ohne die Phosphorylierung nicht gewährleistet ist. Das unphosphorylierte Protein ist nicht in der Lage, die Kraftübertragung in den fokalen Adhäsionen aufrecht zu erhalten, im Gegensatz zum Wildtyp Protein oder den Glutaminsäure Mutanten. Auf welche Weise die Phosphorylierung Vinkulin dabei beeinflusst, ob sie eine konformationelle Öffnung des Moleküls, oder lediglich im aktivierten Zustand eine höhere Bindungsaffinität für Aktin bewirkt, lässt sich durch dieses Experiment nicht abschließend klären Zellsteifigkeit und Bindungsstärke der fokalen Adhäsionen Die Vermessung der Zellen mit dem Magnetic Tweezer gibt weiteren Aufschluss über die mechanischen Eigenschaften der transfizierten Fibroblasten. In diesem Fall werden die Steifigkeit der Zellen und die Bindungsstärke der fokalen Adhäsionen an extrazelluläre Matrixproteine gemessen. Dies geschieht, indem ein Magnetfeld angelegt und damit eine definierte Kraft auf ein mit Fibronektin beschichtetes, über Integrinrezeptoren an die Zelloberfläche gebundenes Bead, ausgeübt wird. Die Auslenkung des Beads wird videomikroskopisch detektiert und lässt zusammen mit der angelegten Kraftstufe Rückschlüsse auf die Steifigkeit der Zelle zu. Sehr steife Zellen lassen sich kaum verformen, während Beads auf der Oberfläche von weichen Zellen im Magnetfeld sehr weit ausgelenkt werden. 79

85 Steifigkeit [nn/µm] Steifigkeit [nn/µm] Steifigkeit [nn/µm] ERGEBNISSE UND DISKUSSION A * Rescue WT T12 E29R Δex20 A50I KO B Rescue Y100E Y1065E Y100/1065E Y100F Y1065F Y100/1065F KO C Kraft [nn] Kraft [nn] * 133 * 118 * 108 * * * Abbildung 38: Steifigkeitsmessungen der verschiedenen Vinkulin Mutanten mit dem Magnetic Tweezer. Die Referenzmessungen für Wildtyp, Rescue und KO Zellen sind in Schwarz dargestellt. In Blau sind die Ergebnisse für die Konformations-Mutanten T12, E29R, Δex20 und A50I gezeigt. Die konstitutive Phosphorylierung wird durch die Mutation von Tyrosin zu Glutaminsäure simuliert (Y100E, Y1065E, Y100/1065E, dargestellt in Rot) bzw. durch die Mutation zu Phenylalanin inhibiert (Y100F, Y10665F, Y100/1065F, dargestellt in Orange). Die Werte für die Steifigkeit der A) Konformations-Mutanten und B) der Phosphorylierungs-Mutanten sind für alle angelegten Kraftstufen aufgetragen. C) Im Balkendiagramm sind die Messwerte der Zellsteifigkeit für alle Mutanten bei einer angelegten Kraft von 6 nn gezeigt. Aufgetragen wurden die Mittelwerte mit Standardfehlern und der Anzahl vermessener Zellen. Die Sternchen zeigen ein Signifikanzniveau von p 0,05 zum Rescue Wert an. In Abbildung 38 A und B sind die Steifigkeitswerte über den korrespondierenden Kraftstufen aufgetragen. Für alle vermessenen Zellen ist eine Versteifung mit zunehmender Kraft zu erkennen, wie sie bereits in der Literatur beschrieben wurde (Kasza et al., 2009; Wang et al., 2001). Während der Erhöhung der Kraft von 1 bis 10 nn steigt die Steifigkeit auf das Zwei- bis Dreifache an. 80

86 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Der Verlauf der Steifigkeitszunahme ist für die unterschiedlichen Vinkulin Mutanten ähnlich, deshalb wurde die Steifigkeit bei einer einzelnen Kraftstufe (6 nn) separat als Balkendiagramm dargestellt (Abb. 38C), um die Daten besser vergleichen zu können. Mit dem Magnetic Tweezer konnten Effekte der Transfektion erneut ausgeschlossen werden, da die transfizierten Rescue Zellen mit 6,9 nn/µm genauso steif waren wie die Wildtyp Zellen. Auch dass Vinkulin die Zellsteifigkeit beeinflusst, konnte nachgewiesen werden. Die Steifigkeit der knock-out Zellen war, wie bereits in früheren Publikationen beschrieben, um die Hälfte reduziert (Mierke et al., 2010). Die konstitutiv geöffnete T12 Mutante veränderte die Steifigkeit der MEFs nicht und auch die Punktmutation E29R zeigte zwar eine leichte Erhöhung, aber keine signifikante Veränderung der Steifigkeit. Im Gegensatz dazu machte die Transfektion mit der Δex20 Mutante die Zellen signifikant weicher. Noch niedrigere Steifigkeitswerte (4,5 nn/µm) wurden bei Zellen mit der geschlossenen A50I Mutante gemessen. Die Mutation von Tyrosin zu Glutaminsäure führte zu einer leichten Erhöhung der Steifigkeit während Zellen, in denen die Phosphorylierung von Vinkulin inhibiert war (Y100F, Y1065F, Y100/1065F), nur etwa halb so steif waren wie Wildtyp Zellen. Die mit dem Magnetic Tweezer gemessene Steifigkeit adhärenter Zellen hängt stark von der Spannung des Zytoskeletts ab (Wang et al., 2002). Umso mehr Kraft eine Zelle auf den Untergrund oder die sie umgebende Matrix ausübt, desto stärker steht das Aktinnetzwerk unter Spannung. Folglich sind Zellen, bei denen in der Traktionsmikroskopie hohe Traktionskräfte zu beobachten waren, auch diejenigen, deren Zytoskelett stark vorgespannt ist und die bei der Kraftapplikation mit dem Magnetic Tweezer hohe Steifigkeiten aufweisen (Fabry et al., 2001; Fabry et al., 2003). Die Resultate aus diesem Experiment sind also geeignet, um die gemessenen Deformationsenergien der verschiedenen Vinkulin Mutanten zu verifizieren. Die offene Konformation der T12 Mutante erhöhte weder die Traktionskräfte noch die Steifigkeit der transfizierten Zellen. Die verstärkte Kraftübertragung durch die E29R Mutante spiegelt sich hingegen auch in erhöhten Steifigkeitswerten dieser Zellen wieder, allerdings sind die Zahlen in diesem Fall nicht signifikant höher als bei Rescue Zellen, was den zuvor in der Traktionsmikroskopie beobachteten Effekt etwas relativiert. Falls die Punktmutation in der Kopfdomäne zu einer vermehrten Kraftübertragung führt, so sollte sich dies auch in gleichem Maße auf die Zellsteifigkeit auswirken. Die niedrigeren Werte für die Deformationsenergie für 81

87 ERGEBNISSE UND DISKUSSION die Mutanten Δex20 und A50I wurden durch die gesunkenen Steifigkeiten bestätigt, die sich aus denselben Gründen ergaben. Für die Phosphorylierungsmutanten ergab sich ebenfalls das gleiche Muster wie zuvor in der Traktionsmikroskopie. Die simulierte Phosphorylierung versteifte die transfizierten Zellen, was bedeutet, dass das Zytoskelett unter erhöhter Spannung steht. Die Inhibierung der Tyrosin-Phosphorylierung wirkte sich allerdings wieder stärker auf die Zellmechanik aus und die Zellen wurden durch die Mutationen zu Phenylalanin beinahe so weich wie Vinkulin knock-out Zellen. Auch in diesem Versuchsaufbau zeigten sich die Effekte bereits in den Einzelmutanten und waren durch die Mutation beider Tyrosine, an Position 100 in der Kopfdomäne und an Position 1065 in der Schwanzdomäne von Vinkulin, kaum noch zu steigern. Während der Messung mit dem Magnetic Tweezer kommt es vor, dass das Bead von der Oberfläche der Zelle abreißt, bevor die Messung abgeschlossen ist. Je höher die Messstufe, das heißt, je höher die applizierte Kraft ist, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass sich das Bead von der Zelle löst und an die Spitze des magnetisierten Stabes gezogen wird. Es wird aufgezeichnet bei welcher Kraftstufe ein Abriss erfolgt. Je stabiler die Bindung des fokalen Adhäsionskomplexes an das Bead ist, desto höher sind die Kräfte, denen sie standhält. Die Abrissdaten stellen somit ein Maß für die Bindungsstärke der Zelle, bzw. der fokalen Adhäsionskomplexe mit den jeweiligen Vinkulin Mutanten, an die Proteine der extrazellulären Matrix dar. 82

88 Abrisse [%] Abrisse [%] Abrisse [%] ERGEBNISSE UND DISKUSSION A * Rescue WT T12 E29R Δex20 A50I KO B Rescue Y100E Y1065E Y100/1065E Y100F Y1065F Y100/1065F KO 5 5 C Kraft [nn] Kraft [nn] Abbildung 39: Abrissdaten aus den Magnetic Tweezer Messungen. Gezeigt sind die prozentualen Abrisse der Beads im Verlauf des für die Steifigkeitsmessung angelegten Kraftprotokolls. Das Farbschema für die Mutanten ist identisch mit dem in Abbildung 38. A) Der Prozentsatz abgerissener Beads für A) die Konformations-Mutanten sowie für B) die Phosphorylierungs-Mutanten steigt mit Erhöhung der angelegten Kraft. C) Entsprechend der dargestellten Ergebnisse für die Zellsteifigkeit wurde die Prozentzahl der abgerissenen Beads bei der gleichen Kraftstufe (6 nn) für alle Mutanten verglichen. Die Zahl über den Balken gibt die Anzahl vermessener Zellen an. In Abbildung 39 A und B ist gezeigt wie hoch die Prozentzahl der Abrisse innerhalb der Messungen bei der jeweiligen Kraftstufe war. Für alle vermessenen Zellen ist der Anstieg der Abrisse mit zunehmender Kraft annähernd linear. Für den direkten Vergleich wurde dieselbe Kraftstufe (6 nn), die bereits für die Steifigkeiten heran gezogen worden war, auch für die abgerissenen Beads im Balkendiagramm (Abb. 39C) dargestellt. Man sieht sehr deutlich, dass die Beads auf den Oberflächen von steifen Zellen fester angebunden sind und höheren Kräften 83

89 ERGEBNISSE UND DISKUSSION standhalten, als auf weichen Zellen. So haben sich bei einer Kraft von 6 nn bei Wildtyp und Rescue Zellen, ebenso wie bei der T12 und der E29R Mutante, lediglich 10% der Beads abgelöst. Bei den etwas weicheren Δex20 Mutanten waren es schon kapp 15% und bei der Transfektion mit der autoinhibierten Vinkulin Mutante A50I rissen bei 6 nn bereits über 20% der Beads ab. In Abbildung 38 zeigte sich, dass die simulierte Phosphorylierung bei den Glutaminsäure Mutanten zu einer leichten Versteifung führte. Auch das spiegelte sich in niedrigen Prozentzahlen bei den Abrissdaten dieser Mutanten wieder. Die Mutation der Tyrosine zu Phenylalanin erhöhte die Anzahl abgerissener Beads bei der angelegten Kraft auf ca. 15%. Somit konnte gezeigt werden, dass nicht nur die Steifigkeit der Zellen nachlässt, sobald Vinkulin nicht phosphoryliert werden kann, sondern auch die Anbindung der fokalen Adhäsionskontakte an Proteine der extrazellulären Matrix, wie z. B. Fibronektin, schwächer wird. Vinkulin muss folglich an beiden Tyrosinen Y100 und Y1065 phosphoryliert werden, um die Spannung, unter der das Aktinzytoskelett steht, aufrecht zu erhalten und die Anbindung des fokalen Adhäsionskomplexes an die EZM zu stabilisieren. Der hier dargestellte Prozentsatz abgerissener Beads ergibt sich aus dem Kraftprotokoll, welches für die Messung der Zellsteifigkeit bei murinen embryonalen Fibroblasten optimiert wurde. Um eine tatsächliche Aussage über die Bindungsstärke des fokalen Adhäsionskomplexes treffen zu können, müsste für jede einzelne Verbindung die nötige Abrisskraft ermittelt werden. In dem durchgeführten Experiment wurden lediglich Kräfte bis 10 nn angelegt, was bei maximal 25% der Zellen zu einem Abriss des Beads führte. Somit ist nicht bekannt wieviel Kraft aufgebracht werden muss, um die stabilste Anbindung eines Beads bei diesen Zellen zu lösen. Außerdem liegt den Daten keine ausreichende Statistik zugrunde, da bei Prozentzahlen von 10% nur etwa zehn abgelöste Beads in die Auswertung eingehen. Um also Genaueres über die Bindungsstärken zu erfahren, müsste ein separates Experiment durchgeführt werden, bei dem keine Kraftstufen, sondern eine kontinuierliche Kraftsteigerung (Rampe) bis zum tatsächlichen Abriss angelegt wird. Ein weiterer Nachteil dieser Auswertungsform ist, dass nicht bekannt ist, an welcher Stelle die Verbindung zum Bead abreißt. Es wäre interessant zu wissen, ob Vinkulin wirklich das schwächste Glied in der Verbindungskette darstellt, oder ob z. B. die Bindung der Integrine an Fibronektin als erstes gelöst wird. Trotz der genannten Schwachstellen ist anhand dieses Versuchsprotokolls mit dem Magnetic Tweezer doch klar ersichtlich, dass die Phosphorylierung der Tyrosine in der 84

90 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Kopf- und Schwanzdomäne von Vinkulin für eine stabile Anbindung des fokalen Adhäsionskomplexes an die umgebende Matrix notwendig ist Austauschdynamik von Vinkulin im fokalen Adhäsionskomplex Mit der Methode des fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) lässt sich die Austauschrate der egfp-markierten Vinkulin Moleküle im fokalen Adhäsionskomplex nachweisen. Auf diese Weise wurde die Stabilität der Anbindung verschiedener Vinkulin Mutanten an Interaktionspartner, wie z. B. Talin, im fokalen Komplex ermittelt. Betrachtet man die Kurven der gemittelten Fluoreszenzintensitäten in Abbildung 40 A, so fällt auf, dass Vinkulin Proteine in der autoinhibierten Konformation schnell ausgetauscht werden, die Fluoreszenzintensität nach dem Bleichen also in kurzer Zeit wieder ansteigt, während bei einer konstitutiv geöffneten Proteinform nur ein langsamer Anstieg zu beobachten ist. Aufgrund der Fit-Parameter für die einzelnen Messkurven konnten diese Unterschiede quantifiziert werden (Abb. 40C). Die Fluoreszenzintensität des egfp-vinkulin Moleküls (Rescue) hatte 66,7 Sekunden nach dem Bleichen die Hälfte des Sättigungswertes (T1/2) in diesem Bereich zurückerlangt. Die Halbwertszeit für die Mutanten T12, E29R und Δex20 war um das Zwei- bis Dreifache erhöht, wohingegen T1/2 für die Mutante A50I mit 21 s deutlich reduziert war. Die Austauschgeschwindigkeiten der Glutaminsäure Mutanten unterschieden sich nicht signifikant vom Wildtyp Protein. Dafür verlief die Erholung der Intensität nach dem Bleichen bei den Phenylalanin Mutanten um ein Drittel schneller als in Rescue Zellen (Abb. 40B+C). 85

