QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA Nur für In-Vitro Diagnostik CLIA Kompliziertheit: Hoch

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1 QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA Nur für In-Vitro Diagnostik CLIA Kompliziertheit: Hoch Verwendungszweck Das QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA ist ein Enzymimmunassay (ELISA) für den semiquantitativen Nachweis von mitochondrialen Antikörpern, gp210-antikörpern und sp100-antikörpern der IgG- und/oder IgA-Klasse in Humanserum. In Verbindung mit klinischen Befunden und anderen Labortests kann der Nachweis von mitochondrialen, gp210- und sp100-antikörpern bei der Diagnose einer primär biliären Zirrhose helfen. Informationen zum Test Die primär biliäre Zirrhose (PBC) ist eine chronische Lebererkrankung, die sich durch die Zerstörung der kleinen intrahepatischen Gallengänge auszeichnet. Die progressive Zerstörung der Gallengänge führt zu einer zunehmenden Funktionsstörung der Leber und kann mit der Zeit zu Leberversagen führen und eine Lebertransplantation 1,2 erforderlich machen. Die Ätiologie der PBC ist weitgehend ungeklärt, obwohl eine genetische Komponente sowie andere Faktoren eine wichtige Rolle bei der Entwicklung dieser Krankheit 3,4 spielen können. PBC tritt typischerweise in einem Alter zwischen 30 bis 65 Jahren auf und betrifft Frauen häufiger als Männer (geschätztes Verhältnis Frauen: Männer 9:1). 3,4 Die Prävalenz der PBC bei Verwandten ersten Grades von PBC-Patienten liegt zwischen 1,3 bis 6,4 %. 4,5 PBC tritt bei allen Rassen und weltweit auf. Es sind große Abweichungen hinsichtlich der geografischen Prävalenz der PBC bekannt, wobei die Schätzungen von 2 Fällen pro Einwohner in Japan und Australien und bis zu 40 Fällen pro Einwohner in den USA 3,6 ausgehen. Das serologische Kennzeichen von PBC ist der Nachweis von anti-michondrialen Antikörpern (AMA), das bei 90 bis 95 % aller PBC-Patienten vorliegt. Anti-michondriale Antikörper wurden auch bei asymptomatischen Personen mit normalen Leberchemien und normaler Histologie nachgewiesen. Einige dieser Personen werden mit der Zeit an PBC erkranken. 7-9 Die Hauptautoantigene, die von den AMA angezielt werden, sind die E2-Untereinheiten des Pyruvatdehydrogenase-Komplexes (PDC-E2), des Verzweigtketten-2-oxo-Säure-dehydrogenase-Komplexes (BCOADC-E2) und des 2-oxo-Glutarat-dehydrogenase-Komplexes (OGDC-E2). 10 Gershwin und Leung haben ein rekombinantes Antigen (MIT3) entwickelt und patentiert, das die immundominanten Epitope dieser drei Untereinheiten enthält. 11 MIT3-Assays haben die Leistung gegenüber der Assays gesteigert, die für herkömmliche PDC-E2-basierte Assays verwendet werden. 11,12 Zusätzlich zu AMA enthalten ca. 50 bis 72 % der Seren von PBC-Patienten antinukleäre Antikörper (ANA). Zwei ANA-Muster, die speziell mit PBC assoziiert sind, weisen eine Färbung des Kernrands bzw. der Membran des nukleären Porenmembranproteins gp210 und ein multiples nukleäres Punktmuster (MND) des nukleären Körperproteins sp100 auf. Anti-gp210- und Anti-sp100-Antikörper konnten in ca. 25 % der PBC- Patienten nachgewiesen werden und sind hoch PBC-spezifisch. Zudem werden diese Antikörper bei 10 bis 50 % der AMA-negativen PBC-Patienten nachgewiesen und sind ggf. die einzigen PBC-spezifischen Antikörper, die gefunden werden. Obwohl die meisten herkömmlichen Assays nur IgG-AMA Antikörper nachweisen, sind IgA-AMA Antikörper in Serum, Galle, Speichel und Urin der PBC-Personen vorhanden. 