H. Themeier, J. Hollmann, U. Neese and M.G. Lindhauer. Institut für Sicherheit und Qualität bei Getreide
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- Imke Koch
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1 Ein Beitrag zur Komplettierung der Ballaststoffanalyse: Mikrowelleninduzierter Druckaufschluss resistenter Stärke in der enzymatisch-gravimetrischen Ballaststoffanalyse H. Themeier, J. Hollmann, U. Neese and M.G. Lindhauer Institut für Sicherheit und Qualität bei Getreide
2 Gliederung 1. Resistente Stärke als Teil des Ballaststoffkomplexes 2. Resistente Stärke als analytisches Problem in enzymatischen Bestimmungsmethoden 3. Lösungsansätze zur Komplettierung der Ballaststoffanalytik - Mikrowelleninduzierter Druckaufschluss 4. Ergebnisse und Diskussion
3 1. Der Ballaststoffkomplex
4 Resistente Stärke als Teil des Ballaststoffkomplexes Analytik (in vitro) OH H O H H OH H HO OH H OH Bestimmung Deklarierung Definition Resistente Stärke/ Ballaststoffe Funktionelle Lebensmittel Entwicklung Deutung Physiologische Aspekte (in vivo)
5 Übersicht unterschiedlicher Ballaststoffquellen Pflanzenzellwände Reservekohlenhydrate Cellulose Hemicellulose (Proto)-Pektine Nichtstärkepolysaccharide Galactomannane Fructane Resistente Stärke Pflanzenexsudate/ Schleimstoffe Mikrobielle PS Gummi Arabicum Tragant, Tamarind Nichtstärkepolysaccharide Xanthan, Dextran Synthetische PS/ Cellulosederivate Derivate Stärkederivate Zusatzstoffe Amidpektine Synthetische Oligosacch. Gerüststoff Lignin Nichtkohlenhydrate Assoziierte Wachse, Lipide, Silikate Begleitstoffe
6 Definition von Ballaststoffen I: Physiologisch - biologische Definition TROWELL et. al (1976) Ballaststoffe bestehen aus den Rückständen pflanzlicher Zellwandbestandteile, Polysaccharide, Lignin und assoziierter Substanzen, die vom menschlichen Verdauungssystem (Magen/ Dünndarm) nicht hydrolysiert werden.
7 Definition von Ballaststoffen II: Analytische Definition Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren LFGB 64 (LMBG 35) Methode Unter dem Ballaststoffgehalt [...] wird der nach dem hier beschriebenen Verfahren ermittelte Anteil an organischen Bestandteilen verstanden, der von den eingesetzten Enzymen unter den Bedingungen der Analyse nicht hydrolysiert wird. [...] Es handelt sich dabei vor allem um lösliche und unlösliche Nichtstärke-Polysaccharide (Cellulose, Hemicellulose, Pektinstoffe, Hydrokolloide) sowie Resistente Stärke und Lignin.
