Die immunsuppressive Wirkung von Tumormetaboliten auf humane T-Zellen

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1 Die immunsuppressive Wirkung von Tumormetaboliten auf humane T-Zellen Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) der Naturwissenschaftlichen Fakultät III - Biologie und Vorklinische Medizin der Universität Regensburg eingereicht von Dipl. Biol. Katrin Singer Regensburg, Juli 2010 Bibliografische Informationen digitalisiert durch

2 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Das Immunsystem Die Rolle des Immunsystems bei der Tumorabwehr Überwachung von maligne entarteten Zellen durch das Immunsystem Tumor-assoziierte Antigène (TAA) und adoptiver T-Zelltransfer Tumor-infiltrierende Lymphozyten (TILs) Immune Escape Mechanismen Regulatorische T-Zellpopulationen Antigenverlust und Produktion immuninhibitorischer Zytokine Tumormetabolismus Methylthioadenosin: ein neuer Immune Escape Mechanismus? Methylthioadenosin Phosphorylase (MTAP)-Defizienz in Tumoren Mögliche Mechanismen der MTA-vermittelten Suppression Der Warburg-Phänotyp in Tumoren Selektionsvorteile einer hohen Glykolyserate Die Regulation der Glykolyse durch HIF Der Einfluss von Laktat auf das Tumorstroma Zielsetzung Material und Methoden Material Medien, Puffer und Lösungen Farbstoffe Chemikalien HLA-A2-bindende Peptide Peptid-MHC-Tetramere Antikörper Beads Oligonukleotide Zellkulturflaschen, -platten, -röhrchen Zytokine Methoden Ermittlung der Zellzahl durch Trypanblau-Ausschlussfarbung Kryokonservierung von Zellen 33

3 2.2.3 Auftauen von Zellen Kultivierung von Zelllinien Beladung der T2 Zellen Dichtegradientenzentrifugation Gegenstromelutriation zur Isolierung von Monozyten Generierung von dendritischen Zellen (DCs) aus Monozyten in vitro Exogene Beladung von DCs Magnetische Separation Durchflusszytometrie Antikörperfärbung pmhc-tetramerfärbung Generierung von antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen Generierung von allogen-spezifischen CD4 + und CD8 + T-Zellen Polyklonale Stimulation von CD4 + und CD8 + T-Zellen I Cr-Zytotoxizitätstest CFSE-Färbung Isolierung von Gesamt-RNA Reverse Transkription Quantitative Polymerase-Kettenreaktion Bestimmung des Glukose-Flux mit [l,2-13 C 2 ]Glukose Analyse von MTA und Laktat in Zellüberständen Sauerstoffkonzentrationsmessungen Aufarbeitung von Tumor - und Normalgewebeproben von Patienten mit RCC Immunhistochemische Färbungen an Tissuemicroarrays Analyse der immunhistochemischen Färbungen an TMAs Detektion von intrazellulärem camp Statistische Auswertungen Ergebnisse Suppression humaner T-Zellen durch Milchsäure Einfluss von Milchsäure auf den Energiehaushalt der CTLs Sensitivität ruhender und aktivierter T-Zellen gegenüber Milchsäure Einfluss von Milchsäure auf verschiedene T-Zellpopulationen Einfluss von 5'-Deoxy-5'-Methylthioadenosin (MTA) auf humane T-Zellen Effekte von MTA auf humane zytotoxische CD8 + T-Zellen Hemmung der Aktivierung zytotoxischer CD8* T-Zellen durch MTA MTA-vermittelte Suppression der antigen-spezifischen Zytokinsekretion in CTLs 57

4 MTA-vermittelte Suppression der Zytotoxizität von antigen-spezifischen CD8 + CTLs Einfluss von MTA auf die Viabilität und Proliferation von CD8 + T-Zellen Apoptoseinduktion in CTLs durch MTA Inhibition der Proliferation von CTLs durch MTA Suppression der Proliferation allogen oder polyklonal stimulierter CD8+ T-Zellen Die MTA-induzierte Suppression von T-Zellen ist reversibel Das in vitro Priming antigen-spezifischer CD8 + T-Zellen wird durch MTA inhibiert Effekte von MTA auf dendritische Zellen Mechanismus der MTA-vermittelten Immunsuppression von humanen T-Zellen A Wirkung von Adenosin, NECA und Forskolin auf die Proliferation von CD8 + T-Zellen Einfluss von MTA auf die intrazelluläre camp-konzentration in CD8 + T-Zellen Einfluss von Dipyridamol auf die MTA-induzierte T-Zellsuppression Einfluss des Adenosindeaminase-Inhibitions EHNA auf die MTA-vermittelte T-Zellsuppression Assoziation zwischen Immunzellinfiltration im Tumor und Glykolyse bzw. MTA-Stoffwechsel beim Nierenzellkarzinom MTA-Metabolismus im RCC MTAP-Expression und MTA in RCC-Zelllinien MTAP Expression im RCC auf Proteinebene LDHA, GLUT-1 und Laktat im RCC LDHA und Laktat in RCC-Zelllinien mrna-expression von Glykolyse-assoziierten Genen in primärem RCC Immunhistochemische Analysen zur Expression von GLUT-1 und LDH5 im primären RCC Immunzellinfiltration im RCC Korrelation zwischen Immunzellinfiltration und dem MTA - bzw. Glukosestoffwechsel Zusammenhang zwischen MTAP-Expression und Immunzellinfiltration im primären RCC Assoziation zwischen GLUT-1 bzw. LDH5 Expression und Immunzellinfiltration im RCC Diskussion Suppression humaner T-Zellen durch Milchsäure Einfluss von 5'-Deoxy-5'-Methylthioadenosin (MTA) auf humane T-Zellen Effekte von MTA auf humane CD8 + T-Zellen 89

5 4.2.2 Mechanismus der MTA-vermittelten Immunsuppression Zusammenhang zwischen Immunzellinfiltration und Glykolyse im Nierenzellkarzinom Die Rolle des MTA-Metabolismus im RCC Zusammenfassung und Ausblick Literaturverzeichnis Anhang Abkürzungsliste Veröffentlichungen Danksagung 129