13,14 Es wird angenommen, dass dieses Sekretions-Anti-PBC-IgA eine Rolle bei der Pathogenese von PBC spielt. 14 Patienten mit angenommener Autoimmunleberstörung, die nicht alle klassischen Kriterien erfüllen, können eine klinische Herausforderung darstellen. Personen mit AMA-negativer PBC gehören zu dieser Gruppe. Neue Assays zum Nachweis der Antikörper gp210, sp100 und AMA, die ein verbessert sensitives MIT3- Antigen verwenden, reduzierte die Zahl der PBC-Patienten ohne serologischen PBC-Beweis. Das QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA weist Antikörper auf MIT3-, sp100- und gp210-pbc-spezifischen Markern nach. Das Dualspezifizitätskonjugat (IgG/IgA) bietet einen verbesserten Sensitivitätsnachweis von Proben, die bei der Prüfung mit einem monospezifischen (nur IgG) Konjugat schwach oder negativ sind. Die kombinierte Probe mit IgG- und IgA-Antikörpern von MIT3, gp210 und sp100 ist ein Werkzeug zur Prüfung von Personen mit angenommener PBC. Testprinzip Eine Mischung aus affinitätspurifiziertem, rekombinantem Antigen (MIT3), das immundominante Anteile PDC-E2, BCOADC-E2, OGDC-E2, ein purifiziertes Fragment sp100-protein und ein purifiziertes Fragment gp210-protein enthält, wird unter Bedingungen an die Kavitäten einer Polystyren-Mikrotiterplatte gebunden, welche die Antigene in ihrem nativen Zustand erhalten. Die vorverdünnten Kontrollen und die verdünnten Patientenproben werden in separate Mulden gegeben, um den vorhandenen Mitochondrien-, sp100- oder gp210-antikörpern die Möglichkeit zu geben, sich an das immobilisierte Antigen zu binden. Der Rest der Probe/Kontrolle wird durch Waschen entfernt. Enzymmarkiertes anti-humanes IgG/IgA wird in die Kavitäten pipettiert und bindet während einer zweiten Inkubation an den Patienten-Antikörper. Nachdem in einem weiteren Waschschritt das restliche Konjugat entfernt worden ist, wird ein Chromogen-Substrat zugegeben. Die Intensität der entstandenen Farbreaktion wird nach dem Abstoppen mit dem Mikrotiterplatten- Photometer gemessen. Die quantitative Auswertung erfolgt durch einen Vergleich der Extinktionswerte der Patienten mit dem Wert eines Kalibrators. 1

2 Inhalt der Testpackung 1. Mikrotiter-ELISA-Platte beschichtet mit hochgereinigtem PBC Screen antigen (Mischung aus purifizierter/m MIT3, sp100 und gp210 antigens) (12-1 x 8 Kavitäten), mit Streifenhalter in Folienverpackung und Trockenmittel 2. ELISA Negative Kontrolle, 1 Flasche Puffer mit Stabilisator und Humanserum ohne humane Antikörper gegen PBC Screen antigens, gebrauchsfertig vorverdünnt, bereit für den gebrauch, 1,2 ml 3. PBC Screen IgG/IgA ELISA Low Positive (Kalibrator), 1 Flasche Puffer mit Stabilisator und Humanserum mit Antikörpern gegen PBC Screen, gebrauchsfertig vorverdünnt, bereit für den gebrauch, 1,2 ml 4. PBC Screen IgG/IgA ELISA High Positive (positive Kontrolle), 1 Flasche Puffer mit Stabilisator und Humanserum mit Antikörpern gegen PBC Screen, gebrauchsfertig vorverdünnt, bereit für den gebrauch, 1,2 ml 5. HRP Probenverdünner, 1 Flasche rosa gefärbt mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung, Tween 20, Proteinstabilisatoren und Konservierungsmittel, 50 ml 6. HRP Waschkonzentrat, 1 Flasche mit 40fachem Konzentrat rot gefärbt mit gepufferter Kochsalzlösung und Tween 20, 25 ml. Zur Verdünnung bitte das entsprechende Kapitel in der Anleitung beachten. 