91 Halbwertszeit, T 1/2 [s] Norm. Intensität Norm. Intensität ERGEBNISSE UND DISKUSSION A 1,0 0,8 0,6 1 Rescue T12 E29R Δex20 A50I B 1,0 0,8 0,6 1 Rescue Y100E Y1065E Y100/1065E Y100F Y1065F Y100/1065F 0,4 0,4 0,2 0,2 C Zeit [s] * 21 * 21 * Zeit [s] * * * 21 * Abbildung 40: Austauschdynamik der Vinkulin Mutanten in FRAP Experimenten. A+B) Die Mittelwerte der Fluoreszenzintensitäten innerhalb der gebleichten Bereiche sind zum jeweiligen Zeitpunkt aufgetragen. Die Standardfehler sind grau hinterlegt. Die Werte wurden normiert auf die Intensität vor und nach dem Bleichen. In A sind die Kurven der Konformations-Mutanten und in B der Phosphorylierungs- Mutanten gezeigt. C) Aus dem gefitteten Anstieg der Fluoreszenzintensität ergibt sich die Halbwertszeit als Zeitpunkt zudem die Hälfte der Fluoreszenz in der Plateauphase erreicht wurde. Das Diagramm zeigt die Halbwertszeit T1/2 für alle Mutanten. Aufgetragen wurden die Mittelwerte mit Standardfehlern und der Anzahl vermessener Zellen. Die Sternchen markieren einen signifikanten Unterschied zu Rescue Zellen mit p 0,05. Wie bereits von der Gruppe von Susan Craig und anderen gezeigt wurde, ist die Verweildauer von Vinkulin im fokalen Adhäsionskomplex länger, wenn das Protein in einer dauerhaft geöffneten Konformation vorliegt, wie es bei der T12 Mutante der Fall ist (Cohen et al., 2006; Humphries et al., 2007). In der offenen Konformation sind viele Bindungsstellen für Interaktionspartner im fokalen Komplex zugänglich und Vinkulin kann stabil integriert werden. 86

92 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Beziehungsweise ist die Umbaudynamik der fokalen Adhäsionen verzögert, da die Vinkulin Mutante nicht in den autoinhibierten Zustand überführt und somit abgelöst werden kann. Das Gleiche gilt für die Δex20 Mutante, die insbesondere wegen ihrer verzögerten Austauschdynamik als konstitutiv geöffnete Vinkulin Variante eingestuft worden ist (Marg et al., 2010). Die Stabilität und die Langlebigkeit der Bindung von Vinkulin im fokalen Komplex wird in erster Linie durch die Bindung der Kopfdomäne an Talin bestimmt (Humphries et al., 2007). Die Zugänglichkeit der Talin Bindungsstellen ist in den konstitutiv geöffneten Mutanten T12 und Δex20 voll gegeben. Gleichzeitig kann man aus den FRAP Ergebnissen der Δex20 Mutante schließen, dass die Bindung der Schwanzdomäne von Vinkulin an das Aktinzytoskelett keinen entscheidenden Einfluss auf die Proteinkinetik hat, da die Halbwertszeit trotz deletierter Aktinbindungsstellen erhöht war. In anderen Publikationen wurde jedoch gezeigt, dass eine durch Blebbistatin oder Rho Kinase Inhibitor verhinderte Aktin-Myosin-Kontraktilität eine erhöhte Dissoziationsrate von Vinkulin und damit eine schnellere Austauschdynamik im fokalen Kontakt induziert (Lavelin et al., 2013; Wolfenson et al., 2011). Dies könnte folglich die etwas niedrigeren T1/2 Werte der Δex20 Mutante im Vergleich zur T12 Mutante erklären. Allerdings ist die Autauschdynamik der konstitutiv geöffneten und aktinbindungsdefizienten Δex20 Mutante doch deutlich verlangsamt verglichen mit dem Wildtyp Protein und somit dominiert der Effekt der stabilen Vinkulin Integration in den fokalen Kontakt durch Bindung der exponierten Kopfdomäne gegenüber der fehlenden Aktinbindung. Die Aktinbindung spielt hingegen die entscheidende Rolle für die Kraftübertragung in den fokalen Adhäsionen, wie die Traktionskräfte der Zellen gezeigt haben. Auch die Mutante E29R verzögerte die Regeneration der Fluoreszenz nach dem Bleichen. Die signifikant erhöhte Halbwertszeit legt die Vermutung nahe, dass die Punktmutation in der Kopfdomäne tatsächlich eine aktivierende Wirkung auf die Proteinkonformation hat. Zwar ist der Effekt nicht ganz so stark ausgeprägt wie bei der T12 Mutante, aber dennoch scheint die Kopfdomäne mit den Talinbindungsstellen in der E29R Mutante besser und länger zugänglich zu sein oder stabilere Interaktionen einzugehen, als die Kopfdomäne des nicht mutierten Vinkulin Protein. Das andere Extrem stellt die autoinhibierte A50I Mutante dar. Durch diese Punktmutation bleibt das Protein in seiner geschlossenen, inaktiven Form und bindet nur lose im fokalen Komplex. Diese kurzlebigen Bindungen führen zu einer hohen Austauschdynamik und dem 87

93 Mobilitätsverteilung ERGEBNISSE UND DISKUSSION schnellen Ersatz von gebleichten Proteinen, wie wiederholt gezeigt worden ist (Cohen et al., 2006; Marg et al., 2010). Vergleicht man die, selbst bei der Doppelmutante Y100/1065E, nicht signifikant erhöhten Halbwertszeiten der Glutaminsäure Mutanten mit den hohen Werten der T12 Mutante, so muss man schlussfolgern, dass Vinkulin durch Phosphorylierung nicht aktiviert wird. Eine dauerhafte Simulation der Oberflächenladung eines phosphorylierten Moleküls beeinflusste die Austauschdynamik kaum, was bedeutet, dass diese Mutanten nicht dauerhaft in der offenen Konformation vorliegen. Dass die Phosphorylierung die Vinkulin Konformation aber sehr wohl beeinflusst, zeigen die FRAP Daten der Phenylalanin Mutanten. Die signifikant reduzierten Halbwertszeiten, sowohl von den Einzelmutanten (Y100F, Y1065F), als auch von der Doppelmutante (Y100/1065F), sprechen für eine inaktive Proteinform. Sobald eine der beiden Phosphorylierungsstellen blockiert war, konnte das Protein scheinbar nicht mehr vollständig aktiviert werden, die Bindungsregion für Talin in der Kopfdomäne war nicht ausreichend zugänglich und somit konnte Vinkulin nicht stabil in den fokalen Adhäsionskomplex einbinden. Folglich wurden nicht phosphorylierbare Vinkulin Mutanten schneller ausgetauscht. 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% immobile Fraktion Abbildung 41: Mobile und immobile Fraktionen der Vinkulin Mutanten im FRAP Experiment. Die prozentuale Mobilitätsverteilung ist für die einzelnen Mutanten angegeben. Die ausgefüllten Balken, entsprechend dem Farbschema für die Konformations- und Phosphorylierungs-Mutanten, zeigen die Mittelwerte mit Standardfehlern der mobilen Fraktionen dar. Die immobile Fraktion ist jeweils als grau schraffierter Balken darüber aufgetragen. Die Anzahl der Messwerte ist identisch mit der in Abbildung

94 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Die Stabilität der Anbindung von Vinkulin im fokalen Adhäsionskomplex spiegelt sich auch in den mobilen und immobilen Fraktionen des Proteins wieder (Abb. 41). In den durchgeführten FRAP Experimenten wurden erhöhte immobile Fraktionen für die Mutanten T12, E29R, Y100E, Y1065E und Y100/1065E gemessen. Bei der T12 Mutante wurde die Hälfte der gebleichten Moleküle nicht ausgetauscht und auch in den anderen Fällen lag die immobile Fraktion zwischen 40% und 50%. Dieses Ergebnis wiederspricht einer früheren Studie, die eine niedrigere immobile Fraktion für die Mutante Y1065E ermittelt hatte (Kupper et al., 2010). Allerdings gingen in dieser früheren Studie auch lediglich 18 Messwerte in das Ergebnis ein und die einzelnen Kurven der FRAP Messungen streuen sehr stark. Auf Grund der hohen Abweichungen zwischen einzelnen Zellen bzw. verschiedenen fokalen Adhäsionen, sollte überdacht werden, ob zukünftige FRAP Versuche nicht allgemein durch eine bessere Statistik belegt werden sollten, als die bisher in der Literatur üblichen ca. 20 Messwerte. Da die resultierende immobile Fraktion für die Mutante Y1065E in den hier gezeigten Daten kein Einzelwert ist, sondern auch mit dem Trend der anderen nicht phosphorylierbaren Mutanten Y100E und Y100/1065E übereinstimmt, erscheint die Schlussfolgerung glaubhaft, dass die inhibierte Phosphorylierung die immobile Fraktion des Proteins tendenziell erhöht. In allen weiteren Messreihen stieg die Fluoreszenz nach dem Bleichen bis auf ca. 70% ihres Ausgangswertes. Die Tatsache, dass die offene Vinkulin Konformation die immobile Fraktion erhöhte, während die geschlossene Konformation eine ähnliche Mobilitätsverteilung wie der Wildtyp zeigte, entspricht den Ergebnissen aus anderen Publikationen (Cohen et al., 2006). Auch, dass die Δex20 Mutante trotz verlangsamter Austauschdynamik keine erhöhte immobile Fraktion aufweist, wurde bereits beschrieben (Marg et al., 2010). Die erhöhte immobile Fraktion bei der E29R Mutante bestätigte allerdings die Vermutung, dass diese Punktmutation die autoinhibierende Kopf-Schwanz-Bindung des Vinkulin Moleküls verhindert (Auernheimer and Goldmann, 2014b). Obwohl die simulierte Phosphorylierung der Glutaminsäure Mutanten kaum Einfluss auf die Halbwertszeit hatte, zeigen diese Mutanten doch eine dezimierte Fraktion an mobilen, ausgetauschten Proteinen im fokalen Adhäsionskomplex, was zumindest auf vermehrte Interaktionen mit Protein- Bindungspartnern hinweist. Das Verhältnis von mobiler zu immobiler Fraktion entsprach für die Phenylalanin Mutanten dem einer inaktiven, geschlossenen Konformation wie bei der A50I Mutante. 89

95 WT (Glycerin) WT Y100/1065E Y100/1065F WT (Glycerin) WT Y100/1065E Y100/1065F ERGEBNISSE UND DISKUSSION Die bisherigen Ergebnisse sprechen alle dafür, dass die Phosphorylierung für die konformationelle Aktivierung des Vinkulin Moleküls notwendig ist. Da die Austauschdynamik der Glutaminsäure Mutanten in den FRAP Experimenten allerdings nicht der einer konstitutiv geöffneten Proteinkonformation entsprach, muss gefolgert werden, dass die Phosphorylierung allein nicht ausreichend ist für die Aktivierung von Vinkulin. Der Hauptgrund weshalb Phosphorylierung als Aktivierungsmechanismus nach wie vor bestritten wird, sind Experimente die belegen, dass Vinkulin Proteine auch mit simulierter Phosphorylierung nicht mit Aktinfilamenten co-sedimentieren (Zhang et al., 2004; Tolbert et al., 2014). Da andererseits die Aktivierung durch Protein-Bindungspartner sehr wahrscheinlich ist, sollte durch die folgenden Experimente überprüft werden, ob die Phosphorylierung der Tyrosine die Bindung an Interaktionspartner wie Talin und damit die Aktivierung von Vinkulin erleichtert Aktinbindungskapazität der Tyrosin-Mutanten Das Vinkulin Wildtyp Protein sowie die Doppelmutanten Y100/1065E und Y100/1065F wurden in E. coli exprimiert und in vitro aufgereinigt. Die erfolgreich isolierten Proteine wurden in einer SDS-PAGE aufgetragen und auf ihre Reinheit überprüft. Vcl Proteinmenge 1µg 2µg Vinkulin Spur kda Abbildung 42: SDS-Gel der aufgereinigten und auf 2,2 mg/ml aufkonzentrierten Vinkulin Proteine. Die Proteinlösungen wurden nach dem Auftauen durch eine SDS-PAGE kontrolliert. In den Spuren 1+2 bzw. 5+6 sieht man zum Vergleich das WT Protein, das mit bzw. ohne Glycerin eingefroren worden war. In den Spuren 1-4 sind jeweils 1 µg der verschiedenen Vinkulin Mutanten und in den Spuren 5-8 jeweils 2 µg aufgetragen. Abbildung 42 zeigt das Gel mit unterschiedlichen Mengen der aufgereinigten Proteine. Man sieht, dass die Vinkulin Proteine (116 kda) nach den diversen Chromatografieverfahren in guter Qualität vorliegen und fast vollständig von Neben- und Abbauprodukten getrennt worden sind. Das Wildtyp Protein wurde sowohl mit, als auch ohne die Zugabe von Glycerin 90