8 Das Phänomen Resistente Stärke RS Typ I RS Typ II RS Typ III RS Typ IV Physikalisch nicht zugängliche Stärke (teilvermahlte Körner und Pflanzenbestandteilen) Native, granuläre Stärke mit hoher Kristallinität/ Polymorphtyp B dominierend (Bananen, Erbsen, hochamylotische Maisstärke) Durch Retrogradation (verkleisterter Stärke) generiertes partielles hochkristallines Netzwerk (gekochte Bohnen, Erbsen, altbackenes Brot) Thermisch oder chemisch modifizierte Stärken (z.b. Hydroxypropylstärken))
9 Einflußfaktoren für das Vorliegen Resistenter Stärke innerhalb enzymatischer Abbaureaktionen Amylose/ Amylopektin Kornschädigung Isolierungs- / Verarbeitungsbedingungen RS in AOAC Enzymatische/ Hemmeffekte Kristalliner Strukturtyp Partikelgrößenverteilung Molekularmassenverteilung physikalische Isolierung/ Wandeffekte
10 Einfluß des Amylosegehaltes auf RS Type II (AOAC ) von Erbsenstärken 25 Resistente Stärke R 2 = 0, Amylosegehalt
11 Hochkristalline Bereiche granulärer Stärken oder Rekristallisations- Effekte retrogradierter Stärken sind hauptverantwortlich für RS-Phänomene Morphologische Daten: Erbsenstärke Amylose: % Stärkeschädigung: << 1% Polymorph- Typ: % A-Type % B-Type Median Partikelgröße: μm Verkleisterungsenthalpie: J g -1 SEM / Polarisationsmikroskopische Aufnahmen Erbsenstärke Resistente Stärke: 11,4%
12 Niedrigamylotische Erbsenstärke mit erhöhtem Anteil resistenter Stärke Morphologische Daten: Erbsenstärke Amylose: 20.7 % Stärkeschädigung: << 1 % Polymorph Typ 80 % A-Type 20 % B-Type Median Partikelgröße: 16.1 μm Verkleisterungsenthalpie: 13.4 J g -1 SEM / Polarisationsmikroskopische Aufnahmen Erbsenstärke Resistente Stärke 16,4 %
13 2. Resistente Stärke ein analytisches Problem?
14 Einfluß des Amylosegehaltes auf erfassbare RS-Anteile in der enzymatisch-gravimetrischen TDF-Analyse (AOAC ) von Erbsenstärke 16 TDF [% ] aus RS-Fraktion R 2 = 0, Amylosegehalt
15 Folge des Phänomens Resistente Stärke in analytischen Bestimmungsmethoden unter Verwendung AA/AMG Native Stärke Teil nativer Stärke Teil nativer Stärke Teil Total starch Teil Resistant starch Amylose Amylopectin Lipide < 1.0% Protein < 0.8 % Asche <0.3% von : Weizen Reis Mais Erbse DMSO. Aufschluss Alpha-amylase 95 C/ 6 min Amyloglucosidase 50 C / 30 min Glukosebestimmung abbaubarer Stärkefraktionen Alpha-amylase 95 C / 6 min Amyloglucosidase 50 C / 30 min Glukosebestimmung abbaubarer Stärkefraktionen Alpha-amylase/ Amyloglucosidase 37 C/ 16 h Glukose bestimmung nichtabbaubarer Stärkefraktionenr nach KOH-Aufschluß Alpha-amylase 95 C / 35min Amyloglucosidase 60 C / 30 min Ethanol Fällung Gravimetrische Bestimmung Kommerziell/ isolierte Stärke AOAC AOAC AOAC Enzyme soluble Total starch Resistant starch > > starch > > AOAC Dietary starch?
16 Die Sonderrolle der resistenten Stärke (RS) in der enzymatisch-gravimetrischen TDF-Analytik In allen Probenmaterialien bei denen RS nicht als Minorkomponente vorkommt, läßt sich mit enzymatisch - gravimetrischen Bestimmungsmethoden kein exakter Ballaststoffgehalt quantifizieren, da die RS hierbei nur partiell miterfasst wird. Eine Quantifizierung und Ausweisung der RS durch Separatbestimmungsmethoden ist zwar möglich, aber der enzymatisch-gravimetrisch ermittelte Ballaststoffgehalt läßt sich nicht inkremental korrigieren.