7. HRP PBC Screen IgG/IgA Konjugat, (Ziege), anti-humanes IgG/IgA 1 Flasche farblos mit Puffer, Proteinstabilisatoren und Konservierungsmittel, 10 ml 8. TMB Chromogen, 1 Flasche mit Stabilisatoren, 10 ml 9. HRP Stopplösung, 0,344M Schwefelsäure, 1 Flasche farblos, 10 ml Hinweise 1. VORSICHT: Probenverdünner, Kontrollen und Konjugat enthalten 0,02% Chloramphenicol. Es ist im US-Bundesstaat Kalifornien und allgemein bekannt, daß dieser Stoff Krebs verursachen kann. 2. Alle Reagenzien für die Herstellung dieses Tests wurden auf Antikörper gegen HIV, HBsAg und HCV getestet und für negativ befunden. Dennoch sollten alle humanen Kontrollen wie potentiell infektiöses Humanserum oder Blutproben behandelt werden NaN 3 wird als Stabilisator verwendet. NaN 3 ist ein Giftstoff und kann bei Einnahme toxische Reaktionen verursachen. Vorsichtig handhaben und Kontakt mit Augen und Haut vermeiden! Den Kontakt mit Metall, basischen Stoffen oder anderen Komponenten, die mit Säure reagieren können, vermeiden. Bei der Entsorgung von Reagenzien ist daher mit viel Leitungswasser nachzuspülen, um Ansammlungen im Abwassersystem zu verhindern. 4. Das HRP Konjugat enthält eine verdünnte Chemikalie, die bei Einnahme toxisch wirken kann. Daher den Kontakt mit Haut und Augen vermeiden. 5. Das TMB Chromogen enthält ein Reizmittel, das bei Inhalation, Einnahme oder Absorbtion durch die Haut gesundheitliche Schäden verursachen kann. Kontakt mit Haut und Augen vermeiden. 6. Die HRP Stopplösung besteht aus verdünnter Schwefelsäure. Den Kontakt mit Basen, Metallen und anderen Stoffen, die mit Säure reagieren können, vermeiden. Schwefelsäure ist ein Giftstoff und kann bei Einnahme toxische Reaktionen hervorrufen. Den Kontakt mit Haut und Augen vermeiden. 7. Die vorgeschriebene persönliche Schutzausrüstung während der Arbeit mit Reagenzien tragen. 8. Verschüttete Reagenzien sofort beseitigen. Bei der Entsorgung von Abfällen alle Umweltvorschriften beachten. Vorsichtsmaßnahmen 1. Dieser Test ist für In-Vitro Diagnostik. 2. Die Verwendung anderer als im Testkit vorhandenen Komponenten kann zu widersprüchlichen Ergebnissen führen. 3. Unvollständiges Waschen und ungenügendes Entfernen der Flüssigkeiten aus den ELISA Kavitäten führt zu einer schlechten Präzision und zu hohen Hintergrund-Extinktionen. 4. Die Adaptation dieses Testsystems auf automatische Probenverarbeitung und andere Instrumentierung, ganz oder teilweise, kann unterschiedliche Ergebnisse zur manuellen Durchführung ergeben. Es liegt in der Verantwortung eines jeden Labors, die automatische Bearbeitung so zu überprüfen, daß Testergebnisse innerhalb akzeptabler Bereiche erzielt werden. 5. Eine Reihe von Faktoren beeinflusst das Testergebnis. Hierzu zählen die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Pipettierung, der Typ des verwendeten Photometers, die Temperatur der Reagenzien, die Umgebungs-Temperatur, die Gründlichkeit des Waschens und der Entfernung der Flüssigkeiten aus den Vertiefungen der ELISA-Streifen, und die Einhaltung der Inkubationszeiten. Es ist deshalb sehr wichtig, für gleichbleibende Bedingungen zu sorgen. 6. Die strikte Einhaltung der Testprozedur wird empfohlen. Jede Änderung im Protokoll erfolgt auf Risiko des Anwenders. 7. Das unvollständige Verschließen der Mikrotiterkavitäten und des Trockenmittels führt zu Antigenabbau und schlechter Präzision. 8. Eine unakzeptabel niedrige Absorption kann beobachtet werden, wenn eine Flasche HRP Konjugat bei zwei- oder mehrfachem Gebrauch über einen längeren Zeitraum benutzt wird. Daher ist es wichtig, die Hinweise zum Umgang mit dem HRP Konjugat genau zu beachten. 2