96 ERGEBNISSE UND DISKUSSION eingefroren. Die Banden 1 und 5 lassen erkennen, dass durch die Zugabe von Glycerin nach dem Auftauen etwas mehr Unreinheiten, das heißt mehr zusätzliche Banden unterhalb der eigentlichen Bande von Vinkulin, im Gel auftreten. Folglich wurde beim Einfrieren der Proteine nach der Aufreinigung auf Glycerin verzichtet. Die Assoziation der Phosphorylierungs-Mutanten an das Aktinzytoskelett wurde in einer Bindungsstudie durch Co-Sedimentation getestet. Im Vorversuch für das Sedimentationsverhalten von Aktin und potenziellen Bindungspartnern wurden das Aktin bindende Protein α-aktinin als Positivkontrolle, sowie das nicht mit Aktin assoziierende Protein BSA, verwendet. α-aktinin BSA Aktin α-aktinin α-aktinin BSA BSA Aktin + Aktin + Aktin Ü P Ü P Ü P Ü P Ü P Spur kda Abbildung 43: SDS-Gel der Kontrollansätze für die Aktinbindung. In Spur 1+2 sind jeweils 10 µl des Aktin-Ansatzes (19 µm) ohne weitere Bindungsproteine aufgetragen. In den Spuren 3+4 ist die Positivkontrolle mit α-aktinin ohne Aktin und in 5+6 mit α-aktinin und der Zugabe von Aktin, sowie in den Spuren 7+8 die Negativkontrolle mit BSA ohne Aktin und in 9+10 mit BSA und der Zugabe von Aktin (jeweils 20 µl) aufgetragen. Von jedem Ansatz wurde der Überstand (Ü) und die resuspendierte Pellet-Fraktion (P) verwendet. Die gelelektrophoretische Auftrennung ergab, dass das G-Aktin (43 kda) im Reaktionsansatz erfolgreich zu F-Aktin polymerisiert ist und sich durch Ultrazentrifugation pelletieren ließ. Wie im reinen Aktin-Ansatz (Abb. 43, Spur 1+2) zu sehen ist, bleibt ein Restanteil an gelöstem Aktin im Überstand zurück. Das liegt in erster Linie an der begrenzten Leistung ( g) der zur Verfügung stehenden Ultrazentrifuge und der Anteil an sedimentiertem Aktin ließe sich vermutlich durch höhere Umdrehungszahlen weiter verbessern. Aber auch unvollständige Polymerisation des G-Aktins in der Lösung, sowie unpräzises Abnehmen des Überstands sind mögliche Fehlerquellen. Der Kontrollversuch mit α-aktinin ergab, dass sich das Verhältnis von α-aktinin im Überstand und im Pellet veränderte, sobald F-Aktin dem Reaktionsansatz zugefügt wurde. In Kombination mit F-Aktin war mehr α-aktinin in der Pelletfraktion 91

97 ERGEBNISSE UND DISKUSSION nachweisbar, wie es für einen Aktinbindungspartner zu erwarten war (vgl. Abb. 43, Spur 4+6). Die Negativkontrolle mit BSA zeigte ebenfalls die erwarteten Banden, da der Großteil dieses nicht an Aktin bindenden Proteins, unabhängig von der Aktinkonzentration im Ansatz, im Überstand zu finden war (vgl. Abb. 43, Spur 7-10). Weitere Kontrollen wurden durchgeführt, indem das Wildtyp Protein sowie die beiden Phosphorylierungs-Mutanten jeweils mit F-Aktin, mit dem Peptid VBS3 oder mit beiden Interaktionspartnern im Reaktionsansatz inkubiert wurden (Abb. 44). Bei dem VBS3 Peptid handelt es sich um die minimale Sequenz im Talin Protein (AS ), die für die Interaktion mit Vinkulin notwendig ist. Es wurde beschrieben, dass Vinkulin Proteine durch die Inkubation mit diesem VBS3 Peptid aktiviert werden konnten, was durch die Co-Sedimentation mit F-Aktin nachgewiesen wurde (Bass et al., 2002). Aus diesem Grund sollten in den hier gezeigten Versuchen niedrige Konzentrationen an VBS3 die Aktivierung der Vinkulin Proteine unterstützen, um einen möglichen Effekt der Phosphorylierung zu verdeutlichen. A Vcl WT / Aktin VBS3 [200µM] Ü P Ü P Ü P Ü P Vinkulin Aktin Spur kda B Vcl Y100/1065E Y100/1065F Aktin VBS3 [200µM] Ü P Ü P Ü P Ü P Ü P Ü P Vinkulin Aktin Spur C kda Abbildung 44: SDS-Gele der Co-Sedimentationsversuche mit den Vinkulin Mutanten und 200 µm VBS3. Gezeigt sind die Proben (5 µl) aus Überstand (Ü) und resuspendiertem Pellet (P) für die Reaktionsansätze A) ohne Vinkulin und mit Wildtyp Protein, B) mit der Y100/1065E Mutante und C) der Y100/1065F Mutante. In den Reaktionen wurden jeweils 4,8 µm Vinkulin mit einem oder beiden Reaktionspartnern (9,5 µm Aktin und/oder 200 µm VBS3) eingesetzt. 92

98 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Für alle drei Vinkulin Formen (WT, Y100/1065E, Y100/1065F) konnte nachgewiesen werden, dass die Zugabe des Peptids VBS3 keine Sedimentation von Vinkulin bei der Ultrazentrifugation verursachte, da in den Reaktionsgemischen ohne Aktin nur eine sehr schwache Bande in der Pelletfraktion zu sehen ist (Abb. 44 A, B, C, jeweils Spur 2), die vermutlich durch unvollständiges Abnehmen des Überstands entstanden ist. Auch an dem Sedimentationsverhalten von F-Aktin änderte die Zugabe des Peptids nichts (vgl. Abb. 44A, Spur 7+8 mit Abb. 43, Spur 1+2). Da die Bande von Vinkulin in der Pelletfraktion aus dem Ansatz mit Aktin (ohne VBS3) etwas stärker ausfällt als im Ansatz ohne Aktin, kann man sagen, dass ein kleiner Anteil des Proteins mit Aktin co-sedimentiert, was auch in anderen Studien bereits beschrieben worden ist (Bass et al., 2002). Diese schwache Bande ist aber für alle untersuchten Vinkulin Proteine identisch (Abb. 44 A, B, C, jeweils Spur 4) und deutet nicht auf eine spezifische Interaktion mit Aktinfilamenten hin. Die Inkubation von Vinkulin mit F-Aktin in Gegenwart von 200 µm VBS3 mit anschließender Ultrazentrifugation bewirkte eine Co- Sedimentation von Vinkulin mit Aktin. In allen Vinkulin Mutanten befanden sich unter diesen Verhältnissen ca. 50% des Proteins im Überstand und 50% im Pellet (Abb. 44 A, B, C, jeweils Spur 5+6). Versuche mit höheren Konzentrationen an VBS3 (500 µm und 1 mm) ergaben, dass die Menge von Vinkulin (WT) in der Pelletfraktion dadurch nicht weiter gesteigert werden kann. Auch in dem in der Literatur beschriebenen Co-Sedimentationsversuch, konnten durch VBS3 Zugabe maximal 50% der Vinkulin Proteine in der Pelletfraktion nachgewiesen werden (Bass et al., 2002). Da bei 200 µm VBS3 im Reaktionsansatz offensichtlich bereits ein Sättigungswert für die aktivierende Wirkung dieses Peptids und damit der Co-Sedimentation von Vinkulin mit F-Aktin erreicht war, wurden im nächsten Schritt verschiedene VBS3 Konzentrationen getestet. Da das Wildtyp Protein nur in begrenzten Mengen zur Verfügung stand, wurde für diesen Vorversuch die nicht-phosphorylierbare Mutante Y100/1065F verwendet. Da das Wildtyp Protein in vitro ebenfalls nicht phosphoryliert wird, sollten die Ergebnisse vergleichbar sein. 93

99 Vinkulin im Pellet Vinkulin im Pellet ERGEBNISSE UND DISKUSSION A VBS3 [µm] Ü P Ü P Ü P Ü P Ü P Ü P Ü P Vinkulin Spur kda Aktin B 60% 50% 40% 30% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% VBS3 Konzentration [µm] 20% 10% 0% VBS3 Konzentration [µm] Abbildung 45: SDS-Gel der Aktinbindungsansätze mit steigender VBS3-Konzentration. In sieben Reaktionsansätzen wurde Vinkulin Y100/1065F (3,8 µm) mit F-Aktin (9,45 µm) und VBS3 in Konzentrationen zwischen 5 und 200 µm inkubiert. A) Je 5 µl des Überstands (Ü) und der Pelletfraktion (P) wurden nach der Ultrazentrifugation in der SDS-PAGE separiert und das Gel mit Coomassie gefärbt. B) Die Intensität der Banden aus A wurde in ImageJ gemessen und der prozentuale Anteil der Gesamtintensität (Vinkulin Banden Ü + P) in der Pelletfraktion für die jeweilige VBS3 Konzentration im Balkendiagramm dargestellt. Der eingesetzte Graph in B veranschaulicht den logarithmischen Anstieg der pelletierten Vinkulinmenge mit steigender VBS3 Konzentration. Durch steigende Konzentrationen des VBS3 Peptids im Reaktionsgemisch nahm der Anteil an sedimentiertem Vinkulin zu (Abb. 45). Die Co-Sedimentation von Vinkulin mit Aktin näherte sich logarithmisch einem maximalen Prozentsatz an und erreichte ab ca. 200 µm VBS3 einen Sättigungswert von ca. 50%. Bei einer Konzentration von 5 µm VBS3 sedimentierte immer noch mehr Vinkulin zusammen mit F-Aktin, als es in Ansätzen ohne das Peptid der Fall gewesen ist. Allerdings lag die aktivierende Wirkung des Bindungspartners bei dieser Konzentration nicht mehr im Sättigungsbereich. Aus diesem Grund wurden die Aktin- Bindungsversuche mit den verschiedenen Vinkulin Mutanten zusammen mit 5 µm VBS3 94

100 ERGEBNISSE UND DISKUSSION wiederholt, um zu überprüfen, ob der geringe (steigerungsfähige) Anteil in der Pelletfraktion durch die Simulation einer Phosphorylierung an Position 100 und 1065 des Vinkulin Moleküls zunimmt. Die Co-Sedimentationsanalyse (Abb. 46 A+C) der Phosphorylierungs-Mutanten von Vinkulin ergab in drei unabhängigen Wiederholungen, dass ohne die Zugabe des Peptids VBS3 nur maximal 10% des Vinkulin Proteins in der Pelletfraktion zu finden sind, unabhängig davon, ob die Tyrosine an den Positionen 100 und 1065 mutiert waren oder nicht. In den Reaktionsansätzen mit einer Zugabe von 5 µm VBS3 zeigte sich, dass während die Bindung des Vinkulin WT Proteins und der Y100/1065F Mutante an F-Aktin nur geringfügig erhöht war (ca. 20% Vinkulin im Pellet), der Anteil an co-sedimentiertem Vinkulin Y100/1065E auf 50% in der Pelletfraktion anstieg. Zum Vergleich wurde nochmals die Aktinbindung aller drei Vinkulin Proteine in Gegenwart von 200 µm VBS3 gezeigt (Abb. 46 B). In Abbildung 46 C sieht man einerseits, dass durch eine hohe VBS3 Konzentration die Aktinbindung von max. 50% aller drei Proteine induziert werden kann und andererseits, dass die beobachtete verstärkte Aktinbindung der phosphomimetischen Mutante Y100/1065E durch die niedrige VBS3 Konzentration von 5 µm bereits der maximalen induzierbaren Co-Sedimentation entspricht. 95

101 Vinkulin im Pellet ERGEBNISSE UND DISKUSSION A Vcl WT WT Y100/1065E Y100/1065E Y100/1065F Y100/1065F VBS3 [5µM] Ü P Ü P Ü P Ü P Ü P Ü P Vinkulin Spur kda Aktin B Vcl WT Y100/1065E Y100/1065F VBS3 [200µM] Ü P Ü P Ü P Vinkulin Aktin Spur kda C 60% 50% kein VBS3 5µM VBS3 200µM VBS3 * 40% 30% 20% 10% 0% Vcl WT Vcl Y100/1065E Vcl Y100/1065F Abbildung 46: Quantitative Analyse der Co-Sedimentation von Vinkulin Mutanten mit F-Aktin. A) Repräsentatives SDS-Gel mit Proben aus Überstand (Ü) und Pellet (P) der Reaktionsansätze mit verschiedenen Vinkulin Mutanten (je 3,8 µm WT, Y100/1065E oder Y100/1065F), jeweils inkubiert mit 9,5 µm F-Aktin ohne bzw. mit 5 µm VBS3. B) SDS-Gel mit Proben aus den Reaktionsansätzen der verschiedenen Vinkulin Mutanten mit 200 µm VBS3. C) Quantitative Auswertung der Banden aus drei unabhängigen Co-Sedimentationsversuchen wie in A (in Grau die Ergebnisse für Reaktionen ohne VBS3 und in orange die Werte mit Zugabe von 5 µm VBS3), aufgetragen zusammen mit den Werten für das Gel gezeigt in B (in Schwarz die Prozentsätze der Reaktionen mit 96

102 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 200 µm VBS3). Die Intensität der Vinkulin Banden wurde in ImageJ ermittelt und der prozentuale Anteil der Gesamtintensität in der Pelletfraktion im Balkendiagramm gezeigt. Aufgetragen wurden die Mittelwerte mit Standardfehlern und das Sternchen markiert einen signifikanten Unterschied zum WT Protein mit p 0,05. Aufgrund der simulierten Phosphorylierung unterschied sich die Mutante Y100/1065E also signifikant von den unphosphorylierten Vinkulin Proteinen WT und Y100/1065F. Eine sehr viel geringere Menge eines im Kopfbereich von Vinkulin bindenden Peptids (VBS3) war offensichtlich ausreichend, um die Konformation der Mutante soweit zu aktivieren, dass die Bindung an Aktinfilamente möglich war. Daraus lässt sich schließen, dass die veränderte Oberflächenladung des phosphorylierten Vinkulin Moleküls eine konformationelle Veränderung, vermutlich durch Abstoßungsreaktionen zwischen der Kopf- und der Schwanzdomäne, bewirkt, welche wiederum zu einer verbesserten Zugänglichkeit der Bindungsstellen für Talin und somit für Aktin führt. Die Phosphorylierung durch die Src-Kinase schafft somit Bedingungen, die die Aktivierung des Vinkulin Proteins begünstigen. 97

103 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 5.2 Einfluss der Serin-Phosphorylierung auf die Funktion von Vinkulin Computergestützte Simulationen der Moleküldynamik ergaben, dass auch eine Serin- Phosphorylierung durch die Kinase PKC an der Aminosäure 1033 eine Lockerung der Kopf- Schwanz-Interaktion bewirken kann und somit zur Aktivierung des Vinkulin Moleküls beitragen könnte (Golji et al., 2012). Auch in vitro wurde die Phosphorylierung des Serin- Restes 1033 durch die PKC nachgewiesen (Ziegler et al., 2002). Um den Einfluss einer Phosphorylierung an dieser Position in vivo zu untersuchen, wurden die beiden Serin Mutanten S1033D und S1033A hergestellt (vgl. Abb. 47). Die Mutation zu Asparaginsäure (D) simuliert eine dauerhafte Phosphorylierung an dieser Position, während der Austausch von Serin zu Alanin die Phosphorylierung inhibiert (Xiang et al., 2008). A S1033D S1033A B Kopf Schwanz S1033D S1033A simulierte Phosphorylierung nicht phosphorylierbar 20µm Abbildung 47: Die Punktmutationen S1033D und S1033A im Vinkulin Protein. A) Position der Mutationen im Vinkulin Molekül. Die Vinkulin Kopfdomäne (AS 1-835) ist über eine prolinreiche Region (schraffierter Bereich) mit der Schwanzdomäne verbunden (AS ), in der die mutierte Aminosäure Serin liegt. Die Mutation zu Asparaginsäure (S1033D in Rot) simuliert eine dauerhafte Phosphorylierung an der Position 1033 und die Mutation zu Alanin (S1033A in Rosa) verhindert die Phosphorylierung an dieser Stelle. B) Konfokale Fluoreszenzaufnahmen der mit den Mutanten S1003D bzw. S1033A transfizierten Vinkulin knock-out Zellen (fixiert mit Paraformaldehyd). Das Aktinzytoskelett ist mit Phalloidin-TRITC gefärbt worden (Rot) und die mutierten Vinkulin Proteine sind an egfp gekoppelt (Grün). Die beiden egfp-markierten Vinkulin Mutanten wurden in knock-out Zellen transfiziert und es wurde eine reguläre Lokalisation der exprimierten Vinkulin Proteine in den fokalen Adhäsionen beobachtet (Abb. 47). Daraufhin wurden die mechanischen Eigenschaften der Zellen in den biophysikalischen Experimenten analysiert. 98

