5. Probenaufbereitung

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1 Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 75 Teil Chromatographische und 5. Probenaufbereitung Wieso ist eine Probeaufarbeitung für viele Proben notwendig? Störende andere Substanzen sollen entfernt werden Abtrennen/Reinigen Analyten sind zu verdünnt in der Probe vorhanden Aufkonzentrieren 5.1 Extraktion aus flüssigen Proben Flüssig-flüssig-Extraktion Ausschütteln mit einem Lösungsmittel, das mit dem Probe-Lösungsmittel nicht mischbar ist Mehrmals mit wenig Volumen ausschütteln ist effizienter als einmal mit viel Volumen (s. auch Kapitel Grundlagen) Zusatz von Salzen erhöht oft die Extraktions-Effizienz (Aussalzeffekt) ph beachten, falls Säure oder Basen extrahiert werden sollen Es gibt automatisierte Systeme für Mehrfachextraktionen Scheidetrichter Festphasen-Extraktion Selektive Adsorption der Analyten auf festem Adsorbens (in einer Kartusche) (verwendet werden aus der HPLC bekannten Phasen wie Kieselgel, Ionentauscher,...) Probelösung wird über die Kartusche laufen gelassen, wo die Analyten zurückgehalten werden Mit wenigen ml eines geeigneten Lösungsmittel werden die Analyten vom Adsorbens runtergewaschen und werden somit gleichzeitig aufkonzentriert Kapazität der Kartusche resp. Durchbruch der Analyten ist zu beachten

2 Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 76 Teil Chromatographische und Konditionieren Probenanreicherung Elution/Aufkonzentrierung der Probe Prinzip einer Festphasen-Extraktion Festphasen-Mikroextraktion (solid phase micro extraction: SPME) Adsorption und Anreicherung von Analyten an einer dünnen Schicht eines festen Adsorbens, das auf einer Quarzfaser aufgebracht ist ( umgestülpte GC-Kolonne ) Anreicherung aus Flüssigkeiten und Gasen möglich Kein Einsatz von Lösungsmitteln Durch speziellen Verschlussmechanismus kann die Probe direkt in einen GC-Injekor eingebracht werden Thermodesorption der Probe von beschichteter Quarzfaser SPME-Extraktion aus Wasserprobe

3 Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 77 Teil Chromatographische und 5.2 Extraktion aus festen Proben Batch-Extraktion: Probe wird möglichst gleichmässig zerkleinert (homogenisiert) Zugabe von Lösungsmittel zur Probe Schütteln der Probe Abdekantieren/Abzentrifugieren/Abfiltrieren Oft geringe Extraktions-Effizienzen Soxhlet-Extraktion Extraktion im heißen Lösungsmittel in einem Soxhlet- Extraktor Stets erneuertes Lösungsmittel Problematisch bei thermisch labilen Analyten Extraktion dauert oft viele Stunden Soxhlet-Extraktor Ultraschall-Extraktion Erleichtert/beschleunigt den Extraktionsvorgang aufgrund der hohen Drücke/Temperaturen, die der Ultraschall verursacht Besser einsetzbar bei thermisch labilen Analyten als Soxhlet. Die sehr kurzzeitigen Temperaturschwankungen haben oft keinen negativen Einfluss auf Proben.

4 Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 78 Teil Chromatographische und Mikrowellen-Extraktion (mirowave assisted extraction: MAE) Probe und Lösungsmittel wird in einem druck- und temperaturstabilen Behälter in den Mikrowellenofen gestellt. Mikrowellenenergie wird auf feste Probe übertragen und erhitzt sie Einsatz von polaren Lösungsmitteln nötig, apolare Lösungsmittel lassen sich von Mikrowellen nicht erhitzen Erwärmung des Lösungsmittels viel schneller (wenige Minuten) als mit herkömmlichen Aufheizmethoden. Probe wird gleichmäßig erhitzt Es kann unter erhöhtem Druck gearbeitet werden Oft dauert die Extraktion viel kürzer als bei einer Soxhlet-Extraktion Überkritische Fluid-Extraktion (supercritical fluid extractiion: SFE) Superkritisches Fluid = wenn eine Substanz so hoch erhitzt wird, daß sie auch durch extrem hohen Druck nicht verflüssigt werden kann, hat sie den sogenannten kritischen Punkt überschritten Fluide haben spezielle Eigenschaften: die Dichte kann durch Temperatur und Druckänderungen erheblich verändert werden; die höheren Diffusionskoeffizienten (im Vergleich zu Flüssigkeiten) haben verbesserte (z.b. kurze) Extraktionseigenschaften zur Folge Anstelle einer Flüssigkeit wird zur Extraktion ein überkritisches Fluid eingesetzt: Typischer Arbeitsbereich: bis C, bis 400bar Es kommen (kaum) organische Lösungsmittel zum Einsatz CO 2 ist des am häufigsten verwendete Fluid, apolare bis mittelpolare Substanzen können extrahiert werden, geringe Zusätze (z.b. Methanol, Säuren, Amine ) können die Löseeigenschaften des CO 2 verändern Nach erfolgter Extraktion wird das Fluid in eine Auffangvorrichtung geleitet und der Druck entspannt, somit entweicht das CO 2 als Gas und die Analyten bleiben zurück. SFE kann auch direkt mit HPLC oder GC gekoppelt werden

5 Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 79 Teil Chromatographische und 5.3 Aufkonzentrieren der Extrakte Rotationsverdampfer (Rotavap) Abdampfen vom Lösungsmittel in einem Wasserbad (meist leicht geheizt) unter Anlegen eines Vakuums Das verdampfte Lösungsmittel kondensiert in einem Kühler und wird aufgefangen Die Probe wird rotiert um Siedeverzüge zu verhindern Ein Rotavap kommt meist zu Einsatz, wenn größere Volumina eingeengt werden sollen Rotavap Verdampfen im Stickstoffstrom Einengen von Proben bis zu wenigen 100µl oder bis zur Trockne Mögliche Verluste der Analyten beachten 6-Kanal-Eindampf Vorrichtung

6 Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 80 Teil Chromatographische und 5.4 Aufreinigung der Extrakte Nach Extraktion und Einengen sind bei vielen Probe noch weitere Aufarbeitungsschritte notwendig, so z.b. abtrennen von chemisch ähnlichen aber nicht interessierenden Substanzen, die eine chromatographische Trennung oder die nachfolgende Detektion stören könnten Säulenchromatographie HPLC-Säulenmaterialien Trennung von Analyten und störenden Komponenten (die Analyten werden auf der Säule (~ cm Durchmesser) zurückgehalten, die störenden Komponenten jedoch eluieren, oder umgekehrt). Festphasen-Extraktion Die oben erwähnte Festphasen-Extraktion kann auch zur Reinigung von störenden Komponenten verwendet werden Es Steht eine grosse Menge an verschiedenen stationären Phasen zur Verfügung Fraktionierung mit HPLC Durch fraktioniertes Auffangen der Analyten können ebenfalls störende Substanzen effektiv abgetrennt werden (präparative HPLC).

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