3 9. Chemische Kontamination des HRP Konjugates kann durch unzureichendes Reinigen oder Spülen der Ausrüstung oder der Instrumente verursacht werden. Rückstände gebräuchlicher Laborchemikalien wie z.b. Formalin, Bleichmittel, Ethanol oder Spülmittel führen zum Abbau des HRP Konjugates im Verlauf der Zeit. Das gründliche Spülen der gesamten Ausrüstung und Instrumentierung nach Verwendung chemischer Reinigungsmittel ist daher unbedingt erforderlich. Lagerung 1. Lagerung aller Kit-Reagenzien bei 2-8 C. Nicht einfrieren. Die Reagenzien sind stabil bis zum Ende des Haltbarkeitsdatums bei vorschriftsmäßiger Lagerung und Handhabung. 2. Nicht verwendete Mikrotiterstreifen wieder in die Originalverpackung geben, luftdicht verschließen und in den Kühlschrank zurücklegen. 3. Der verdünnte Waschpuffer ist bei 2-8 C eine Woche stabil. Proben Die Testdurchführung sollte mit Serumproben erfolgen. Werden Azide oder andere Stabilisatoren zu den Serumproben gegeben, können die Ergebnisse nachteilig beeinflusst werden. Mikrobakteriell kontaminierte, hämolytische, lipämische oder durch Hitzeeinwirkung inaktivierte Proben sollten nicht verwendet werden. Nach der Blutentnahme ist das Serum vom Blut zu trennen. Das CLSI (NCCLS) Dokument H18-A3 empfiehlt die folgenden Lagerungsbedingungen für Patientenproben: 1) Proben bei Raumtemperatur nicht länger als 8 Stunden lagern. 2) Kann die Testdurchführung nicht innerhalb von 8 Stunden erfolgen, die Proben bei 2-8 C kühl lagern. 3) Kann die Testdurchführung nicht innerhalb von 48 Stunden erfolgen ist die Probe bei -20 C oder niedriger einzufrieren. Eingefrorene Proben müssen nach dem Auftauen und vor der Testung gut geschüttelt werden. 16 Testdurchführung In der Testpackung vorhandenes Material 1 PBC Screen IgG/IgA ELISA Mikrotiterplatte (12-1 x 8 Kavitäten), mit Streifenhalter 1 1,2 ml vorverdünnte ELISA Negative Kontrolle 1 1,2 ml vorverdünnte PBC Screen IgG/IgA ELISA Low Positive Kontrolle 1 1,2 ml vorverdünnte PBC Screen IgG/IgA ELISA High Positive Kontrolle 1 50 ml HRP Probenverdünner 1 25 ml HRP Waschkonzentrat, 40faches Konzentrat 1 10 ml HRP PBC Screen IgG/IgA Konjugat (von der Ziege), anti-humanes IgG/IgA 1 10 ml TMB Chromogen 1 10 ml HRP Stopplösung, 0,344M Schwefelsäure Zusätzliches benötigtes Material Pipetten für 5, 100, und 500 µl Einmal-Pipettenspitzen Eppendorf-Reaktionsgefäße für die Serumverdünnung, 4 ml Volumen Distilliertes oder deionisiertes Wasser 1 L Gefäß für verdünntes HRP Waschkonzentrat Reader für Mikrotiterplatten mit 450 nm Filter (und 620 nm für eine bichromatische Messung) Methode Testvorbereitung 1. Alle Reagenzien und Proben auf Raumtemperatur bringen (20-26 o C) und gründlich mischen. 2. Den gesamten Inhalt (25 ml) des Waschkonzentrats mit 975 ml Aqua dest. mischen (1:40 Verdünnung). Die verdünnte Pufferlösung ist bei 2-8 C eine Woche stabil. Soll nicht die gesamte Mikrotiterplatte auf einmal verwendet werden, so können für einen Ansatz von 16 Kavitäten 2 ml Konzentrat mit 78 ml Aqua dest. gemischt werden. 3. Serumproben 1:101 verdünnen, indem 5 µl Serum mit 500 µl gebrauchsfertigem Probenverdünner gemischt werden. Verdünnte Proben sollen innerhalb von 8 Stunden getestet werden. Die PBC Screen IgG/IgA ELISA Low Positive Kontrolle, die PBC Screen IgG/IgA ELISA High Positive Kontrolle und die ELISA Negative Kontrolle nicht verdünnen. 