104 S1033A S1033D Deformationsenergie [pj] ERGEBNISSE UND DISKUSSION Kontraktile Kräfte Mithilfe der Traktionsmikroskopie wurden die kontraktilen Kräfte gemessen, welche die transfizierten Zellen auf das Substrat ausüben. Die modifizierte Oberflächenladung in der Schwanzdomäne von Vinkulin, die eine konstitutive Phosphorylierung des Serin-Restes an Position 1033 simuliert, hatte wenig Einfluss auf die Kraftgeneration der Zellen. Die Deformationsenergie der Mutante S1033D unterschied sich nicht signifikant von Rescue Zellen (Abb. 48). Die Inhibierung der Phosphorylierung durch die Vinkulin Mutante S1033A reduzierte hingegen die kontraktilen Kräfte erheblich, auf etwa 60% (0,7 pj) der Kräfte, die in Zellen mit dem Wildtyp Protein (1,29 pj) übertragen wurden. A Hellfeld Fluoreszenz Traktion [kpa] B 1,8 1,6 1, µm ,2 1 0,8 * ,6 0,4 * ,2 0 Abbildung 48: Traktionsmikroskopie der Serin Mutanten. A) Repräsentative Aufnahmen der beiden Mutanten auf den PAA-Gelen. Das Bild auf der linken Seite zeigt eine Hellfeld-Aufnahme der adhärierten Zelle, in der Mitte ist die Fluoreszenzaufnahme der in das Gel eingegossenen Beads unterhalb der Zelle zu sehen und rechts die resultierenden Traktionskräfte. Die gelben Linien markieren die Umrisse der Zellen und der Maßstab entspricht 50 µm. B) Aufgetragen sind die Mittelwerte der Deformationsenergie für Wildtyp und knock-out Zellen (Schwarz), sowie für die S1033D (Rot) und S1033A (Rosa) Mutanten. Die Fehlerbalken geben die Standardfehler und die Zahlen über den Balken die Anzahl vermessener Zellen an. Die Sternchen zeigen ein Signifikanzniveau von p 0,05 zum Rescue Wert an. Die Ergebnisse der Serin Mutanten ähneln stark den Daten für die Tyrosin Mutanten. Die auf das Substrat übertragenen Kräfte der Zellen waren deutlich reduziert, sobald Vinkulin an der Position 1033 nicht phosphoryliert werden kann, vergleichbar mit den Werten für die Deformationsenergie der nicht phosphorylierbaren Tyrosine an Position 100 und Die gemessenen kontraktilen Kräfte deuten daher darauf hin, dass die Phosphorylierung von Serin ebenfalls notwendig ist, um die vollständige Aktivierung von Vinkulin zu ermöglichen. 99

105 Steifigkeit [nn/µm] Abrisse [%] ERGEBNISSE UND DISKUSSION Zellsteifigkeit und Bindungsstärke der fokalen Adhäsionen Der Magnetic Tweezer wurde eingesetzt, um die Steifigkeit der mit den Serin-Mutanten transfizierten Zellen zu bestimmen und damit die Daten aus der Traktionsmikroskopie zu verifizieren. Die Steifigkeit der Mutante S1033D lag bei einer Kraft von 6 nn auf dem Niveau von Rescue Zellen (7 nn/µm) und die Mutante S1033A ergab signifikant weichere Zellen mit 4,6 nn/µm (vgl. Abb. 49A). A * B * 5 * 0 0 Abbildung 49: Zellsteifigkeit und Abrissdaten gemessen mit dem Magnetic Tweezer. A) Die Mittelwerte der Steifigkeit bei 6 nn sind aufgetragen mit den Standardfehlern und der Anzahl vermessener Zellen. Die Sternchen zeigen ein Signifikanzniveau von p 0,05 zum Rescue Wert an. B) Die prozentualen Abrissereignisse bei einer angelegten Kraftstufe von 6 nn sind für die verschiedenen Mutanten gezeigt. Das bedeutet, auch für diese Mutanten trifft zu, dass Zellen die weniger Kräfte auf das Substrat ausüben, auch weniger steif sind. Die Spannung, unter der das Zytoskelett steht und die maßgeblich die gemessene Zellsteifigkeit definiert, ist also durch die nicht phosphorylierbare Vinkulin Mutante S1033A reduziert. Während für die Zellsteifigkeit signifikante Unterschiede gemessen werden konnten, ist die Anzahl vermessener Zellen nicht ausreichend um eine Aussage über die Bindungsstärke der fokalen Adhäsionen zu treffen. Der Prozentsatz, der während der Messung abgerissenen Beads, war in beiden Serin Mutanten leicht erhöht, im Vergleich zu Rescue Zellen (Abb. 49B). Dieser Wert bezieht sich allerdings auf ca. 3-4 abgelöste Beads, ist somit nicht repräsentativ und könnte auch durch zufällig ausgewählte Beads mit minderwertiger Oberflächenbeschichtung zustande gekommen sein Austauschdynamik von Vinkulin im fokalen Adhäsionskomplex Eine unvollständige Aktivierung von Vinkulin durch die inhibierte Phosphorylierung an Position 1033, welche die vorherigen Versuche implizieren, müsste sich auch auf die Bindungsaffinität des Proteins im fokalen Komplex auswirken. Daher wurde die 100

106 Halbwertszeit, T 1/2 [s] Mobilitätsverteilung ERGEBNISSE UND DISKUSSION Austauschdynamik der Serin Mutanten mittels FRAP analysiert. Die Messungen ergaben, dass die Halbwertszeit (T1/2) der S1033D Mutante nur geringfügig erhöht war, die Mutante S1033A allerdings signifikant schneller ausgetauscht wurde als das Wildtyp Protein (vgl. Abb. 50A). A * 24 B 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% immobile Fraktion Abbildung 50: Austauschdynamik der Serin Mutanten in FRAP Experimenten. A) Die Halbwertszeiten (T1/2) für Rescue Zellen im Vergleich zu den S1033D und S1033A Mutanten. Aufgetragen wurden die Mittelwerte mit Standardfehlern und der Anzahl vermessener Zellen. Die Sternchen markieren einen signifikanten Unterschied zu Rescue Zellen mit p 0,05. B) Die Mobilitätsverteilung gibt an wieviel Prozent der ursprünglichen Intensität nach dem Bleichen zurückerlangt werden (mobile Fraktion). Die ausgefüllten Balken zeigen die Mittelwerte der mobilen Fraktionen mit Standardfehlern und die immobile Fraktion ist jeweils als grau schraffierter Balken darüber aufgetragen. Die Erholungswerte der Fluoreszenz nach dem Bleichen ergaben zudem, dass die Mutante S1033D eine erhöhte immobile Fraktion aufweist, während die immobile Fraktion der S1033A Mutante sogar etwas niedriger ist als in Rescue Zellen (vgl. Abb. 50B). Die kurze Halbwertszeit (T1/2) in Kombination mit der erhöhten mobilen Fraktion der nicht-phosphorylierbaren Mutante S1033A sprechen dafür, dass dieses Vinkulin Protein nicht richtig aktiviert werden kann und somit nicht alle Bindungsstellen für Interaktionspartner im fokalen Kontakt zugänglich sind. Die simulierte Phosphorylierung der S1033D Mutante scheint hingegen sehr stabil in den Komplex eingebunden zu sein, da eine höhere immobile Fraktion des Proteins gemessen wurde. Die Ergebnisse der hier angewendeten biophysikalischen Methoden deuten darauf hin, dass die Phosphorylierung der Aminosäure Serin an Position 1033 erforderlich ist, um die vollständige Aktivierung des Vinkulin Moleküls zu gewährleisten. Um nachzuweisen, dass die PKC-Phosphorylierung eine Prädisposition für die Aktivierung darstellt, wäre es auch für diese Vinkulin Mutanten sinnvoll, die Co-Sedimentation mit Aktinfilamenten zu überprüfen. Zunächst ist jedoch noch unklar, ob die entsprechenden Phosphorylierungsstellen in der 101

107 ERGEBNISSE UND DISKUSSION autoinhibierten Vinkulin Konformation für die PKC Kinase zugänglich sind. Der Serin-Rest 1033 liegt sowohl innerhalb der Bindungsregion für die Vinkulin Kopfdomäne, als auch in der Bindungsregion für F-Aktin (Huttelmaier et al., 1997; Miller et al., 2001). Frühe Studien zeigten zudem, dass die Bindung von Talin an Vinkulin die Phosphorylierung durch PKC begünstigt, während die Bindung des Vinkulinschwanzes an F-Aktin die Phosphorylierung unterbindet (Kawamoto and Hidaka, 1984). Weitere in vitro Studien haben ergeben, dass durch die Inkubation von Vinkulin mit sauren Phospholipiden die Phosphorylierungsstelle für PKC im Vinkulin Molekül exponiert wird (Weekes et al., 1996; Ziegler et al., 2002). Auch ist bekannt, dass die Proteinkinase C nach der initialen Adhäsionsphase während des Ausbreitens der Zelle aktiviert und zur Plasmamembran rekrutiert wird (Chun and Jacobson, 1993). Der aktuellen Vorstellung nach, inseriert also der Vinkulinschwanz in die Lipidmembran, wodurch im C-Terminus eine Bindungsstelle zugänglich wird, an welche die Proteinkinase C in Abhängigkeit der Kalziumionenkonzentration bindet und Vinkulin, sowie andere fokale Proteine phosphoryliert (Ziegler et al., 2002). Die hier gezeigten Daten unterstützen die Hypothese, dass die Serin-Phosphorylierung einen der vielfältigen Schritte innerhalb des Aktivierungsprozesses von Vinkulin in den fokalen Adhäsionen darstellt (Auernheimer and Goldmann, 2014a). Weitere Nachweise einer Phosphorylierung durch PKC in vivo sollten erbracht werden, um die Ergebnisse aus in vitro Versuchen zu verifizieren. 102

108 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 5.3 Interaktion von Vinkulin mit p130cas Neben Vinkulin wurde auch das fokale Adhäsionsprotein p130cas (CRK-assoziated substrate) als wichtige Komponente der Kraftübertragung und Signalgebung in fokalen Adhäsionen beschrieben (Defilippi et al., 2006). p130cas (CAS) beeinflusst die Zellmigration, -invasion und die Metastasenbildung und so wird das humane Äquivalent BCAR1 (breast cancer antiestrogen resistance) in Verbindung gebracht mit schlechteren Überlebensraten von Brustkrebspatientinnen (Brinkman et al., 2000; Brabek et al., 2004; Brabek et al., 2005; Honda et al., 1999). Das CAS Protein stellt einen Kraftsensor dar, indem es unter mechanischen Zugkräften und der Ausdehnung seiner Substratdomäne die Phosphorylierung begünstigt, welche wiederum eine Signalkaskade auslöst (Sawada et al., 2006; Tamada et al., 2004; Shin et al., 2004). Phosphoryliert wird p130cas genauso wie Vinkulin durch Kinasen der Src- Familie, was für die Lokalisation des CAS Proteins in den fokalen Adhäsionen relevant ist (Janostiak et al., 2011). Die Proteinstruktur von p130cas beinhaltet eine N-terminale SH3 Domäne (SRC homology 3), eine C-terminale SBD Domäne (Src-binding domain) und eine CCH Domäne (CAS-family C-terminal homology). Im mittleren Sequenzbereich befindet sich die SD Domäne (substrate domain), deren 15 YxxP Motive als Substrat für die Tyrosinkinase fungieren (Fonseca et al., 2004; Huang et al., 2002). Die Tyrosinkinase bindet dabei entweder direkt an die SBD Domäne von p130cas oder indirekt über die Bindung an FAK (Ruest et al., 2001). CAS interagiert über die SH3 Domäne mit FAK, wodurch die Tyrosine der SD Domäne verstärkt phosphoryliert werden (Polte and Hanks, 1995; Harte et al., 1996; Polte and Hanks, 1997). Die SH3 Domäne dient außer für FAK noch für weitere Interaktionspartner als Bindungsstelle (Nakamoto et al., 1997). Kürzlich konnte nachgewiesen werden, dass p130cas über die SH3 Domäne mit Vinkulin interagiert, indem es an die Sequenz PKPP (AS ) in der prolinreichen Region bindet (Janostiak et al., 2014). Die Bindung zu Vinkulin steuert dabei die Lokalisation von p130cas in den fokalen Adhäsionen, wo die beiden Proteine gegenseitig ihre Austauschdynamik beeinflussen (Janostiak et al., 2014; Carisey et al., 2013). Die Bindung von CAS an Vinkulin stabilisiert die Integration beider Proteine im Komplex und verlangsamt damit ihre Dissoziationsrate. Auf Grund dieser Daten wurde vermutet, dass CAS eine stabilisierende Wirkung auf die aktive, offene Konformation des Vinkulin Moleküls ausübt. 103