17 Vergleich ermittelter RS-Gehalte (AOAC ) mit Werten der enzymatisch-gravimetrischen TDF-Analyse (AOAC /Standard) von niedrig-amylotischen Stärken Stärkeart Starch Protein MS Amylose RS TDF Mais Mais Weizen 99.6 n.d. n.d Weizen 95.6 (97.8) Reis 99.5 n.d. n.d Erbse 94.5 (97.8) Erbse 92.0 (97.6)
18 Vergleich ermittelter RS-Gehalte (AOAC ) mit Werten der enzymatisch-gravimetrischen TDF-Analyse (AOAC /Standard) von hoch-amylotischen Stärken Stärkeart Stärke Protein MS Amylose RS TDF Erbse Erbse Erbse Mais Mais
19 3. Lösungsansätze
20 Lösungsansätze zur Komplettierung der enzymatisch-gravimetrischen Ballaststoffanalytik Methode AOAC (985.29) Probe RS + TDF? Vollständige Mitterfassung der RS innerhalb der TDF-Methode AOAC Vollständige Eliminierung der RS Innerhalb der TDF-Methode AOAC Änderung der Inkubationsbedingungen entsprechend den physiologischen Bedingungen der RS-Bestimmung AOAC KOH-Aufschluss DMSO-Aufschluss McCleary, Rossiter 2004 Mikrowellenaufschluss?
21 Mikrowelleninduzierter Druckaufschluss Lassen sich enzymresistente hochkristalline Bereiche in Stärken effektiv durch Mikrowellenbestrahlung destrukturieren und somit einem vollständigen enzymatischen Abbau zugänglich machen? Stärkebereiche mit kristallinen Strukturen (Bsp. Polymorphtyp B und V) Mikrowellenstrahlung Vollständiger enzymatischer Abbau kolloidal gelöster amorpher Stärkeanteile
22 Mikrowellengerät MW 3000 Landgraf Laborsysteme Techische Daten: Leistung max. 600 Watt Strahlungsfrequenz 2450 MHz Variable Parameter: Strahlungsleistung Strahlungszeit Aufschlußgefäße Kühler zur Verhinderung unerwünschter Rückreflexionen Mengenverhältnisse
23 Mikrowelleninduzierter Druckaufschluss in der enzymatischen Stärkebestimmung (AOAC ) Lassen sich resistente Stärkefraktionen überhaupt komplett via Mikrowellentechnik aufschließen? Aufgeschlossene hochamylotische Maisstärkefraktion? Bola-Hydrolysier- und Aufschlussgefäß A 240 Fluor-Kunststoff PTFE V = 100 ml Berstscheibe < 20 bar
24 Enzymatische Bestimmungsmethoden unter Einsatz von AA/AMG Native Stärke Teil nativer Stärke Teil nativer Stärke Teil Total starch Teil Resistant starch Amylose Amylopectin Lipide < 1.0% Protein < 0.8 % Asche <0.3% von : Weizen Reis Mais Erbse DMSO. Aufschluss Alpha-amylase 95 C/ 6 min Amyloglucosidase 50 C / 30 min Glukosebestimmung abbaubarer Stärkefraktionen Alpha-amylase 95 C / 6 min Amyloglucosidase 50 C / 30 min Glukosebestimmung abbaubarer Stärkefraktionen Alpha-amylase/ Amyloglucosidase 37 C/ 16 h Glukose bestimmung nichtabbaubarer Stärkefraktionenr nach KOH-Aufschluß Alpha-amylase 95 C / 35min Amyloglucosidase 60 C / 30 min Ethanol Fällung Gravimetrische Bestimmung Kommerziell/ isolierte Stärke AOAC AOAC AOAC Enzyme soluble Total starch Resistant starch > > starch > > AOAC Dietary starch?