4. Jeder Test benötigt zwei Kavitäten für jede der drei Kontrollen sowie eine oder zwei Kavitäten für die Patientenprobe (Es wird empfohlen, alle Proben in Doppelbestimmung anzusetzen, bis die erforderliche Präzision und Reproduzierbarkeit erreicht sind). Testdurchführung 1. ALLE REAGENZIEN UND PATIENTENPROBEN AUF RAUMTEMPERATUR (20-26 C) BRINGEN. Die entsprechende Anzahl Mikrotiterkavitäten abbrechen. Die Kavitäten im Rahmen befestigen. Die unbenutzten Kavitäten wieder in die Originalverpackung geben, luftdicht verschließen und in den Kühlschrank zurücklegen, um Verdunstung zu minimieren. 2. Je 100 µl der gebrauchsfertigen PBC Screen IgG/IgA ELISA Low Positive Kontrolle, der PBC Screen IgG/IgA ELISA High Positive Kontrolle, der ELISA Negative Kontrolle und der verdünnten Patientenproben in die entsprechenden Kavitäten pipettieren. Streifen abdecken und bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren. Die Inkubationszeit beginnt nach Zugabe der letzten Probe. 3

4 3. Waschen: Den Inhalt aller Kavitäten absaugen. Die Kavitäten vollständig ( µl) mit verdünntem HRP Waschpuffer füllen und dann gründlich absaugen. Diesen Waschschritt noch zweimal wiederholen (Insgesamt: drei Waschschritte). Anschließend die Platte auf saugfähigem Papier ausklopfen, um restliche Waschflüssigkeit zu entfernen. Die Waschschritte sind in der selben Reihenfolge wie die Pipettierschritte durchzuführen μl des HRP PBC Screen IgG/IgA Konjugates in jede Kavität geben. Sterile Pipetten verwenden! Nur das benötigte Volumen an Konjugat aus der Flasche entnehmen. UNBENUTZTES KONJUGAT NICHT IN DIE FLASCHE ZURÜCKPIPETTIEREN. KONTAMINATIONSGEFAHR!! Abgedeckte Streifen bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren, wie in 2. beschrieben. 5. Waschen: Schritt Nr. 3 wiederholen µl TMB Chromogen in jede Kavität geben. 30 Minuten im Dunkeln bei Raum-temperatur inkubieren µl HRP Stopplösung in jede Kavität pipettieren. Bei der Hinzugabe der Stopplösung dieselbe Reihenfolge und Zeitplan wie bei der Hinzugabe des TMB Chromogens einhalten. Die Mikrotiterplatte vorsichtig schütteln. 8. Die optische Dichte (OD) jeder Kavität bei 450 nm innerhalb einer Stunde nach Abstoppen der Reaktion ablesen. Es wird eine bichromatische Messung mit 620 nm als Referenzwellenlänge empfohlen. Qualitätskontrolle 1. Die PBC Screen IgG/IgA ELISA Low Positive Kontrolle, die PBC Screen IgG/IgA ELISA High Positive Kontrolle und die ELISA Negative Kontrolle sollten bei jedem Testansatz mitgeführt werden, um sicher-zustellen, daß alle Reagenzien und der Testansatz insgesamt ordnungsgemäß funktionieren. 2. Da die PBC Screen IgG/IgA ELISA Low Positive Kontrolle, die PBC Screen IgG/IgA ELISA High Positive Kontrolle und die ELISA Negative Kontrolle vorverdünnt sind, entfällt der Verdünnungsschritt der Patientenproben für die Kontrollen. 3. Zusätzliche Kontrollen zur Qualitätssicherung können gemäß den Richtlinien nationaler oder internationaler Regulierungs- oder Akkreditierungsbehörden eingesetzt werden. Geeignete Kontrollen können aus Humanserum gewonnen und bei <-20 C gelagert werden. 4. Um sicher zu sein, daß alle Patientenwerte korrekt sind, müssen die nachfolgenden Kriterien erfüllt werden (Wurden ein oder mehrere Kriterien nicht erfüllt, so ist das Ergebnis als ungültig zu betrachten und der Testansatz ist zu wiederholen). a. Die Absorption der vorverdünnten PBC Screen IgG/IgA ELISA High Positive Kontrolle muß größer sein als die Absorption der vorverdünnten PBC Screen IgG/IgA ELISA Low Positive Kontrolle. Die Absorption der Low Positive Kontrolle wiederum muß größer sein als die der vorverdünnten ELISA Negativkontrolle. b. Die Absorption der vorverdünnten PBC Screen IgG/IgA ELISA High Positive Kontrolle