109 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Die folgenden Versuche sollen Aufschluss darüber geben, welche Auswirkungen die Interaktion der beiden fokalen Adhäsionsproteine Vinkulin und p130cas auf die mechanischen Zelleigenschaften hat. Für die Experimente wurden verschiedene Mutanten verwendet, die entweder durch Punktmutationen im p130cas Protein oder aber im Vinkulin Protein die Bindung der beiden aneinander verhindern. Im CAS Protein wurde die Phosphorylierung des Tyrosin-Restes an Position 12 modifiziert (Janostiak et al., 2011). Von dieser Phosphorylierungsstelle innerhalb der SH3 Domäne wird angenommen, dass sie ausschlaggebend für die Interaktion ist und zwar indem das phosphorylierte p130cas Protein nicht mehr an Vinkulin binden kann (Goldmann, 2014b; Tatarova et al., 2012). Durch die Mutation der Aminosäure Tyrosin zu Glutaminsäure wurde eine dauerhafte Phosphorylierung simuliert (Y12E) und durch den Austausch zu Phenylalanin wurde die Phosphorylierung verhindert (Y12F). Um die Assoziation seitens Vinkulin zu unterbinden, wurde die Vinkulin Mutante PNSS mit drei Punktmutationen an den Positionen eingeführt. Die Aminosäure Lysin wurde zu Asparagin und die beiden Proline zu Serinen mutiert, wodurch die Bindung zu p130cas inhibiert wurde. Die Interaktion mit anderen Bindungspartnern in dieser Region, wie z. B. Arp2/3 und Paxillin, bleibt durch diese Mutationen unbeeinflusst (Janostiak et al., 2014). Die Mutanten CAS Y12E, CAS Y12F sowie das Wildtyp Protein CAS wurden in CAS knock-out MEFs transfiziert und die Mutante Vcl PNSS sowie das Wildtyp Protein Vinkulin in Vinkulin knock-out MEFs. Die transfizierten Zellen wurden jeweils mit den knock-out Zellen verglichen Kontraktile Kräfte Bekanntermaßen ist Vinkulin im fokalen Kontakt erforderlich für die Kraftgeneration adhärenter Zellen und auch von CAS weiß man, dass es die Kontraktilität der Zellen reguliert (Tang and Tan, 2003). Wenn die Interaktion der beiden kraftübertragenden Proteine Vinkulin und CAS gestört ist, ist folglich zu vermuten, dass auch die generelle Kraftübertragung über die fokalen Adhäsionen auf das Substrat beeinträchtigt ist. Die kontraktilen Kräfte der transfizierten Zellen wurden durch Messung der Deformationsenergie in der Traktionsmikroskopie bestimmt. Die Deformationsenergien der CAS WT und CAS Y12F Zellen (1,2 pj) beliefen sich auf ca. das Dreifache der Werte, die für CAS KO und CAS Y12E Zellen (0,4-0,5 pj) gemessen wurden (vgl. Abb. 51 A). 104

110 Deformationsenergie [pj] Deformationsenergie [pj] ERGEBNISSE UND DISKUSSION A 1,6 1, B 1,6 1, ,2 1 1,2 1 * 203 0,8 0,6 0,4 * 32 * 34 0,8 0,6 0,4 * 242 0,2 0,2 0 CAS Rescue CAS Y12F CAS Y12E CAS KO 0 Vcl Rescue Vcl PNSS Vcl KO Abbildung 51: Traktionskräfte der bindungsdefizienten CAS und Vinkulin Mutanten. A) Deformationsenergien der CAS knock-out MEFs transfiziert mit dem WT Protein und den Phosphorylierungs- Mutanten Y12F und Y12E. B) Deformationsenergien der Vinkulin knock-out Zellen transfiziert mit der CASbindungsdefizienten Vinkulin Mutante PNSS. Aufgetragen sind die Mittelwerte mit Standardfehlern und der Anzahl vermessener Zellen. Die Sternchen markieren einen signifikanten Unterschied zu Rescue Zellen mit p 0,05. Auch die Expression der Mutante Vcl PNSS in Vinkulin knock-out Zellen, gezeigt in Abbildung 51B, führte zu signifikant reduzierten Deformationsenergien (0,9 pj) im Vergleich zur Transfektion mit dem Wildtyp Protein (1,3 pj). Diese Daten der Traktionsmikroskopie bestätigen, dass die Bindung von p130cas an Vinkulin die kontraktilen Kräfte der Zellen maßgeblich beeinflusst. Aufgrund der Ergebnisse, die in Zellen mit der Vinkulin PNSS Mutante gemessen worden sind, lässt sich ausschließen, dass der Effekt der CAS Mutanten auf einer Beeinträchtigung der Bindung zwischen der SH3 Domäne und FAK beruht. Die reduzierten Traktionskräfte der CAS und Vinkulin Mutanten können entweder durch verminderte Aktin-Myosin-Kontraktilität oder durch schlechtere Adhäsionsstärke verursacht worden sein (Dey et al., 2011; Wakatsuki et al., 2001) Zellsteifigkeit und Bindungsstärke der fokalen Adhäsionen In weiterführenden Experimenten mit dem Magnetic Tweezer konnte beobachtet werden, dass die Fibronektin beschichteten Beads auf der Zelloberfläche von CAS KO und CAS Y12E Zellen mit der lateralen Kraft im Magnetfeld deutlich weiter ausgelenkt wurden, als auf CAS WT und CAS Y12F Zellen (Abb. 52 A). Berechnet man aus der Auslenkung der Beads die Zellsteifigkeit, dann ergibt sich, dass WT Zellen und die Y12F Mutante bei 6 nn angelegter Kraft um das 1,5fache steifer sind als KO Zellen und die Y12E Mutante (Abb. 52B). Die Bindungsstärke der Integrin-vermittelten Adhäsionen war durch die Mutation an Position

111 Auslenkung [µm] Steifigkeit [nn/µm] Steifigkeit [nn/µm] Abrisse [%] Auslenkung [µm] Steifigkeit [nn/µm] Steifigkeit [nn/µm] Abrisse [%] ERGEBNISSE UND DISKUSSION des CAS Proteins nicht beeinflusst, wie die Abrissdaten in Abbildung 52 C zeigen. Daher ist anzunehmen, dass die verminderte Kraftgeneration in der Traktionsmikroskopie nicht durch instabile Adhäsionen, sondern durch reduzierte Kontraktilität der Zellen verursacht wurde. A B C CAS Rescue (108) 12 CAS Rescue (108) CAS Rescue (108) 3 CAS CAS Y12F Y12F (133) (133) CAS Y12F (133) CAS Y12E Y12E (140) (140) CAS Y12E (140) KO (126) CAS KO (126) 10 CAS KO (126) 2,5 2.5 displacement (µm) 2 1, ,5 0.5 CAS Rescue CAS Y12F CAS Y12E CAS KO time (s) Kraft [nn] Kraft [nn] D E F 8 Vcl Rescue (117) 5 Vcl Rescue (117) Vcl Rescue (117) Vcl PNSS (129) Vcl KO PNSS (105) (129) 7 Vcl PNSS (129) Vcl KO (105) Vcl KO (105) displacement (µm) 2 0, time (s) Kraft [nn] Kraft [nn] * * Vcl Rescue Vcl PNSS Vcl KO * * CAS Rescue (108) CAS Y12F (133) CAS Y12E (140) CAS KO (126) Kraft [nn] Vcl Rescue (117) Vcl PNSS (129) Vcl KO (105) Kraft [nn] Abbildung 52: Mikrorheologische Messungen der bindungsdefizienten CAS und Vinkulin Mutanten. A) Auslenkung der an der Zelloberfläche adhärierten Beads mit zunehmender Kraft (1 nn/s; Start der Kraftapplikation nach 5 s und Beobachtung der Relaxation bis 5 s nach Abschalten des Magnetfeldes). Rescue (Schwarz) und CAS KO Zellen (Grau) im Vergleich zu den CAS Mutanten Y12E (Hellgrün) und Y12F (Dunkelgrün). B) Steifigkeit der verschiedenen transfizierten CAS Zellen über alle Kraftstufen. Das eingefügte Balkendiagramm vergleicht die Zellsteifigkeiten bei 6 nn Kraft. C) Prozentualer Abriss der Beads von den CAS Zellen im Verlauf der Messung. D) Auslenkung der auf Vinkulin Rescue (Schwarz), KO (Grau) oder Vcl PNSS (Blau) Zellen adhärierten Beads. E) Steifigkeit der verschiedenen transfizierten Vinkulin Zellen über alle Kraftstufen. Das eingefügte Balkendiagramm vergleicht die Zellsteifigkeiten bei 6 nn Kraft. F) Prozentualer Abriss der Beads von der Oberfläche der Vinkulin Zellen im Verlauf der Messung. Aufgetragen sind die Mittelwerte mit Standardfehlern und die Zahlen in Klammern geben die Anzahl vermessener Zellen an. Die Sternchen markieren einen signifikanten Unterschied zu Rescue Zellen mit p 0,05. Auch die Vinkulin Mutante PNSS veränderte das Zellverhalten in der mikrorheologischen Messung. Die Beads auf der Oberfläche von Vcl PNSS Zellen wurden stärker ausgelenkt als auf Rescue Zellen (Abb. 52 D), wodurch auch die berechnete Zellsteifigkeit signifikant niedriger war (Abb. 52 E). Über alle Kraftstufen hinweg lag die Steifigkeit der mit der Vcl PNSS Mutante transfizierten Vinkulin Zellen zwischen der von Rescue und KO Zellen. Im Gegensatz zu den CAS Mutanten konnte bei der Vinkulin Mutante auch eine erhöhte Abrissrate der Beads gemessen werden (Abb. 52 F). Die Bindungsstärke der fokalen Adhäsionen war also durch die PNSS Mutation reduziert. Die Interaktion von p130cas und Vinkulin modifiziert offensichtlich die Spannung des Zellzytoskeletts, da die mit den bindungsdefizienten Mutanten Y12E und PNSS transfizierten Zellen weicher waren und die Beads sich leichter auslenken ließen. 106

112 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Die neu identifizierte Interaktion der beiden fokalen Adhäsionsproteine Vinkulin und p130cas bringt weitere Erkenntnisse für das Verständnis der Regulation fokaler Adhäsionen. Die hier gezeigten Ergebnisse der mechanischen Zelleigenschaften legen nahe, dass die Bindung der beiden Proteine aneinander wichtig ist für die Regulation der Kraftübertragung in fokalen Adhäsionen. Vermutlich spielt bei diesem Mechanismus die kraftinduzierte Aktivierung des CAS Proteins und die damit einhergehenden Signalkaskaden, aber auch die Stabilisierung der aktiven Vinkulin Konformation im fokalen Kontakt eine Rolle (Janostiak et al., 2014). 107

113 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 5.4 Vinkulin und die fokale Adhäsionskinase Abgesehen von Vinkulin und p130cas, gehört auch die fokale Adhäsionskinase zu den sowohl strukturell als auch funktionell wichtigen Adhäsionsproteinen. Wie die beiden zuvor besprochenen Proteine reagiert auch FAK auf mechanische Reize aus dem Zellinneren, sowie auf externe Kräfte an der Zelloberfläche. FAK kann die Dynamik der fokalen Adhäsionen über verschiedene Mechanismen, durch direkte oder indirekte Bindung an die transmembranen Integrine, regulieren. Somit steuert die fokale Adhäsionskinase, ebenso wie Vinkulin, die Migration und das invasive Verhalten von Zellen. FAK knock-out Zellen zeigten in den biophysikalischen Experimenten weniger invasives Verhalten in dreidimensionalen Kollagengelen, waren weicher in mikrorheologischen Messungen und übten bei der Traktionsmikroskopie schwächere kontraktile Kräfte auf das Substrat aus, als Wildtyp Zellen (Mierke, 2013; Fabry et al., 2011). Der Einfluss von FAK auf die mechanischen Zelleigenschaften von embryonalen Mausfibroblasten ähnelt folglich stark den Ergebnissen, die für Vinkulin Wildtyp und knock-out Zellen gemessen wurden. Da beide Proteine auf ähnliche Weise die Zellmechanik regulieren, wird spekuliert, ob es möglicherweise Synergieeffekte gibt und die beiden fokalen Adhäsionsproteine sich in ihrer Funktion gegenseitig verstärken, um somit den Phänotyp der Zelle zu definieren und beispielsweise die Invasivität von Krebszellen zu fördern (Mierke, 2013). In diversen Prozessen innerhalb der fokalen Adhäsionen, besonders in der kraftabhängigen Reifung und Verstärkung der Adhäsionen, wurde bereits das Zusammenspiel von Vinkulin, FAK und dem gemeinsamen Bindungspartner Paxillin beschrieben (Dumbauld et al., 2010b; Dumbauld et al., 2010a; Pasapera et al., 2010; Subauste et al., 2004). Hohe Steifigkeit der extrazellulären Matrix fördert die Aktivierung der fokalen Adhäsionskinase in Zellen, was wiederum zur Phosphorylierung von Paxillin und damit zur verstärkten Rekrutierung von Vinkulin in den Kontakt führt (Pasapera et al., 2010) Durotaxis, ein Mechanismus bei der Entstehung von Fibrose? Ein Vorgang bei dem die mechanischen Sensoren der Zelle, also die fokalen Adhäsionsproteine, welche mechanische Reize wahrnehmen und in Signale umsetzen können, von besonders großer Bedeutung sind, ist Durotaxis. Unter Durotaxis versteht man die gerichtete Migration der Zelle hin zu Bereichen mit größerer Steifigkeit der extrazellulären 108

114 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Matrix. Dieser Mechanismus spielt bei der Entwicklung, der Immunreaktion aber vermutlich auch bei der Metastasierung von Tumoren eine Rolle (Guo et al., 2006; Koch et al., 2012a; Mandeville et al., 1997; Wozniak et al., 2003; Ulrich et al., 2009). Zellen müssen in der Lage sein, die zeitlich und örtlich wechselnden Bedingungen in ihrer Umgebung wahrzunehmen, da die mechanische Sensorik auch für Prozesse wie Proliferation, Differenzierung oder Zellpolarisation relevant ist (Janmey and McCulloch, 2007; Engler et al., 2006; Prager- Khoutorsky et al., 2011). Es ist ein bekanntes Phänomen, dass die meisten Zelltypen steifere Substrate bevorzugen. Auf graduell unterschiedlichem Untergrund, migrieren sie in Richtung der höheren Steifigkeit, wo sie besser spreiten, höhere Traktionskräfte ausüben können und folglich auch weniger mobil sind (Lo et al., 2000). Auch für die hier verwendeten embryonalen Fibroblasten trifft dies zu, wie Abbildung 53 zeigt. Die in den folgenden Versuchen verwendeten embryonalen Mausfibroblasten wurden auf unterschiedlich steifen Substraten ausgesät und die Zellsteifigkeit mikrorheologisch gemessen. Nachdem nur einige wenige Zellen (n 19) vermessen wurden, ist ein tendenzieller Anstieg der Zellsteifigkeit mit zunehmender Substratsteifigkeit zwar erkennbar, aber noch nicht signifikant. Ein deutlicher Unterschied in der Zellmorphologie wurde zwischen den Schälchen mit 1,5 kpa und 15 kpa beobachtet. Das 1,5 kpa steife Substrat ist zu weich, als dass die Zellen sich darauf vollständig ausbreiten könnten. Bei 15 kpa hingegen ist die Zellfläche deutlich größer und es ist nur noch wenig Unterschied zu steiferen Substraten, wie den 28 kpa Schälchen zu erkennen. 109