25 DMSO-Aufschluß in der enzymatischen Stärkebstimmung (AOAC ) Stärke Amylosegehalt Stärke (Total Starch) AA/AMG ohne DMSO- Aufschluss Mais 7,6 98,6 97,6 Mais 30,0 93,6 99,1 Weizen 30,2 91,2 99,6 Reis 31,1 94,3 99,5 Erbse 32,5 93,2 99,8 Weizen 33,7 94,5 95,6 Erbse 47,6 90,8 94,4 Erbse 62,5 89,5 95,5 Erbse 62,9 87,7 98,1 Mais 66,5 86,9 99,0 Mais 70,6 87,7 97,4 Stärke (Total Starch) AA/AMG mit DMSO-Aufschluss
26 Mikrowelleninduzierter Druckaufschluss in der enzymatischen Stärkebestimmung (AOAC ) Einfluß der Bestrahlungszeit auf die erfassbare Gesamtstärkemenge Stärkegehalt Hochamylose Maisstärke amylogel P = 600 W Bestrahlungszeit [s]
27 Mikrowelleninduzierter Druckaufschluss in der enzymatischen Stärkebestimmung (AOAC ) Maisstärke Maisstärke 39 Maisstärke amylogel Erbsenstärke 16 Erbsenstärke TRISTAR Cellulose Protein 0,38 0,75 0,15 0,43 0,5 - Asche 0,07 0,09 0,79 0,12 0,16 - Lipide 0,14 0,50 0,50 0,49 0,21 - Amylose 26,9 65,8 ~70 62,5 62,5 - Resistente Stärke Gesamtstärke AA/AMG Gesamtstärke DMSO/AA/AMG Gesamtstärke Mikrowelle/AA/AMG 0,6 49,1 47,0 18,0 18,7-91,8 87,2 84,5 89,5 88,1-94,4 95,4 94,7 95,5 95,4-94,6 96,4 98,5 96,3 92,3 0,1
28 Aufschlußgefäße für Mikrowellenversuche zur Modifizierung der TDF-Analyse Bola-Hydrolysier- und Aufschlussgefäß A 240 Fluor-Kunststoff PTFE V = 100 ml Berstscheibe < 20 bar Inneres Reaktionsgefäß für dietdf-analyse L= 116 mm, D = 29/32 V = 70 ml Verkleinerung des Aufschluss- Volumens. Ermöglichung mehrerer Aufschlüsse hintereinander
29 Enzymatisch-gravimetrische TDF- Bestimmung AOAC PROSKY et. al. (1985) PROBENVORBEREITUNG Analysenprobe 1000 mg PRÄZIPITATION 80 Vol.% Ethanol STÄRKE-/PROTEINHYDROLYSE Phosphatpuffer Termamyl ph 6,0 95 C 30 min Protease ph 7,5 60 C 30 min Amyloglu. ph 4,5 60 C 30 min Filtration Rückstand Filtrat Gravimetrisch MS-Gehalt Volumetrisch Protein (Kjeldahl-N 6.25) Gravimetrisch Gesamtballaststoffe
30 Enzymatisch-gravimetrische TDF-Bestimmung AOAC LEE et. al. (1994) PROBENVORBEREITUNG Analysenprobe 1000 mg PRÄZIPITATION 80 Vol.% Ethanol STÄRKE-/PROTEINHYDROLYSE MES/ TRIS -Puffer Termamyl ph 8,3 95 C 30 min Protease ph 8,3 60 C 30 min Amyloglu. ph 4,5 60 C 30 min Filtration Rückstand Filtrat Gravimetrisch MS-Gehalt Volumetrisch Protein (Kjeldahl-N 6.25) Gravimetrisch Gesamtballaststoffe
31 Mikrowelleninduzierter Druckaufschluss in der enzymatisch- gravimetrischen TDF-Analyse (AOAC ) 1 g Probe 40 ml MES-Tris-Puffer ph 8,2 5 min Rühren 5 min Rühren Mikrowellenbestrahlung Ethanolpräzipitation Hydrolyse/ Inkubation Termamyl ph 8,3 95 C 30 min Protease ph 8,3 60 C 30 min Amyloglu. ph 4,5 60 C 30 min 15 min Rühren/Kühlen
32 4. Ergebnisse und Diskussion
33 Einfluß der Bestrahlungszeit auf die als Ballaststoff erfaßbare Menge RS in der enzymatischgravimetrischen TDF-Analyse (AOAC991.43) Ballaststoffgehalt Hochamylose Maisstärke amylogel P = 600 W Bestrahlungszeit [s]