muß größer als 1,0 sein, die Absorption der vorverdünnten Negative Kontrolle darf nicht größer als 0,2 sein. c. Die Absorption der PBC Screen IgG/IgA ELISA Low Positive Kontrolle muß mehr als doppelt so hoch sein wie die der ELISA Negative Kontrolle sein oder über 0,25. d. Die ELISA Negative Kontrolle und die PBC Screen IgG/IgA ELISA High Positive Kontrolle dienen der Sicherstellung der ordnungsgemäßen Funktionsweise des Testansatzes. Die PBC Screen IgG/IgA ELISA High Positive Kontrolle stellt die Präzision am Cut-off des Tests nicht sicher. e. Der Anwender sollte unter anderem das CLSI (NCCLS) Dokument Nr. C24-A2 für zusätzliche Hinweise zur zeitgemäßen Qualitätskontrolle beachten. 17 Berechnung der Ergebnisse Zunächst sind die Mittelwerte der OD für die Doppelbestimmungen zu berechnen. Alle weiteren Berechnungen werden dann mit den entsprechenden Mittelwerten durchgeführt. Die Reaktivität jeder Patientenprobe wird bestimmt durch die Division des Mittelwertes der Proben-OD durch den Mittelwert der Low Positive Kontrolle und der Multiplikation dieses Ergebnisses mit dem chargenspezifischen Wert der PBC Screen IgG/IgA ELISA Low Positive Kontrolle. Die chargenspezifischen Werte sind auf dem Fläschchenetikett aufgedruckt. OD der Probe Probenwert = x PBC Screen IgG/IgA ELISA Low Positive Kontrollwert (Units) PBC Screen IgG/IgA ELISA Low Positive Kontrolle OD Wert (Units) Die Reaktivität verhält sich zur Konzentration der vorhandenen Antikörper nicht linear. Zunahme und Abnahme der Antikörperkonzentrationen von Patienten werden durch einen entsprechenden Anstieg oder Abfall der Reaktivität angezeigt, diese Änderungen sind jedoch nicht proportional (d.h. eine Verdoppelung der Antikörperkonzentration führt nicht zu einer Verdoppelung der Reaktivität). Wird eine genauere Quantifizierung der Patientenantikörper gewünscht, sind serielle Verdünnungen der Probe durchzuführen und der Titer der zuletzt als positiv gemessen wurde, sollte als Patienten-Antikörpertiter bewertet werden. 4

5 Interpretation der Ergebnisse Dieser ELISA-Test ist sehr sensitiv und in der Lage, sogar kleine Unterschiede in Patientenpopulationen zu messen. Die folgenden Werte dienen als Beispiel für die Interpretation der Testergebnisse. Es wird empfohlen, daß sich jedes Labor seine eigenen Normalwerte, basierend auf eigener Technik, Kontrollen, Ausrüstung und Patientenpopulation erarbeitet. Proben werden gemäß der folgenden Tabelle als negativ, fragwürdig oder positiv interpretier: Units Negativ 20 Grenzwertig 20,1 24,9 Positiv >25 Grenzwertige Proben sollten vor der endgültigen Beurteilung nochmals getestet werden. 1. Ein positives Ergebnis zeigt das Vorhandensein von anti-gastrischen Parietalzell PBC Screen Antikörpern einschließlich der Perniziösen Anämie. 2. Ein negatives Ergebnis zeigt den Nichtnachweis von Antikörpern gegen Mitochondrien, gp210 und sp100 bzw. eine Konzentration unterhalb des negativen Abschnitts des Assays an. 3. Proben mit positivem Ergebnis können auf den Nachweis von einzelnen MIT3-, gp210- und sp100- Antikörpern mit speziellen MIT3-, gp210 und sp100-elisa-assays geprüft werden. 4. Eine Probe mit fragwürdiger Antikörperkonzentration kann hinsichtlich des Antikörperstatus nicht beurteilt werden. Es wird daher empfohlen, den Test auf einer frischen Probe bzw. zu einem späteren Zeitpunkt erneut durchzuführen. 