115 Steifigkeit [nn/µm] ERGEBNISSE UND DISKUSSION µm 1,5 kpa 15 kpa 28 kpa Abbildung 53: Steifigkeit und Morphologie von MEFs auf unterschiedlich steifen Substraten. Die Zellen wurden auf Fibronektin beschichteten ESS-Schälchen (Elastically Supported Surface) mit den Steifigkeiten 1,5 kpa, 15 kpa und 25 kpa der Firma Ibidi ausgesät. Mit dem Magnetic Tweezer wurde mikrorheologisch die Zellsteifigkeit ermittelt. Aufgetragen sind die Mittelwerte mit Standardfehlern und die Anzahl vermessener Zellen. Phasenkontrast-Aufnahmen (20x) der Zellmorphologie sind in den Balken der jeweiligen Steifigkeit gezeigt. Der Maßstab beträgt 100 µm. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass die einzelnen fokalen Adhäsionen über fluktuierende Traktionskräfte die Steifigkeit des Substrats erkunden (Plotnikov et al., 2012; Plotnikov and Waterman, 2013). Durch Reduktion der Spannung unter der die FA stehen, entweder indem die ROCK-gesteuerte Myosin Kontraktilität des Zytoskeletts inhibiert wurde, oder durch eine weichere EZM, konnten stabile Adhäsionen wieder dazu gebracht werden in den Tastmodus mit fluktuierenden Traktionskräften überzugehen (Plotnikov et al., 2012; Chan and Odde, 2008). Signalwege über FAK, Paxillin und Vinkulin steuern diesen Vorgang und definieren den Bereich über den die Steifigkeit erprobt wird, bzw. die Adhäsionen und die daran anliegenden Zugkräfte stabil sind. Die Inhibierung jedes einzelnen, dieser drei fokalen Adhäsionsproteine, reduziert die ausgeübten Traktionskräfte und senkt den Schwellenwert der EZM Steifigkeit, ab der die Tastfunktion der fokalen Adhäsionen einsetzt (Plotnikov et al., 2012). Zunehmende Steifigkeit der extrazellulären Matrix wurde sowohl als Ursache, als auch als Folge einer fortschreitenden Fibrose erkannt. Als Fibrose wird eine krankhafte Vermehrung des Bindegewebes in menschlichen und tierischen Geweben und Organen bezeichnet, dessen Hauptbestandteil Kollagenfasern sind. 110

116 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Häufig entsteht Fibrose indem das Gewebe zunächst eine exogene oder endogene Verletzung erfährt, beispielsweise durch Entzündungen (vgl. Abb. 54). Durch die Apoptose epithelialer Zellen werden diverse profibrotische Faktoren, wie z. B. TGFß (transforming growth factor β) freigesetzt. Fibroblasten werden zum Ort der Verletzung rekrutiert, zu Myofibroblasten aktiviert und produzieren daraufhin vermehrt Komponenten der extrazellulären Matrix (Gabbiani, 1981; Chen et al., 1999). Entzündungsreaktion Lymphoidzellen T-Zellen Makrophagen Verletzung des Epithels Zellapoptose profibrotische Faktoren Rekrutierung von Fibroblasten Differenzierung zu Myofibroblasten Neubildung des Epithels EZM-Abbau Apoptose der Myofibroblasten EZM-Produktion Fibrose Lunge Niere Leber Herz Tumor/HIV Abbildung 54: Entstehung von Fibrose durch unkontrollierte Wundheilung. Durch die Verletzung des Epithels wird eine Entzündungsreaktion ausgelöst, welche zur Rekrutierung von Fibroblasten und der Ausschüttung profibrotischer Faktoren führt. Fibroblasten differenzieren daraufhin zu Myofibroblasten, welche Proteine der extrazellulären Matrix sezernieren. Im Falle einer regulären Wundheilung wird überschüssige EZM wieder abgebaut und die nicht mehr benötigten Myofibroblasten sterben ab. Ist dieser Reparaturzyklus gestört, kommt es zur exzessiven Matrix-Produktion und der Versteifung des Gewebes, welche das Krankheitsbild der Fibrose ausmacht (Abbildung nach Vorlage von D. Lagares PhD). Für den Fall, dass die Myofibroblasten nach der Regeneration der Epithelschicht resistent gegen Apoptosesignale sind, oder überdurchschnittlich viele Fibroblasten rekrutiert werden, bildet sich fibrotisches, unkontrolliert wachsendes Gewebe (Jelaska and Korn, 2000). Dabei verhärtet sich das Gewebe und es entsteht eine Vernarbung, die im fortgeschrittenen Stadium zur Einschränkung der jeweiligen Organfunktion führt. Fibrotische Erkrankungen, zu denen die idiopathische Lungenfibrose (IPF) und die Sklerodermie (Verhärtung der Haut und innerer Organe) zählen, haben eine hohe Sterblichkeitsrate, da es bislang kaum pharmazeutisch wirksame Therapieansätze gibt (Katzenstein and Myers, 1998; Varga and Abraham, 2007). 111

117 OCT Masson Trichrom AFM Masson Trichrome ERGEBNISSE UND DISKUSSION Fibrose lässt sich im Mausmodell durch die Verabreichung von Bleomycin stimulieren. Bleomycin wird dabei entweder intratracheal (einmalig), um eine Lungenfibrose zu induzieren, oder subkutan (täglich), zur Bildung fibrotischer Hautpartien, injiziert. Nach ca. 14 Tagen können von den fibrotischen Organen Gewebeschnitte oder auch Einzelzellen entnommen werden. AFM Aufnahmen von fibrotischen Geweben aus verschiedenen Tiermodellen und auch aus Sklerodermie und IPF Patienten, zeigten Steifigkeitsgradienten anstelle gleichmäßig erhöhter Steifigkeit der Proben (Abb. 55). Vermutlich wurde die Fibrose ausgehend von diesen steifen Bereichen initiiert. Einen zusätzlichen Nachweis dieser lokal begrenzten Ausgangspunkte erhöhter Steifigkeit lieferten OCT Aufnahmen (optical coherence tomography). Die Doppelbrechung im OCT steigt mit zunehmender Vernetzung der Kollagenfasern an und deutet daher auf eine hohe Steifigkeit hin (Vakoc et al., 2012). A PBS Bleomycin kpa B 0 PBS Bleomycin Abbildung 55: AFM und OCT Aufnahmen von Gewebeproben aus dem Mausmodell. A) Lungengewebe von mit PBS bzw. Bleomycin behandelten Mäusen. Die oberen Bilder zeigen die histologische Masson-Trichrom-Färbung und darunter sind die Kraftfelder der AFM-Messung gezeigt. B) Hautproben von mit PBS bzw. Bleomycin behandelten Mäusen. Die oberen Bilder zeigen die histologische Masson-Trichrom-Färbung und darunter sind die OCT-Aufnahmen gezeigt. Der Maßstab entspricht 0,5 mm (Die Aufnahmen stammen von D. Lagares PhD). Ein möglicher Mechanismus für das Fortschreiten der Erkrankung ist somit Durotaxis, welcher durch die Gradienten zunehmender Steifigkeit im Gewebe ausgelöst wird. Fibroblasten aus umliegenden weicheren Geweben detektieren die Steifigkeit der extrazellulären Matrix 112

118 ERGEBNISSE UND DISKUSSION mithilfe von mechanischen Sensorproteinen, wie z. B. Vinkulin und FAK, und migrieren in Richtung der fibrotischen Areale. Die umgebende steife Matrix induziert wiederum die Differenzierung der Fibroblasten zu Myofibroblasten. Die ursprünglich lokal begrenzten steifen Bereiche werden somit durch Durotaxis vergrößert. Folglich könnte die Durotaxis von Fibroblasten, bzw. die daran beteiligten Proteine, einen neuen Ansatzpunkt für die Therapie einer Reihe von fibrotischen Erkrankungen bieten Test eines FAK Inhibitors in der Zellkultur Der Wachstumsfaktor TGFß1 wurde als profibrotischer Faktor identifiziert, welcher die Differenzierung von Fibroblasten zu Myofibroblasten induzieren, sowie deren Apoptose unterdrücken kann (Chen et al., 1999; Pannu et al., 2006; Ishida et al., 2006; Lagares et al., 2010; Horowitz et al., 2007). Die TGFß1 induzierte Differenzierung ist dabei abhängig von Signalwegen, die durch Zelladhäsion und die Aktivierung von FAK ausgelöst werden (Thannickal et al., 2003). Die Migration von Fibroblasten zum Ort einer Verletzung ist ein essenzieller Vorgang der Wundheilung. Übermäßige Zellmigration und unkontrollierte Reparaturmechanismen können allerdings zur fibrotischen Akkumulation von Zellen und EZM- Proteinen führen. Fibroblasten aus Hautbiopsien von Sklerodermie Patienten zeigten erhöhte Expressionslevel an FAK, dem fokalen Adhäsionsprotein, das maßgeblich an der Zellmigration beteiligt ist (Mimura et al., 2005). Auch in Fibroblasten von Lungenpatienten konnten erhöhte Proteinmengen an FAK, sowie ein verstärktes Migrationsverhalten nachgewiesen werden, was die Beteiligung dieses Proteins an der Entstehung der Krankheit bestätigte (Lagares et al., 2012; Cai et al., 2010). Durch pharmakologische Inhibierung der fokalen Adhäsionskinase konnte die TGFß1- induzierte Expression profibrotischer Gene, wie z. B. Kollagen TypI und α-sma (alpha smooth muscle actin) reduziert werden (Mimura et al., 2005; Vittal et al., 2005). Auch endogene Mechanismen wurden bereits identifiziert, welche die FAK Aktivität in Myofibroblasten runter regulieren und damit die durch TGFß1 induzierten profibrotischen Signalwege blockieren (Ding et al., 2008; Thomas et al., 2007). Einer der ersten klinisch verfügbaren FAK Inhibitoren ist PF , der bereits in Studien der Phase I bei Krebspatienten eingesetzt worden ist (Roberts et al., 2008). Auch im Mausmodell für Lungenfibrose konnten positive Resultate mit diesem Inhibitor erzielt werden. Die 113

119 ERGEBNISSE UND DISKUSSION fibrotischen Veränderungen des Lungengewebes nach der Bleomycin Injektion konnten durch die Behandlung der Mäuse mit dem FAK Inhibitor unterdrückt werden (Lagares et al., 2012). Da Fibrose in erster Linie eine Versteifung des Gewebes verursacht und somit eine mechanische Eigenschaft betrifft, eignen sich die biophysikalischen Methoden des Magnetic Tweezers und der Traktionsmikroskopie hervorragend, um dieses Krankheitsbild zu charakterisieren. Im Folgenden soll untersucht werden, ob die fibrotischen Veränderungen des Gewebes bereits anhand der Steifigkeit und der kontraktilen Kräfte von Einzelzellen erkannt werden können. Da das fokale Adhäsionsprotein FAK eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Fibrose spielt, wurden zunächst embryonale Mausfibroblasten, von denen eine FAK knock-out Linie existiert, vermessen. Zu diesem Zweck wurden sowohl WT, als auch KO Zellen, auf Zellkulturschälchen bzw. PAA- Gelen für die Traktionsmikroskopie ausgesät und am Tag darauf das Medium durch FCS freies Medium ersetzt. An Tag 3 wurden dem Medium 5 ng/ml TGFß, und für die Ansätze mit Inhibitor zusätzlich 50 nm, 100 nm, oder 300 nm des in DMSO gelösten PF , zugesetzt. An Tag 4 wurden schließlich die Messungen mit den vorbehandelten Zellen durchgeführt. Die Traktionsmikroskopie (Abb. 56) ergab, dass die kontraktilen Kräfte der WT Zellen (3,1 pj) auf ein Vielfaches angestiegen waren durch die Behandlung mit dem Wachstumsfaktor TGFß (13 pj). Der Einfluss auf die FAK KO Zellen war dagegen deutlich geringer. Die Zugabe von 50 nm Inhibitor reduzierte die Wirkung des Wachstumsfaktors beträchtlich (4,5 pj) und durch die doppelte Konzentration an Inhibitor konnte die Deformationsenergie noch weiter gesenkt werden (3,4 pj). Bei 300 nm des FAK Inhibitors im Medium sanken die gemessenen Deformationsenergien sogar bis auf ca. die Hälfte des Ausgangswertes von WT Zellen ohne TGFß Behandlung. Die nur leicht erhöhten Werte der KO Zellen veränderten sich auch durch die Zugabe von 50 nm bzw. 100 nm Inhibitor kaum. Erst die hohe Konzentration von 300 nm des FAK Inhibitors reduzierte die Deformationsenergie der FAK KO Zellen, ähnlich wie bei den WT Zellen, auf ca. die Hälfte der ohne TGFß gemessenen Werte. 114

120 Deformationsenergie [pj] ERGEBNISSE UND DISKUSSION WT KO Abbildung 56: Einfluss des FAK Inhibitors auf MEFs in der Traktionsmikroskopie. Die Deformationsenergie von FAK WT (Hellgrau) und KO Zellen (Dunkelgrau) wurde ohne Behandlung, mit 5 ng/ml TGFß, sowie mit TGFß und verschiedenen Konzentrationen des FAK Inhibitors PF gemessen. Aufgetragen sind die Mittelwerte mit Standardfehlern und die Anzahl vermessener Zellen. Die behandelten Zellen wurden darüber hinaus mikrorheologisch mit dem Magnetic Tweezer vermessen, um festzustellen, ob die Behandlung mit TGFß bereits die einzelnen Fibroblasten versteift und FAK für diesen Vorgang von Bedeutung ist. Die Messungen (Abb. 57) ergaben, dass die Steifigkeit der WT Zellen nach TGFß Behandlung deutlich angestiegen war, was aber bereits durch eine zugesetzte Konzentration von 50 nm des FAK Inhibitors unterdrückt werden konnte. Die mit dem Inhibitor behandelten Zellen wiesen vergleichbare Steifigkeiten auf wie die unbehandelten Zellen. Die Steifigkeit der FAK KO Zellen veränderte sich erneut weder durch die Zugabe von TGFß, noch durch den FAK Inhibitor. Der prozentuale Anteil abgerissener Beads während der Messungen mit dem Magnetic Tweezer zeigte, dass TGFß in WT Zellen auch die Bindungsstärke der fokalen Adhäsionen erhöht. In den TGFß behandelten Zellen lösten sich weniger Beads ab, als in allen anderen Ansätzen. In den FAK KO Zellen konnte ebenfalls eine stabilere Anbindung der Beads nach TGFß Behandlung beobachtet werden, der Effekt war allerdings geringer als in WT Zellen und ebenfalls reversibel durch Zugabe des Inhibitors. 115

