Kofaktoren. Was kann man sehen, wie kann man Sie detektieren? Literatur

Transkript

1 Kofaktoren Was kann man sehen, wie kann man Sie detektieren? Literatur

2 Cofaktoren Was kann man sehen, wie kann man Sie detektieren? Cofaktoren Organische Cofaktoren Anorganische Cofaktoren

3 Cofaktoren Coenzyme= Organische / Metallorganische Cofaktoren Andere Prostethische Gruppe, wenn fest/kovalent an das Protein gebunden. Apo-protein/-enzym (- p. Gruppe) Holo-protein/-enzym (+ p. Gruppe) Einschub Absorptionsspektroskopie Viele organsiche Cofaktoren besitzen konjugierte Pi Systeme und absorbieren Licht im Sichtbaren Bereich. Die Proben haben eine Farbe! Ist eine Probe gefärbt => Absorptionsspektrum

4 Einschub Absorptionsspektroskopie Schnell, einfach, zuverlässing Beachte: Nur klare, partikelfreie Lösungen messen. Lichtstreuung beinträchtigt Spektren.=> Zentrifugieren, Filtern Lambert- Beer: A= ε c d Konzentrationsbestimmung Lambert-Beer nicht mehr linear bei zu hoher Absorption oder auch Konzentration von Molekülen (z.b. durch Lichtstreuung) Einschub Fluoreszenzspektroskopie Schnell, einfach, zuverlässing Fluoreszenz meist sensitiver als Absorption.

5 Einschub Fluoreszenzspektroskopie Anregungswellenlänge < Emittierte Wellenlänge Messprinzip Absorption Fluoreszenz Einschub Fluoreszenzspektroskopie Anregungsspektum Emittiertes Licht wird beobachtet, Anregungswellenlänge wird abgefahren. Emissionsspektum Es wird nbei einer Wellenlänge angeregt; das emittierte Licht wird als Spektrum aufegezeichnet.

6 Organische Cofaktoren Häm, Chlorophylle Cofaktoren Häm b Ausgeprägte Absorption, großes konjugiertes Doppelbindungssystem Cytochrom c, ε 410 nm = M -1 cm -1 Quantifizierung / Identifizierung über Absorptionsspektren Bei Häm: Spektren oxidiert und reduziert sehr charakteristisch für unterschiedliche Häm-Spezies. Reduktionsmittel z.b. NaDithionit Absorptionsspektren Häm, Chlorophylle Ausgeprägte Absorption, ε M -1 cm -1 Quantifizierung / Identifizierung über Absorptionsspektren Bsp. 9 Hämgruppen/Protein Wavelength [nm]

7 Biopterin Biologisch aktiv Tetrahydrobiopterin Oxidation an Luftsauerstoff zu Dihydropterin Bsp: NO Synthase; Aromtische Aminoäurestoffwechsel, DOPA Synthese Nicht kovalent gebunden Biopterin Biologisch aktiv Tetrahydrobiopterin Oxidation an Luftsauerstoff zu Dihydropterin Bsp: NO Synthase; Aromtische Aminoäurestoffwechsel, DOPA Synthese

8 Biopterin Biologisch aktiv Tetrahydrobiopterin Oxidation an Luftsauerstoff zu Dihydropterin HPLC High Performance Liquid Chromatography

9 HPLC High Performance Liquid Chromatography HPLC: RP = Reversed Phase Historisch: Normal Phase Normalphase bezeichnet polare Sstationäre Phase und unpolare Mobile Phase Reversed Phase bezeichnet unpolare Stationäre Phase und polare/mittelpolare Mobile Phase.

10 Biopterin Oxidation zu Dihydropterin = Biopterin Detektion mittels HPLC und Fluorezenz, Anregung 360 nm, Emission 450 nm. Thiamin -pyrophosphat/-disphosphat TPP/TDP Bindung Mg 2+ abhängig C-Umlagerungen Bsp. Oxidative Decarboxylierung durch Pyruvatdecarboxylase Nicht kovalent gebunden

11 Thiamin -pyrophosphat/-disphosphat Detektion, Quantifizierung: reine Thiamin-species über Umwandlung in Thiochrom und Fluoreszenzdetektion oder Gemische über HPLC mit Fluoreszenzdetektion; Anregung 377 nm, Emission 450 nm. Ref. J Chromatogr. 307: (1984) Flavine

12 Flavine Flavine FMN FAD

13 Flavine (Flavus, lat. gelb) Flavine Meist FMN oder FAD in Proteinen nicht kovalent aber sehr fest gebunden. Sehr wenige Enzyme mit Riboflavin. Flavoprotein sind meist Redoxenzyme. Manche Enzyme binden Flavine kovalent. 1. Nachweis: per Auge und Absorptionsspektrum. Flavin fungiert als Redoxkatalyst. Flavine

14 Flavine: Absorption Flavine: Absorption Absorption Flavin und andere Cofaktoren überlagern sich oft. Hier z.b. 4Fe-4S Cluster und FAD

15 Flavine Flavine / Redoxwechsel z.b. Reaktion mit NADH Chemisch reduziert mit NaDithionit

16 Flavine: Redoxmediatoren Flavine können je nach Proteinumgebung 1 e - und/oder 2 e - Elektrontransfer katalysieren.

17 Flavine Flavine: Analyse Proteinfällung mit z.b. Trichloressigsäure, Abzentrifugieren Überstand abnehmen und neutralisieren mit K 2 HPO 4 oder Na 2 CO 3. Entsalzen Reversed Phase HPLC, Fluoreszenzdetektion

18 Flavine: Analyse FMN vs FAD Fluoreszenz FMN (0.27) hat eien höhere Quantenausbeute als FAD (0.03). Isoalloxazin Fluoreszenz ist gequencht durch Adenin. Flavine: Analyse FMN vs FAD Fluoreszenz

19 Flavine: Analyse FMN vs FAD Fluoreszenz Flavine: Analyse FMN vs FAD Fluoreszenz

20

21 Redox equlibria Redox shuffling: Einfügen von Disulfidbrücken in einem Redoxpuffer, meist Glutathion (GSH) und Glutathiondisulfid (GSSG). Redox equlibria

22 Thiolbestimmung DTNB: Dithionitrobenzoesäure: Messung bei ph Delta Absorption bei 412 nm. ε= 13,600 M -1 cm -1 pro Thiol. Riddles P.W., Blakeley R.L., Zerner B. (1983) Reassessment of Ellman's reagent, Methods Enzymol. 91, Thiolbestimmung DTP: Dithiopyridin: Messung bei ph 4; Delta Absorptionbei 343 nm. ε= 7,600 M -1 cm -1 per Thiol. Pedersen, A. O., and Jacobsen, J. (1980) Reactivity of the thiol group in human and bovine albumin at ph 3-9, as measured by exchange with 2,2'-dithiodipyridine. Eur. J. Biochem. 106,

23 Disulfidbestimmung NTSB: Nitro-sulfonobenzoesäure: Messung bei ph 9.5; Delta Absorptionbei 343 nm. ε= 13,600 M -1 cm -1 pro Dissulfid. Thannhauser TW, Konishi Y, Scheraga HA. (1987) Analysis for disulfide bonds in peptides and proteins. Methods Enzymol. 143,