5. Wir schlagen vor, die Laborergebnisse mit folgendem Hinweis zu versehen: Die folgenden Ergebnisse wurden mit dem INOVA QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA erzielt. PBC Screen IgG/IgA Werte, die mit Testsystemen anderer Hersteller ermittelt wurden, können nicht untereinander ausgetauscht werden. Die Höhe des gefundenen IgG/IgA-Titers kann nicht mit einem Endpunkttiter in Korrelation gebracht werden. Grenzen des Verfahrens 1. Immunkomplexe oder andere Immunoglobulin-Aggregate im Patientenserum können nichtspezifische Bindungen und falsch-positive Ergebnisse hervorrufen. 2. Nicht alle primär biliären Zirrhose-Patienten sind antikörperpositiv zu den beim PBC Screening verwendeten Antigenen. 3. Ergebnisse dieses Testes müssen im Zusammenhang mit klinischen Ergebnissen und anderen serologischen Tests verwendet werden. 4. Die Leistungscharakteristika für andere Untersuchungsmaterialien als Serum wurden nicht bestimmt. Erwartungswerte Normalbereich 520 asymptomatische, gesunde Personen mit Wohnsitz in den Vereinigten Staaten von Amerika wurden mit dem QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA getestet. Daten zu Alter und Geschlecht waren bei 307 Probanden verfügbar. Das Alter lag zwischen 18 bis 78 Jahren, und die Gruppe setzte sich aus 150 Männern und 157 Frauen zusammen. Der Durchschnittswert für diese Population lag bei 6,6 Einheiten und der Medianwert lag bei 4,6 Einheiten. Die Spezifität des Assays lag bei 98,1 % (510/520) für normale Testpersonen. Von 10 positiven Proben zeigten, 7 eine Reaktion auf das M2 EP(MIT3)IgG-ELISA und 1 Probe reagierte auf M2 EP(MIT3)IgA-Antikörper. Spezifische Leistungscharakteristika Klinischen Studien Insgesamt 440 PBC-Patienten und 769 Nicht-PBC-Patienten, von denen 520 normal und gesund waren, wurden von dem QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA getestet, um die Spezifität und Sensitivität des Tests zu bewerten. Die Proben mit bekannten AMA-negativem PBC bzw. Patienten mit angenommener, aber unbestätigter Krankheit, sowie AIH-Patienten wurden nicht in die Bewertung mit einbezogen. Die PBC- Gruppe (440) schloss Proben von 426 Personen mit nachgewiesener PBC und von 14 mit AIH/PBC- Überschneidung ein. Die Nicht-PBC-Gruppe enthielt Proben von 520 gesunden Kontrollen und Proben von Personen mit viraler Hepatitis (HBV bzw. HCV) (149), PSC (48), Nicht-PBC- Lebererkrankung (23) und infektiösen bzw. anderen Autoimmunerkrankungen (29). Die Durchschnitts- und Medianwerte der Nicht-PBC- Gruppe lagen bei 8,1 bzw. 5,3 Einheiten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Table 1: Spezifitä und Sensitivität of QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA N=1209 n pos equiv neg PBC Gruppe Nicht-PBC Gruppe Sensitivität: 95,9% (422/440); 95% Konfidenzintervall (CI): 93,6% to 97,6% Spezifität: 96,1% (739/769); 95% CI: 94,5% to 97,4% Allgemeine Übereinstimmung (fragwürdige Ergebnisse wurden als negativ betrachtet): 96,0% (1161/1209) 5

6 Vergleich mit gleichartigen Produkten Das QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA wurde mit dem Einzeltest-QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) ELISA, dem QUANTA Lite TM gp210 ELISA und dem QUANTA Lite TM sp100 ELISA verglichen. Insgesamt 1209 Proben (440 klinische PBC, 249 Nicht-PBC und 520 aysmptomatische, gesunde Personen) wurden mit dem PBC-Screening und den Einzeltest-QUANTA Lite MIT3-, sp100- bzw. gp210 ELISAs getestet. Einzeln QUANTA Lite Test N=1209 Positiv Grenzwertig* Negativ Positiv QUANTA Lite PBC Grenzwertig* Screen IgG/IgA ELISA Negativ *Fragwürdige Ergebnisse wurden nicht in die Analyse aufgenommen Die Positiv-Übereinstimmung