121 Abrisse [%] Abrisse [%] Abrisse [%] Abrisse [%] Steifigkeit [nn/µm] Steifigkeit [nn/µm] Steifigkeit [nn/µm] Steifigkeit [nn/µm] ERGEBNISSE UND DISKUSSION A WT (71) WT + TGFß (142) WT + 50nM Inhibitor (92) WT + 100nM Inhibitor (79) WT + 300nM Inhibitor (72) B KO (80) KO + TGFß (183) KO + 50nM Inhibitor (78) KO + 100nM Inhibitor (82) KO + 300nM Inhibitor (73) / TGFß 50nM 100nM 300nM / TGFß 50nM 100nM 300nM Kraft [nn] Kraft [nn] C D / TGFß 50nM 100nM 300nM Kraft [nn] 0 0 / TGFß 50nM 100nM 300nM Kraft [nn] Abbildung 57: Einfluss des FAK Inhibitors auf die Zellsteifigkeit und Bindungsstärke der fokalen Adhäsionen. A) Die Steifigkeit der WT MEFs und B) die Steifigkeit der FAK KO Zellen wurde jeweils ohne (Schwarz) und mit TGFß (Orange), sowie mit TGFß und verschiedenen Konzentrationen an FAK Inhibitor (Blau) mikrorheologisch gemessen. Aufgetragen sind die Mittelwerte mit Standardfehlern über alle Kraftstufen. Die eingesetzten Balkendiagramme zeigen die Steifigkeiten bei 6 nn angelegter Kraft. C) Der prozentuale Anteil abgerissener Beads bei der jeweils angelegten Kraft ist für die WT Zellen und in D) für die KO Zellen gezeigt. Die eingesetzten Balkendiagramme vergleichen wiederum die Abrisse bei der Kraftstufe von 6 nn. Diese Daten geben Aufschluss darüber, wie der Wachstumsfaktor TGFß und der FAK Inhibitor PF auf die mechanischen Zelleigenschaften von Fibroblasten wirken. Es konnte beobachtet werden, dass die fokale Adhäsionskinase tatsächlich eine wichtige Voraussetzung für die Myofibroblastendifferenzierung durch TGFß darstellt, da die FAK knock-out Zellen nach der Behandlung mit dem Wachstumsfaktor weder erhöhte kontraktile Kräfte noch erhöhte Steifigkeiten aufwiesen. Des Weiteren konnte die Wirksamkeit des pharmakologischen FAK Inhibitors bestätigt werden. Bereits die niedrigste der getesteten Konzentrationen wirkte dem durch TGFß induzierten Effekt maßgeblich entgegen und bei einer Konzentration von 100 nm konnte die Wirkung ganz aufgehoben werden, so dass sich die Fibroblasten bezüglich ihrer kontraktilen Kräfte, Zellsteifigkeit sowie Bindungsstärke der fokalen Adhäsionen wie unbehandelte Zellen verhielten. 116

122 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Fibrose im Mausmodell und in Patienten Im nächsten Versuchsansatz wurden Fibroblasten aus dem Maumodell isoliert und mithilfe der Traktionsmikroskopie die kontraktilen Kräfte ermittelt. Für diesen Zweck wurde 6-8 Wochen alten Mäusen intratracheal Bleomycin bzw. PBS (Kontrolle) injiziert und 14 Tage später wurden die Lungen heraus präpariert. Um die Einzelzellen zu gewinnen, wurde das gewaschene Lungengewebe zunächst mechanisch und anschließend enzymatisch zerkleinert und auf Zellkulturschalen ausplattiert. Es wurden Zellen aus zwei Kontrollmäusen und aus zwei mit Bleomycin behandelten fibrotischen Mäusen vermessen. Um zu untersuchen, wie die gesunden und kranken Zellen auf verschiedene Matrixumgebungen reagieren, wurden Polyacrylamidgele mit drei unterschiedlichen Steifigkeiten verwendet. Wie zu erwarten, zeigten die primären Zellen hohe kontraktile Kräfte und die Werte der Deformationsenergie stiegen mit zunehmender Steifigkeit des Substrats an (Abb. 58). Die Messungen der Kontrollzellen ergaben auf 4 kpa steifen PAA-Gelen im Mittel 32,6 pj, auf der mittleren Steifigkeit (12 kpa) 34,5 pj und auf einem steifen Untergrund von 25 kpa wurde eine mittlere Deformationsenergie von 41,1 pj gemessen. Die Zellen aus fibrotischem Lungengewebe zeigten durchgehend höhere Kräfte. Während die gemessene Deformationsenergie auf weichen Gelen (4 kpa) für Bleomycin behandelte Zellen nur um ca. das 1,5fache höher lag als für Kontrollzellen, stiegen die Werte auf den 25 kpa steifen Substraten auf 85,4 pj an und waren somit mehr als doppelt so hoch wie die Ergebnisse der Kontrollzellen. 117

123 Deformationsenergie [pj] ERGEBNISSE UND DISKUSSION Kontrolle 1 Kontrolle 2 Bleomycin 1 Bleomycin kpa 12 kpa 25 kpa Abbildung 58: Kontraktile Kräfte der Fibroblasten aus dem Mausmodell der Lungenfibrose. Es wurden Zellen aus zwei Kontrollmäusen (Blau) und zwei mit Bleomycin behandelten Mäusen (Rot) auf drei unterschiedlich steifen PAA-Gelen (4 kpa, 12 kpa, 25 kpa) vermessen. Aufgetragen sind die Mittelwerte mit Standardfehlern und die Anzahl vermessener Zellen. Die Traktionsmikroskopie ergab somit zum einen, dass Fibroblasten aus fibrotischem Gewebe selbst deutlich kontraktiler sind und größere Kräfte ausüben und nicht nur der Überschuss an Proteinen der extrazellulären Matrix zur Versteifung im Verlauf der Fibrose beiträgt. Zum anderen wurde der interessante Effekt beobachtet, dass die fibrotischen Zellen sensibler auf die Steifigkeit des Substrats reagieren und die Zunahme der kontraktilen Kräfte auf steiferen Substraten größer ist als in Kontrollzellen. Diese Beobachtung könnte die Hypothese der Durotaxis von Fibroblasten als Ausbreitungsmechanismus der Krankheit unterstützen. Die Zellen aus dem Mausmodell wurden auch mikrorheologisch mit dem Magnetic Tweezer vermessen (Abb. 59). Die gemessene Steifigkeit war auch in diesem Fall deutlich höher bei Zellen aus fibrotischen Organen, als bei Zellen aus Mäusen ohne Bleomycin-Behandlung. Über die verschiedenen Kraftstufen hinweg waren die PBS Kontrollzellen nur etwa halb so steif und es lösten sich im Lauf der Messung deutlich mehr Beads von der Zelloberfläche ab. Somit ist auch die Bindungsstärke der fokalen Adhäsionen in Zellen aus fibrotischem Lungengewebe größer. 118

124 Steifigkeit [nn/µm] Abrisse [%] Steifigkeit [nn/µm] Abrisse [%] ERGEBNISSE UND DISKUSSION A 30 B Kontr 1 Kontr 2 Bleo 1 Bleo 2 Kontrolle 1 (52) Kontrolle 2 (56) Bleomycin 1 (54) Bleomycin 2 (90) Kontr 1 Kontr 2 Bleo 1 Bleo Kraft [nn] Kraft [nn] Abbildung 59: Steifigkeit und Bindungsstärke der Zellen aus dem Mausmodell der Lungenfibrose. Die Ergebnisse der Zellen aus den Kontrollmäusen sind in Blau und aus den mit Bleomycin behandelten Mäusen in rot gezeigt. Aufgetragen sind die Mittelwerte der A) Zellsteifigkeit bzw. B) des Prozentsatzes abgerissener Beads mit Standardfehlern für die einzelnen Kraftstufen und die Anzahl vermessener Zellen. Die eingesetzten Balkendiagramme veranschaulichen die Unterschiede der verschiedenen Zellen bei einer angelegten Kraft von 6 nn. Die Anzahl der vermessenen Zellen ist in der Legende mit angegeben. Anhand von Hautbiopsien konnten die Ergebnisse aus Zelllinien und dem Mausmodell auch an humanen Zellen überprüft werden. Die Biopsien stammen von einem gesunden Probanden und von einem Patienten, der an einer diffusen, systemischen Hautsklerose erkrankt ist. Das bedeutet, die Fibrose zeigt eine diffuse, also nicht örtlich begrenzte, Verlaufsform und betrifft auch die inneren Organe. Mithilfe der Traktionsmikroskopie konnten die Deformationsenergien beider Zellproben auf unterschiedlich steifen Substraten gemessen werden. Die Patientenzellen zeigten in allen Versuchsansätzen höhere kontraktile Kräfte als die Kontrollzellen. 119

125 Deformationsenergie [pj] ERGEBNISSE UND DISKUSSION Kontrolle Fibrose kpa 12 kpa 25 kpa Abbildung 60: Kontraktile Kräfte der humanen Fibroblasten aus Hautbiopsien. Es wurden Zellen eines gesunden Probanden (Blau) mit Zellen eines Sklerodermie Patienten (Rot) auf drei unterschiedlich steifen PAA-Gelen (4 kpa, 12 kpa, 25 kpa) verglichen. Aufgetragen sind die Mittelwerte mit Standardfehlern und die Anzahl vermessener Zellen. Der mit den murinen Fibroblasten beobachtete Effekt, dass die Kräfte mit zunehmender Substratsteifigkeit überproportional ansteigen, konnte für diese humanen Zellen allerdings nicht bestätigt werden. Das Verhältnis der Kräfte von Zellen aus gesunden und fibrotischen Geweben bleibt auf weichen (4 kpa) wie auch auf harten (25 kpa) Gelen annähernd unverändert. Mögliche Gründe für die unterschiedlichen Ergebnisse der Zellen aus dem Mausmodell und den humanen Zellen sind vielfältig. Zunächst handelt es sich um zwei unterschiedliche Organe, die murinen Zellen stammen aus der Lunge, während von Patienten nur Hautbiopsien zur Verfügung standen. Allerdings wird angenommen, dass das Prinzip der Durotaxis für die verschiedenen Entstehungsorte der Fibrose gelten sollte und sich das Verhalten der Fibroblasten ähnelt. Die AFM und OCT Messungen werden daher derzeit auch in den unterschiedlichen murinen Organen (Haut, Lunge, Niere) durchgeführt und erste Ergebnisse sprechen dafür, dass die Gradienten an Steifigkeit in allen fibrotischen Geweben vergleichbar sind. Wahrscheinlicher ist die Begründung, dass die humanen Zellen bereits zu lange in Kultur waren, um die erwartete Reaktion auf die Substratsteifigkeit zu zeigen. Die Biopsien wurden in einer Klinik entnommen, die Zellen kultiviert und kryokonserviert. Die hier verwendeten 120

126 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Zellen waren daher zwangsläufig bereits aus einer höheren Passage. Es ist denkbar, dass die Zellen durch die Kultivierung auf regulären Zellkulturschalen aus Plastik sich an diesen sehr steifen Untergrund anpassen und somit nicht mehr so sensibel auf die verschiedenen Gelsteifigkeiten reagieren wie die murinen Zellen, die nur wenige Tage nach der Isolation aus dem weichen Lungengewebe vermessen worden sind. Weitere Versuche mit Patientenzellen, aber auch mit Zellen aus den Mausmodellen, sind daher geplant und die Traktionsmikroskopie sowie auch der Magnetic Tweezer sind hilfreiche Methoden, um schnelle Aussagen über die Kontraktilität bzw. Zellsteifigkeit und damit auch über die potenziell fibrotischen Eigenschaften der Zellen treffen zu können. Mit den biophysikalischen Experimenten konnte gezeigt werden, dass Zellen aus fibrotischen Geweben die Steifigkeit der sie umgebenden extrazellulären Matrix wahrnehmen und darauf reagieren. Es konnten weitere Hinweise erbracht werden, dass Durotaxis ein plausibler Mechanismus für die Ausbreitung der Fibrose im Gewebe ist. Zellen wandern dabei in Regionen höherer Steifigkeit und können dort, wie in der Traktionsmikroskopie gezeigt, höhere Kräfte ausüben. Die extrazelluläre Matrix beeinflusst also, gemeinsam mit Wachstumsfaktoren (z. B. TGFß), die Differenzierung zu Myofibroblasten, welche das Gewebe weiter versteifen und zu einer positiven Rückkopplung beitragen. Immer mehr Studien weisen darauf hin, dass die fokale Adhäsionskinase, die an der Regulation von Adhäsion und Kraftübertragung in den fokalen Kontakten und damit der Durotaxis beteiligt ist, auch bei der Entstehung von Fibrose eine zentrale Rolle spielt. FAK Inhibitoren sollten folglich bei der Behandlung von Fibrose mehrere positive Effekte aufweisen. Durch die Inhibierung von FAK sollte die Signalgebung durch profibrotische Faktoren wie TGFß1 unterbrochen werden, die Differenzierung zu Myofibroblasten verhindert und somit auch die Einwanderung und Apoptose-Resistenz der Kollagen produzierenden Zellen verhindert werden (Lagares and Kapoor, 2013). Vorklinische Versuche ergaben bereits, dass der Inhibitor PF von gesunden Probanden und Krebspatienten gut vertragen wird. Zusammen mit unseren bisherigen Ergebnissen spricht daher alles dafür, dass die Inhibierung von FAK in den nächsten Jahren auch in der klinischen Behandlung von Fibrosepatienten erprobt werden sollte. Ähnliche Mechanismen wie für FAK bezüglich fibrotischer Erkrankungen, wurden für Vinkulin bei der Tumorentstehung beobachtet. Auch in diesem Fall bewirken unterschiedlich steife 121

127 ERGEBNISSE UND DISKUSSION extrazelluläre Umgebungen eine veränderte Signalgebung des Mechanosensors Vinkulin, dessen Aktivität das Tumorwachstum fördert (Rubashkin et al., 2014). Da Vinkulin auch die Durotaxis von Fibroblasten reguliert, wäre es denkbar, dass auch dieses fokale Adhäsionsprotein einen neuen Ansatzpunkt für die weitere Erforschung der Entstehung und Ausbreitung von Fibrose bietet. 122