34 Mikrowelleninduzierter Druckaufschluss im Vergleich zum DMSO-Aufschluss in der enzymatisch-gravimetrischen TDF-Analyse (AOAC ) Polysaccharid- Komponente TDF TDF TDF TDF Maisstärke Maisstärke amylogel Standard AOAC DMSO Mikrowelle 480 Watt 2x3 min 0,9 n.d. 0,7 0,5 21,0 4,5 1,5 0,3 Cellulose 99,3 97,3 99,9 100,1 Arabinoxylan 96,9 102,6 96,4 98,9 ß-Glucan 95,4 97,9 96,6 98,8 Pectin 91,6 124,1 78,6 55,5 Mikrowelle 600 Watt 2x3 min
35 Mikrowelleninduzierter Druckaufschluss in der enzymatischgravimetrischen TDF-Analyse (AOAC ) RS-TDF Modell- Mischung 10:1 Maisstärke 03402/ Cellulose Maisstärke 03402/ Arabinoxylan Maisstärke 03402/ ß-Glucan Maisstärke 03402/ Pectin TDF berechnet TDF Standard AOAC TDF Mikrowelle 600 Watt 2x3 min 9,8 10,5 10,9 10,9 9,6 11,9 9,8 10,0 9,5 11,9 9,8 10,3 9,1 9,5 8,1 8,7 TDF Mikrowelle 480 Watt 2x3 min
36 Mikrowelleninduzierter Druckaufschluss in der enzymatisch- Gravimetrischen TDF-Analyse (AOAC ) RS-TDF Modell- Mischung 10:1 TDF berechnet mit RS TDF AOAC Standard TDF berechnet ohne RS TDF AOAC DMSO TDF AOAC Mikrowelle 1 Maisstärke Amylogel/ Cellulose Maisstärke Amylogel/ Arabinoxylan Maisstärke Amylogel/ ß-Glucan Maisstärke Amylogel/ Pectin Cellulose/ Pectin 28,1 27,4 9,9 9,8 10,5 27,9 23,9 9,7 10,7 9,5 27,8 25,2 9,6 10,3 9,7 27,4 25,3 9,2 14,8 9,3 98,6 99,1 98,6 110,8 104,6 1 P = 600 Watt, t = 2x3 min
37 Zusammenfassung RS Typ II läßt sich durch einen Mikrowellenaufschluss vollständig destrukturieren, kolloidal in Lösung bringen und enzymatisch abbauen Bei Vorliegen hochamylotischer Stärken in der enzymatischen Stärkebestimmung (AOAC ) kann der bisher erforderliche DMSO-Aufschluss durch ein Mikrowellenaufschluss ersetzt werden In der enzymatisch-gravimetrischen TDF-Bestimmung (AOAC ) lassen sich resistente Stärkefraktionen (Typ II) ebenfalls durch einen Mikrowellenaufschluss auch bei Vorliegen traditioneller Ballaststoffkomponenten weitgehend eliminieren; Hierdurch können analytisch ermittelte TDF-Werte entsprechend physiologischen Definitionen besser angepasst werden
38 Ausblick Untersuchung von TDF-Fraktionen und Resistenter Stärke in komplexen Lebensmitteln Einfluss von Mikrowellenbestrahlung und DMSO-Aufschluß unter Berücksichtigung von Matrixeffekten Untersuchung zur Pektinstabilität unter Berücksichtigung von Temperatur und Druck Untersuchungen zur Kombination der Methoden AOAC (TDF) und AOAC (RS) zur kompletten Erfassung der RS unter Berücksichtigung von Matrixefekten
39 Aktuelle Codex-Diskussionen Codex-Komitee für Ernährung und diätische Lebensmittel 1. A source element identifying that dietary fibre is an intrinsic component of food groups 2. A chemical element identifying the component to be measured Vorschlag: Dietary fibre consists of intrinsic plant cell wall polysaccharides
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