und Negativ-Übereinstimmung wurde durch den Vergleich der Ergebnisse aus dem PBC-Screening mit den Ergebnissen der jeweiligen Einzelassays vorgenommen. Positiv Übereinstimmung (unspezifische Ergebnisse ausgeschlossen) = 99,5% (437/439) Negativ Übereinstimmung (unspezifische Ergebnisse ausgeschlossen) = 98,9% (730/738) Übereinstimmung insgesamt (unspezifische Ergebnisse ausgeschlossen): = 99,2% (1167/1177) Kreuzreaktivitätsstudien Zur Beurteilung der Assayspezifität wurden Seren von 463 Patienten mit Nicht-PBC-Lebererkrankungen (213 AIH-1, 48 PSC, 10 AIH/PSC, 8 AIC, 9 kryptogene Hepatitis, 11 VBDS, 3 AIH-2, 11 alkoholische Lebererkrankung, 1 drogeninduzierte Hepatitis, 71 HBV und 78 HCV) und von 29 Patienten mit Autoimmunoder Infektionskrankheit (7 H.pylori, 3 ASCA, 4 ANA, 3 ttg, 2 GPA, 2 GBM und 8 CMV) mit dem QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA getestet. In der Autoimmun- und Infektionskrankheitsgruppe (29 Patienten) interpretierte das PBC-Screening nur eine CMV-positive Probe als positiv (34,4 Einheiten). Bei diesem Patienten konnte eine schwache nukleäre und zytoplasmische IFA-Färbung nachgewiesen werden, jedoch keines der PBC-Antigenmuster. In der Nicht-PBC-Lebergruppe mit 463 Patienten wurden vom PBC- Screening 53 Patienten als positiv angezeigt. 42 der 53 positiven Patienten zeigten eine geringe Reaktion auf einen oder mehrere Einzeltests, während 9 Patienten auf alle Marker negativ waren. Es ist möglich, dass die 53 positiven Patienten aus der Nicht-PBC-Lebergruppe eine nicht diagnostizierte bzw. sich entwickelnde sich mit PBC überschneidende Erkrankung aufweisen. Präzision und Reproduzierbarkeit Die Intra-Assay-Leistung wurde ermittelt, indem 7 Proben mit der stark positiven Kit-Kontrolle (HPC) und negativen Kontrolle (NC) jeweils 5 mal getestet wurden. Tabelle 2: Intra-assay Performance of QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA HPC NC A B C D E F G Mean Unit 100,6 1,1 61,6 39,8 27,9 13,6 27,5 26,5 23,6 SD 2,2 0,1 2,3 1,0 0,8 0,3 0,9 0,6 0,5 CV % 2,2 6,5 3,7 2,4 3,0 2,4 3,2 2,2 2,2 Die Inter-Assay-Leistung wurde durch Testen im Doppelansatz aus 8 Proben und der stark positiven Kit- Kontrolle (HPC) und negativen Kontrolle (NC) zweimal täglich (einmal morgens und einmal nachmittags) über 3 Tage bewertet. Tabelle 3: Inter-assay Leistungsdaten des QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA HPC NC A B C D E F G H Mean Units 104,8 1,6 67,5 8,4 29,7 35,2 6,3 31,5 29,8 25,2 SD 1,9 0,3 1,7 0,3 1,2 0,6 0,6 1,9 1,3 0,25 CV % 1,8 21,9 2,6 3,6 4,0 1,6 9,2 6,1 4,5 1,0 Referenzen 1. Heathcote EJ. Management of primary biliary cirrhosis. The American Association for the Study of Liver Diseases practice guidelines. Hepatology 2000;31: Kaplan MM, Gershwin ME. Primary biliary cirrhosis. N Engl J Med 2005;353: Feld JJ, Heathcote EJ. Epidemiology of autoimmune liver disease. J Gastroenterol Hepatol 2003;18: Talwalkar JA, Lindor KD. Primary biliary cirrhosis. Lancet 2003;362:53: Jones DE, Watt FE, Metcalf JV, Bassendine MF, James OF. Familial primary biliary cirrhosis reassessed; a geographically-based population study. J Hepatol 1999;30: Kim W.R. et.al Epidemiology and natural history of primary biliary cirrhosis in a US community. Gastroenterology (2000) 119, Kisand KE, Metskula K, Kisand KV, Kivik T, Gershwin ME, Uibo R. The follow-up of asymptomatic persons with antibodies to pyruvate dehydrogenase in adult population samples. J Gastroenterol 2001;36:

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