128 SCHLUSSFOLGERUNG UND AUSBLICK 6 Schlussfolgerung und Ausblick Die Interaktion von Zellen mit ihrer Umgebung ist eine essenzielle Voraussetzung für die Funktionalität von Geweben. Die Regulation von Zell-Zell- sowie Zell-EZM-Adhäsionen durch die daran beteiligten Adhäsionsproteine steuert zahlreiche zelluläre Prozesse, wie beispielsweise die Migration, Genexpression oder Apoptose. Fehlerhafte Regulationsabläufe sind folglich Auslöser verschiedener Krankheiten, inklusive der Tumorentstehung und Fibrose. Die reversible Protein Phosphorylierung ist ein zentraler Vorgang der Zellregulation und ein ubiquitär auftretender Mechanismus der posttranslationalen Modifikation von Proteinen (Kyriakis, 2014). Die Auswirkungen der Phosphorylierung sind vielfältig. Phosphorylierung von VSP (valosin-containing protein) unterbricht beispielsweise die Kopf-Schwanz-Interaktion des Proteins und auch bei Ezrin wird dadurch eine konformationelle Änderung bewirkt, wodurch dessen Aktinbindungsstellen exponiert werden (Madeo et al., 1998; Fievet et al., 2004). Viele der fokalen Adhäsionsproteine, darunter auch FAK, Paxillin, p130cas und Vinkulin werden phosphoryliert und auf diese Weise die Dynamik der fokalen Adhäsionen gesteuert (Ballestrem et al., 2006). Die Phosphorylierung der fokalen Adhäsionskinase steuert beispielsweise deren Lokalisation in den fokalen Komplex (Katz et al., 2003). In Paxillin werden neben Tyrosinen auch Serine während der Zelladhäsion phosphoryliert, was eine wichtige Voraussetzung für die Bindung dieses Proteins an Talin darstellt (Kwak et al., 2012). Es ist daher naheliegend, dass dieser zelluläre Regulationsmechanismus auch bei dem für die Kraftübertragung in den Adhäsionen entscheidenden Protein Vinkulin zum Einsatz kommt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die bislang umstrittene Phosphorylierung tatsächlich einen großen Einfluss auf die Funktion von Vinkulin ausübt. Mithilfe der Traktionsmikroskopie und des Magnetic Tweezers konnte nachgewiesen werden, dass die Phosphorylierung der Tyrosine an Position 100 in der Kopfdomäne und an Position 1065 in der Schwanzdomäne von Vinkulin notwendig ist, um die Kraftübertragung in den fokalen Adhäsionen zu gewährleisten. Transfizierte MEFs mit nicht-phosphorylierbaren Vinkulin Proteinen konnten weniger kontraktile Kräfte aufbringen, waren weicher und wiesen in den mikrorheologischen Experimenten reduzierte Bindungsstärken der fokalen Adhäsionen auf. Die inhibierte Tyrosin-Phosphorylierung erzeugte damit vergleichbare Ergebnisse wie eine inaktive Vinkulin Mutante (A50I) oder eine aktinbindungsdefiziente Mutante (Δex20). In Kombination mit der beschleunigten Austauschdynamik der nicht-phosphorylierbaren Phenylalanin Mutanten in FRAP Experimenten, sprechen diese Ergebnisse für eine 123

129 SCHLUSSFOLGERUNG UND AUSBLICK unvollständige Aktivierung des Moleküls und eine beeinträchtigte Interaktion mit Bindungspartnern. Daraufhin konnte mit den in vitro aufgereinigten Doppelmutanten nachgewiesen werden, dass eine simulierte Phosphorylierung durch die Mutation der Tyrosine zu Glutaminsäure die konformationelle Aktivierung durch die Bindung zu Talin vereinfacht. Bereits geringe Konzentrationen des VBS3 Peptids genügten, um die Co- Sedimentation der Y100/1065E Mutante mit Aktinfilamenten zu induzieren, was eine konformationelle Aktivierung des Vinkulin Moleküls, einhergehend mit der Exposition der Aktinbindungsstellen, impliziert. Darüber hinaus ergaben die biophysikalischen Messergebnisse dieser Arbeit, dass auch die Phosphorylierung des Serin-Restes an Position 1033 im Vinkulin Protein als Voraussetzung für die kraftübertragende Funktion in den Adhäsionen in Betracht zu ziehen ist. Denn auch die nicht-phosphorylierbare Mutante S1033A bewirkte niedrigere kontraktile Kräfte und reduzierte Steifigkeit der transfizierten Zellen, sowie eine schnellere Austauschdynamik der mutierten Vinkulin Proteine im fokalen Komplex. Diese neuen Ergebnisse belegen folglich die wichtige Funktion der Phosphorylierung für die zeitlich regulierte Aktivität von Vinkulin und der damit einhergehenden Steuerung der Kraftübertragung in fokalen Adhäsionen. Allerdings konnte mit Hilfe dieser Versuche noch nicht eindeutig geklärt werden, in welcher Weise die einzelnen Phosphorylierungsstellen im Vinkulin Molekül dazu beitragen. Die Strukturanalyse des Proteins ergab, dass die Position 100 in der Kopfdomäne jederzeit zugänglich ist, während die Position 1065 in der Schwanzregion durch Aminosäuren der prolinreichen Sequenz überlagert wird (Bakolitsa et al., 2004). Dies würde für eine zeitliche Abfolge der Kinaseaktivität sprechen, wonach zunächst die Kopfdomäne und erst nach der konformationellen Aktivierung auch die Schwanzdomäne von Vinkulin phosphoryliert wird. Auch die Computersimulationen der Moleküldynamik ergaben, dass eine Phosphorylierung an Y1065 zwar eine konformationelle Änderung des Proteins bewirkt, diese Phosphorylierungsstelle allerdings nicht an der autoinhibierenden Bindung der D1 Domäne an die Schwanzregion beteiligt ist. Die Aminosäure 1065 liegt nahe am C-Terminus von Vinkulin, daher liegt die Vermutung nahe, dass deren Phosphorylierung die Bindung zu Aktin und PIP2 modifiziert (Golji et al., 2012; Diez et al., 2009). In einer aktuellen Studie wurde zudem vermutet, dass die Phosphorylierung des Vinkulinschwanzes die Bündelung der Aktinfilamente fördert (Tolbert et al., 2014). 124

130 SCHLUSSFOLGERUNG UND AUSBLICK Des Weiteren wurde in Thrombozyten eine konstitutive Vinkulin Phosphorylierung durch die Aktivierung von PMA, ein Aktivator der Proteinkinase C, nachgewiesen. Umgekehrt unterdrückte ein PKC Inhibitor die Ausbreitung der Zellen, sowie die Phosphorylierung an Tyrosin 1065 und auch in Zell-Zell-Kontakten war die Funktion von Vinkulin durch die Inhibierung von PKC gestört (Toullec et al., 1991; Zhang et al., 2004; Perez-Moreno et al., 1998). Eine Hypothese beschreibt daher die Rekrutierung von Vinkulin zur Plasmamembran und die dortige Komplexbildung mit der Proteinkinase C. Durch die Interaktion mit PKC könnte eine Voraussetzung für die weitere Vinkulin Phosphorylierung geschaffen werden (Ziegler et al., 2002). Möglicherweise reguliert PKC auch Src-Kinasen (Niu et al., 2003; Brandt et al., 2002; Brandt et al., 2003) oder umgekehrt (Gschwendt et al., 1994). Eine gegenseitige Regulation der Kinasen innerhalb der Signalkaskaden, die zur Bildung, Stabilisierung oder Auflösung fokaler Adhäsionen führen, ist jedenfalls sehr wahrscheinlich (Tatin et al., 2006). Eine mögliche Modellvorstellung der Vinkulin Aktivierung könnte also folgendermaßen aussehen: Die Phosphorylierung des Tyrosin-Restes 100 durch die Src-Kinase bewirkt eine Lockerung der autoinhibierenden Kopf-Schwanz-Interaktion des Vinkulinmoleküls. Auf Grund dessen können Bindungspartner wie Talin an die Kopfdomäne binden und die Konformationsänderung weiter unterstützen. Die nun zugängliche Schwanzdomäne kann sowohl mit Lipidmembranen interagieren, als auch durch die Kinasen Src und PKC phosphoryliert werden. Durch die zusätzliche Phosphorylierung wird die Bindung an das Aktinzytoskelett gefördert, das Vinkulin Protein vollständig aktiviert und die aktivierte Form darüber hinaus durch die übertragenen mechanischen Zugkräfte stabilisiert. In jedem Fall unterstützen die hier vorgestellten Ergebnisse die Hypothese, dass eine vollständige Aktivierung und Integration von Vinkulin in den fokalen Adhäsionskomplex nur durch Phosphorylierung beider Tyrosine (Y100, Y1065) und vermutlich auch von Serin (S1033) möglich ist. Die bisherigen Zweifel an der Phosphorylierung als Aktivierungsmechanismus können insofern nachvollzogen werden, als dass die gemessenen Daten damit übereinstimmen, dass durch Phosphorylierung allein keine vollständige Aktivierung erzielt werden kann. Das bedeutet, dass Vinkulin nur dort aktiv seine Funktion erfüllen kann, wo die entsprechenden Bindungspartner (z. B. Talin und Aktin) gegenwärtig sind. Diese Form der Aktivierung spiegelt die Rolle von Vinkulin als verstärkender Kraftsensor im fokalen Komplex wieder (Goldmann, 2014a). 125

131 SCHLUSSFOLGERUNG UND AUSBLICK Die Aktivierung von Vinkulin, sowie auch die anderer fokaler Adhäsionsproteine, ist offensichtlich ein durch diverse Kinasen und Phosphatasen hochgradig regulierter Mechanismus. Die Src-Phosphorylierung aktiviert beispielsweise auch p130cas, kann aber auch dessen Bindung zu Vinkulin inhibieren, was die Mechanotransduktion beider Proteine im Komplex stört. Die Phosphorylierung stellt somit einen Regulationsmechanismus mit negativer Rückkopplung dar. Zusätzlich beeinflussen die zahlreichen fokalen Adhäsionsproteine sich gegenseitig und tragen so zur Gesamtfunktion des Kontaktes bei. Der konkrete Einfluss von Adhäsionsproteinen bei der Entstehung von Krankheiten wurde durch die Versuche mit der fokalen Adhäsionskinase in fibrotischen Geweben gezeigt. Auch FAK wird durch Src-Phosphorylierung aktiviert und neben den hier vorgeschlagenen FAK- Inhibitoren für die Behandlung von Patienten werden bereits seit längerem Tyrosinkinase- Inhibitoren in klinischen Studien erprobt. Sowohl bei Krebspatienten, als auch für die Behandlung von Fibrose scheint die Unterdrückung der Protein Phosphorylierung eine vielversprechende Therapie zu sein (Tibes et al., 2005; Mazitschek and Giannis, 2004; Ghosh et al., 2001; Stratowa et al., 1999; Grimminger et al., 2015; Zamecnikova, 2014). Um die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente weiter zu optimieren, die erzielten Resultate zu verifizieren und die Hypothese der Phosphorylierung als Voraussetzung für die konformationelle Aktivierung des Vinkulin Moleküls weiter zu untermauern, wären folgende Versuche von Nutzen. Zunächst könnten Immunfärbungen mit Antikörpern gegen die einzelnen Phosphorylierungsstellen Aufschluss darüber geben, wie hoch der Grad an Phosphorylierung der Vinkulin Moleküle innerhalb der fokalen Adhäsionen ist. Für den Fall, dass das in den Adhäsionen lokalisierte Vinkulin Protein vollständig phosphoryliert ist, würde dies die gemessenen Daten erklären, laut derer die Mutante mit konstitutiv simulierter Phosphorylierung das gleiche Verhalten zeigt wie das Wildtyp Protein. Auch für die Interpretation der Ergebnisse mit den Serin Mutanten wäre es sehr hilfreich zu wissen, inwiefern in vivo eine Phosphorylierung der Serin-Reste im Vinkulin Molekül vorliegt und wie sich diese lokal in der Zelle unterscheidet. Bei der näheren Untersuchung der Serin- Phosphorylierung könnte auch die Position 1045 in Betracht gezogen werden. Der Einfluss der PKC-Phosphorylierung an dieser Aminosäure wurde im Rahmen dieser Arbeit noch nicht untersucht, da die Computersimulationen nur geringfügige Veränderungen der Vinkulin 126

132 SCHLUSSFOLGERUNG UND AUSBLICK Konformation durch ps1045 ergaben. Trotzdem könnte in vivo auch diese Phosphorylierungsstelle eine Rolle spielen. Weitere Erkenntnisse könnten auch aus den mikrorheologischen Messungen mit dem Magnetic Tweezer gewonnen werden. Für den Fall, dass es möglich ist, die an den abgerissenen Beads haftenden Proteine zu analysieren, könnten diese Aufschluss darüber geben an welcher Stelle die Verbindung der Fibronektin beschichteten Beads, über die Integrine und die fokalen Adhäsionsproteine mit dem Aktinzytoskelett, abreißt. Auf diese Weise könnte eventuell eine Aussage darüber getroffen werden, ob das mutierte Vinkulin Protein tatsächlich das schwächste Glied in der Verbindungskette darstellt. Am wichtigsten erscheint aber zunächst die differenzierte Untersuchung der einzelnen Phosphorylierungsstellen hinsichtlich ihrer Funktionsweise. Daher sollte als nächstes Experiment die Co-Sedimentation der Einzelmutanten, und auch die der Serin Mutante, in einer Aktinbindungsstudie analysiert werden. Es wäre interessant zu sehen, ob die konformationelle Aktivierung durch das VBS3 Peptid auch ohne die Phosphorylierung an Position 100 möglich ist, oder ob die Aktin-Bindungskapazität von Vinkulin ohne die Phosphorylierung an der Schwanzdomäne reduziert ist. Darüber hinaus sind weitere Versuche denkbar, um einen dominanten Effekt einer der beiden Tyrosin-Phosphorylierungsstellen zu ermitteln. Die Vinkulin Mutanten Y100E1065F und Y100F1065E wurden bereits hergestellt und können mit den hier vorgestellten Methoden vermessen werden. In diesem Zusammenhang könnte auch die Immunfluoreszenz interessante Ergebnisse über den Phosphorylierungsgrad der Position 1065 in der Einzelmutante Y100F liefern. Eine fehlende Phosphorylierung würde die Hypothese bestätigen, dass im zeitlichen Ablauf die Phosphorylierung der Kopfdomäne notwendig ist, um eine konformationelle Aktivierung zu induzieren und die Schwanzdomäne für Kinasen zugänglich zu machen. Trotz des großen Wissenstandes bezüglich des fokalen Adhäsionsproteins Vinkulin bleiben nach wie vor noch viele Fragen offen und die Regulation und Funktionsweise des Proteins ist noch lange nicht ausreichend verstanden. Die Forschung an fokalen Adhäsionsproteinen, ihrem Zusammenspiel und den diversen Wirkmechanismen bleibt, besonders auch in der dreidimensionalen Umgebung, ein komplexes aber wichtiges Feld um zahlreiche Krankheiten zu verstehen und zukünftig behandeln zu können. 127

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150 ANHANG 8 Anhang 8.1 DNA-Plasmide NheI GCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGGTGAG CAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAG TTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGG CAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGA CCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAA GGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTG AAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACG TCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGC AGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCA CTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACTGGTCCTGCTGGAGTTCGT AflII XhoI XbaI ApaI GACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTCCGGACTCCTTAAGCTCGAGTCTAGAGGGC PmeI CCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTT 145